Summary
Vi beskriver en trinnvis prosedyre for å skape press overbelastning og venstre ventrikkel hypertrofi i Wistar rotter ved innsnevring av den stigende aorta ved hjelp av en liten metallklips. Denne modellen er mye brukt for å studere ombygging endringer i løpet av hjertestans hypertrofi og for å identifisere og evaluere strategier for regresjon av slike endringer.
Abstract
Stigende aorta innsnevring er den mest vanlige og vellykkede kirurgisk modell for å skape trykk overbelastning induserte hjerte-hypertrofi og hjertesvikt. Her beskriver vi en detaljert kirurgisk prosedyre for å skape press overbelastning og hjertestans hypertrofi i rotter ved innsnevring av den stigende aorta ved hjelp av en liten metallklips. Etter anestesi, er luftrøret intubert ved å sette inn en kanyle gjennom en halvveis snitt gjort mellom to bruskringer av luftrøret. Da en hud snitt er gjort på nivået av den andre interkostalrom på den venstre brystvegg og muskellagene er fjernet for å lokalisere den stigende delen av aorta. Den stigende aorta er innsnevret til 50-60% av sin opprinnelige diameter ved anvendelse av en liten størrelse titan klips. Etter aorta innsnevring, er det andre og tredje ribbe tilnærmes med prolene sting. Den trakealkanyle fjernes en gang spontan pusting ble reetablert. Dyret får lov til å gjenopprette on varmeputen ved å gradvis senke anestesi. Intensiteten av press overbelastning opprettet av innsnevring av den stigende aorta bestemmes ved å registrere trykkgradienten ved hjelp av trans-thorax todimensjonal Doppler-ekkokardiografi. Totalt denne protokollen er nyttig å studere remodeling hendelser og kontraktile egenskaper hjertet under den gradvis innsettende og progresjon fra kompensert hjertestans hypertrofi til hjertesvikt scenen.
Introduction
Små dyremodeller er de mest foretrukne verktøy for studium av kronisk endringer i utviklingen av hjerte-hypertrofi og progresjon til hjertesvikt. Hjertesvikt modeller av kirurgiske metoder ble opprinnelig utviklet i rotter som disse dyrene er mest egnet for åpen bryst kirurgiske prosedyrer, ekkokardiografi og evaluering av hemodynamiske parametre. De gir også tilstrekkelige post mortem prøver for vev, cellulært og molekylært nivå studier en. Innsnevring av oppstigende aorta er en av de mest vanlige og vellykkede kirurgiske modeller for å skape trykk overbelastning hjertesvikt 2, 3. Denne modellen er godt egnet til å studere de cellulære og sub cellular remodeling hendelser og kontraktile egenskaper hjertet under overgangen fra hypertrofi til hjertesvikt fire.
En stor fordel ved denne modellen er den gradvise angrep av trykkoverskudd på hjertet 5, </ Sup> 6. Denne modellen er av klinisk betydning på grunn av den langsomme, men jevn progresjon fra kompensert kardial hypertrofi til dekompensert fase og til slutt til hjertesvikt stadium. Varigheten for progresjon av hjertestans hypertrofi til hjertesvikt og tilhørende fysiologiske endringene er hovedsakelig påvirket av graden av stenose produsert syv. Stigende aorta innsnevring kan utføres på to måter, enten ved hjelp av suturer, eller ved påføring av metalliske klemmene 8, 9. Den største fordelen med å bruke en metallisk klipp for aorta innsnevring er at de kirurgiske prosedyrer er mindre komplisert. I denne metoden må man finne supra klaffe stigende aorta og sett klippet rundt aorta for å oppnå ønsket nivå av sammensnøring. En brystet retractor er ikke nødvendig i denne prosedyren. Aorta banding ved suturering krever flere kirurgiske manipulasjoner for å plassere målerviseren ved stigende aorta og sy rundt det åfrembringe den ønskede grad av aorta innsnevring. Den sistnevnte teknikk er mer tidskrevende sammenlignet med bruk av metallklemmer for aorta-innsnevring. Fremgangsmåten som beskrives i dette video demonstrerer den kirurgiske prosedyre for oppadstigende aorta innsnevring i rotter som tillater etablering av trykkbelastet venstre ventrikkel hypertrofi modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøk ble utført etter å ha fått godkjenning fra Institutional Animal Ethics Committee. Wistar-rotter ble plassert under en 12 timers mørk til lys syklus, konstant romtemperatur (24 ± 2 ° C) med mat og vann ad libitum (i henhold til retningslinjene CPCSEA).
1) Pre-operative omsorg og anestesi
- Hold rat (ca. 200 g kroppsvekt) i henhold til antibiotikum paraply 24 timer før operasjonen ved å administrere amoxicillin oralt (dose: 500 mg / l vann).
- Steriliser alle kirurgiske verktøy (for eksempel saks, pinsett, klipp applikator, sutur nåler, og nål holder) ved autoklavering ved 121 ° C i 15 min.
- Bruk en varmepute for å opprettholde dyrets kroppstemperatur rundt 37 ° C for å unngå en rask reduksjon av hjertefrekvensen.
- Vær forsiktig for å unngå dehydrering av dyret før og under operasjonen.
- Anesthetize rotte i en induksjonskammeret med 3% isofluran blandet med0,5-1,0 l / min 100% oksygen; opprettholde anestesi med 1,5% isofluran.
- Sjekk pedalen refleks for å bekrefte vellykket anestesi.
2) Utarbeidelse av operasjonsstedet
- Hold rat på toppen av en temperaturstyrt varmeputen i liggende stilling.
- Plasser en gummistrikk over rottes fortennene å holde dyret på plass og samtidig opprettholde anestesi med en nese kjegle.
- Fjern pels fra halsen og venstre bryst regionen av rotte (fortrinnsvis ved hjelp av en elektrisk barbermaskin).
- Desinfisere operasjonsstedet med povidonjodid løsning og deretter med 70% etylalkohol.
- Bruk av en steril drape å eksponere bare det kirurgiske området under det operative inngrepet.
Merk: Som et ekstra alternativ for dyr omsorg, kan 0,25% Bupivicaine ID (2,5 mg / kg) innarbeides før incising på hvert innsnitt området for lokalbedøvelse / analgesi.
3) intubasjonsforhold i Rat
- Lag et lite innsnitt i huden parallelt med luftrøret ved hjelp av en steril kirurgisk blad og forsiktig skille det underliggende vev for å eksponere trakea.
- Påfør et slips av 4-0 silke sutur tråden under luftrøret og forsiktig heve tie oppover.
- Lag en halvveis snitt mellom to bruskringer og sett trakealkanyle inn i luftrøret av rotte.
- Koble trakeal kanyle til en gnager ventilator for å opprettholde en luftveiene hastighet på 50 åndedrag / min, tidevolum på 1,70 ml og inspirasjon tid på 0,60 sekund (for rotte med 200 g kroppsvekt).
4) Innsnevring av aorta ascendens
- Etter avføling av posisjonen av ribbene med fingrene, gjør et snitt i huden på ca 2 cm til venstre brystvegg mellom de andre og tredje ribbe.
- Separer interkostalrom muskler lag på lag og gjøre et snitt ca 1,5 cm lang mellom de andre og tredje ribbe. (Det bør være tan for å unngå skade på lungene samtidig som snittet mellom ribbeina)
- Trekk ribbeina og finn stigende delen av aorta.
- Plasser en liten størrelse titan klips rundt den stigende aorta ved hjelp av en applikator, hvorved constricting aorta til 50-60% av den opprinnelige diameter.
- Etter aorta innsnevring, nokså godt med andre og tredje ribbe med 3,0 prolen i en avbrutt sutur mønster. Samtidig pause ventilator i ca 2-4 sekunder for å re-blåse lungene.
- Appose muskellagene med 3,0 prolene sting og hud med 4,0 silke sting i en avbrutt sutur mønster. Syntetiske ikke-absorberbare suturer kan brukes i stedet for silke for suturering på huden.
- Fjern trakealkanyle fra rotte en gang spontan pusting er reetablert.
- Lukk tracheal åpningen med 3,0 prolene sting og hudlaget med 4,0 silke sting.
- Tillater dyret å komme i tHan oppvarming pad ved å gradvis senke anestesi og ventilator assistert respirasjon.
- I alders matchet humbug kontroll dyr, utføre trakeotomi og Thoracotomi uten innsnevring av stigende aorta.
5) Postoperativ Care
- Desinfiser kirurgisk område med povidonjodid løsning.
- Som post-operativ analgesi, injiserer tramadol intra-peritoneally (10 mg / kg kroppsvekt / dag) i 1 uke.
- Injisere sterilt fysiologisk saltvann intra-peritoneally om tegn på dehydrering vises etter operasjonen (ca. 1 ml).
- Administrer amoxycillin muntlig, blandet med drikkevann, for syv dager (dose: 500 mg / l vann).
- Fjern eventuelle gjenværende silke suturer fra huden innlegg ti dager etter operasjonen i henhold innånding anestesi.
6) Bekreftelse av vellykket Innsnevring av aorta ascendens
- Utfør et trans-thorax todimensjonal Doppler-ekkokardiografi å bestemme intensivtetet i trykket overbelastning produsert av innsnevring av stigende aorta.
- Anesthetize rottene en uke etter kirurgi, som beskrevet tidligere (trinn 1.5)
- Plasser ultralydtransduser på supra sternal stilling for å ta opp den trykkgradient gjennom den innsnevrede delen av aorta ascendens.
Merk: Rotter med en trykkgradient på ca 60 mm Hg ved aorta innsnevret området vil utvikle alvorlig hjerte hypertrofi etter ca 8-10 uker etter operasjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I våre forsøk har vi mulighet til å oppnå mer enn 80% overlevelse. Effektiviteten av aorta innsnevring ble bekreftet ved å utføre Doppler ekkokardiografi. Rotter (n = 6) med et trykk-gradient på ca 60 mm Hg ved aorta innsnevret område ble observert i 8 uker, og ofret for å analysere for utvikling av hjertehypertrofi (figur 1). Etter åtte uker etter operasjonen ekkokardiografisk evaluering viste en signifikant økning i venstre ventrikkel parametere som blant ventrikkelseptumdefekt tykkelse, venstre ventrikkel posterior veggtykkelse og reduksjon i venstre ventrikkel indre diameter på diastolisk stat, i dyr som gjennomgikk aorta innsnevring, sammenlignet med humbug operert kontroller (tabell 1, figur 2). En betydelig økning i hjertevekt / kroppsvektforhold og venstre ventrikkel vekt / kroppsvektforhold ble observert hos rotter med aorta innsnevring (Tabell 2, Figur 3). Disse dataantyder at åtte uker etter kirurgi rotter med aortisk innsnevring utvikle et betydelig nivå av hjerte-hypertrofi, sammenlignet med sham drives kontroller.
Figur 1. Echocardiogram hos rotter som representerer trykkgradient gjennom den oppadstigende aorta. Aa) Representanten ekkokardiogram fra en rotte med innsnevring av aorta og ha en trykkgradient av 63,0 mm Hg og Ab representerer fargedoppler ekko av området over aorta der trykkgradient ble målt. Ba) Representanten ekkokardiogram fra en humbug operert kontroll rat med en trykkgradient på 2,86 mm Hg og Bb representerer fargedoppler ekko fra området over aorta hvor trykkgradienten var måle d.. Denne økningen i trykkgradient indikerer vellykket banding av aorta i rotter som gjennomgikk delvis stigende aorta innsnevring.
. Figur 2 M-modus echocardiogram av venstre hjertekammer hos rotter med aortisk innsnevring (A) og kontrollrotter (B) som viser venstre ventrikulære dimensjoner på tidspunktet for avlivelse 8 uker etter operasjonen IVST = inter ventrikulær septal tykkelse.; LVPWT = venstre ventrikkel posterior veggtykkelse; LVID = venstre ventrikkel indre diameter i diastolen. Hos rotter med aorta innsnevring en betydelig økning i inter ventrikkelseptumdefekt tykkelse, kan venstre ventrikkel posterior veggtykkelse og reduksjon i venstre ventrikkel indre diameter på diastolisk tilstand observeres.
Figur 3. Bilder av hele hjerter en rotte som gjennomgikk aorta innsnevring (A), og en simulert opererte kontrollrotte (B) 8 uker etter kirurgi. Rotte med aortisk innsnevring har signifikant kardial hypertrofi, sammenlignet med sham drives kontroll.
Tabell 1 M-mode ekkokardiografiske parametre for hjertets venstre hjertekammer på tidspunktet for offer, åtte uker etter operasjonen IVST = inter ventrikkelseptumdefekt tykkelse.;. LVPWT = venstre ventrikkel posterior veggtykkelse; LVID = venstre ventrikkel indre diameter på diastolisk stat; AAC = stigende aorta innsnevring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er flere kirurgiske modeller for induksjon av trykk overbelastning samt hjerte-hypertrofi og hjertesvikt. I små dyr, Lorell og kolleger utviklet modellen vi har beskrevet her, og de rapporterte forekomsten av kompensert hjerte hypertrofi 8 uker etter aorta banding fem. Hjerte endringer gradvis utvikle seg til en dekompensert staten og deretter føre til hjertesvikt. Den største fordelen med denne modellen er den gradvis innsettende økning i venstre ventrikkel trykket og dermed lik kliniske situasjoner i kronisk hypertensjon. Det er også en egnet dyremodell for å studere venstre hjertesvikt forbundet pulmonal hypertensjon 10..
Andre dyremodeller for press overbelastning hjertesvikt, for eksempel Dahl sensitive rotter, spontant hypertensive rotter og rotter med innsnevring av mage aorta, også utvikle kronisk press overbelastning. De imidlertid ta lengre tidsperioder for progresjon from hjertestans hypertrofi til hjertesvikt. Vedlikeholdskostnadene av eksperimentelle rotter er derfor også høyere en. deAlmeida og kolleger ansatt tverrgående aortic innsnevring for å indusere venstre ventrikkel hypertrofi i mus 11. Teknikken innebærer median sternotomi og tilbaketrekking av sternum og dermed er mer utfordrende.
Sikre en rask endring av anestesi fra nese kjegle til intubasjonsforhold før Thoracotomi og fra intubasjonsforhold til nese kjegle etter de operative prosedyrer. En alternativ metode for intubasjonsforhold i rotter er ved hjelp av polyetylen tube for endotrakeal intubasjon stedet for trakeotomi. Imidlertid krever denne teknikken tilstrekkelig dyktighet. Forsiktighet bør utvises for å unngå skade på lungene samtidig som snittet mellom ribbeina. Bruk av titan klipp tilstrekkelige til å produsere kritisk aorta innsnevring for venstre ventrikkel stress, men ikke alvorlig nok til å produsere akutt venstre ventrikkel svikt og pulmonary ødem. Bruk av prolen suturer for tilnærming av ribbene er kritisk for en vellykket gjenoppretting av dyret. Under tilnærming av ribbeina, pause ventilator i ca 2-4 sekunder for å re-blåse lungene.
Vi hadde bare 20% operative dødelighet hos dyrene, og det var ingen postoperative komplikasjoner. Teknikken vi beskrevet her er dermed en effektiv og egnet verktøy for å studere kroniske patofysiologiske endringer i hjerte-hypertrofi og progressiv hjertesvikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne erkjenner Institutt for bioteknologi, regjeringen i India for økonomisk støtte av dette prosjektet. Ajith Kumar GS ble støttet med seniorstipend fra Council of Scientific and Industrial Research, Government of India og Binil Raj med seniorstipend fra indiske rådet for medisinsk forskning, Government of India.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wistar rats | Maintained at ARF, RGCB | ||
| Inhalation anaesthesia systems | VetEquip | AB19276 | |
| Rodent ventilator | CWE Inc | SAR- 830/AP | |
| Rat tracheal cannula | CWE Inc | 13-21032 | |
| Ultrasound system | Philips | HD7 | |
| Ultrasound transducer | Philips | S 12 | |
| Titanium clip (small) | Horizon | 1204 | |
| Clip applicator | Weck | 137081 | |
| Electric shaver | Vinverth | VBT0817 | |
| BP blade (size:11) | Surgeon | REF10111 | Preparation of surgical site |
| Tramadol | Orchid health care | OCH043 | |
| Amoxycillin Hydrochloride | Ranbaxy | ||
| Isoflurane | Piramal health care | A23M10A | |
| Syringes | BD | 2015-09 | |
| 4-0 braided silk | Diamond | ||
| 3-0 prolene | Johnson&Johnson | NW018 | |
| Surgical tape | Romsons | SH 6301 | |
| Povidone iodine | Win Medicare | ||
| Temp. controlled heating pad | Flamingo | HC1003 |
References
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2, 138-144 (2009).
- Weinberg, E. O., et al. Angiotensin-converting enzyme inhibition prolongs survival and modifies the transition to heart failure in rats with pressure overload hypertrophy due to ascending aortic stenosis. Circulation. 90, 1410-1422 (1994).
- Schunkert, H., et al. Increased rat cardiac angiotensin converting enzyme activity and mRNA expression in pressure overload left ventricular hypertrophy. Effects on coronary resistance, contractility, and relaxation. J Clin Invest. 86, 1913-1920 (1990).
- Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovasc Res. 39, 60-76 (1998).
- Litwin, S. E., et al. Serial echocardiographic-Doppler assessment of left ventricular geometry and function in rats with pressure-overload hypertrophy. Chronic angiotensin-converting enzyme inhibition attenuates the transition to heart failure. Circulation. 91, 2642-2654 (1995).
- Miyamoto, M. I., et al. Adenoviral gene transfer of SERCA2a improves left-ventricular function in aortic-banded rats in transition to heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 793-798 (2000).
- Kagaya, Y., Hajjar, R. J., Gwathmey, J. K., Barry, W. H., Lorell, B. H. Long-term angiotensin-converting enzyme inhibition with fosinopril improves depressed responsiveness to Ca2+ in myocytes from aortic-banded rats. Circulation. 94, 2915-2922 (1996).
- Del Monte, F., Butler, K., Boecker, W., Gwathmey, J. K., Hajjar, R. J. Novel technique of aortic banding followed by gene transfer during hypertrophy and heart failure. Physiol Genomics. 9, 49-56 (2002).
- Turcani, M., Rupp, H. Heart failure development in rats with ascending aortic constriction and angiotensin-converting enzyme inhibition. Br J Pharmacol. 130, 1671-1677 (2000).
- Kerem, A., et al. Lung endothelial dysfunction in congestive heart failure: role of impaired Ca2+ signaling and cytoskeletal reorganization. Circ Res. 106, 1103-1116 (2010).
- Almeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. Transverse aortic constriction in mice. J Vis Exp. (38), (2010).
