Summary
Nós descrevemos um procedimento passo a passo para a criação de sobrecarga de pressão e hipertrofia ventricular esquerda em ratos Wistar pela constrição da aorta ascendente com clipe metálico pequeno. Este modelo é amplamente utilizado para o estudo de alterações de remodelação durante a hipertrofia cardíaca e para identificar e avaliar estratégias para a regressão de tais mudanças.
Abstract
Crescente constrição aórtica é o modelo cirúrgico mais comum e bem sucedida para a criação de sobrecarga de pressão induzida hipertrofia cardíaca e insuficiência cardíaca. Aqui, descrevemos um procedimento cirúrgico detalhado para a criação de sobrecarga de pressão e hipertrofia cardíaca em ratos por constrição da aorta ascendente com clipe metálico pequeno. Após a anestesia, a traquéia está entubado, inserindo uma cânula através de uma incisão no meio do caminho entre dois anéis cartilaginosos da traquéia. Em seguida, uma incisão na pele é feita ao nível do segundo espaço intercostal na parede torácica esquerda e as camadas musculares estão habilitados para localizar a porção ascendente da aorta. A aorta ascendente é restrito a 50-60% do seu diâmetro original através da aplicação de um pequeno clip de titânio porte. Após a constrição da aorta, os segundo e terceiro costelas são aproximadas com prolene. A cânula da traqueia é removido uma vez que a respiração espontânea foi restabelecida. O animal é deixado recuperar oN a almofada de aquecimento por redução gradual da anestesia. A intensidade da sobrecarga de pressão criada pela constrição da aorta ascendente é determinado com base no gradiente de pressão usando transtorácica bidimensional com Doppler-ecocardiografia. Em geral, este protocolo é útil para estudar os eventos de remodelação e propriedades contráteis do coração durante o início gradual e progressão da hipertrofia cardíaca compensada para coração fase fracasso.
Introduction
Modelos animais pequenos são as ferramentas mais preferidos para o estudo de alterações crónicas no desenvolvimento da hipertrofia cardíaca e sua progressão para insuficiência cardíaca. Modelos de insuficiência cardíaca por métodos cirúrgicos foram originalmente desenvolvidos em ratos como esses animais são mais adequados para procedimentos cirúrgicos de peito aberto, ecocardiograma e avaliação dos parâmetros hemodinâmicos. Eles também fornecem amostras post mortem adequadas para o tecido, celular e estudos de nível molecular 1. Constrição da aorta ascendente é um dos modelos cirúrgicos mais comuns e bem sucedidos para a criação de insuficiência cardíaca sobrecarga de pressão 2, 3. Este modelo é bem adequado para estudar os eventos de remodelação celular celulares e sub e propriedades contráteis do coração durante a transição de hipertrofia para insuficiência cardíaca 4.
Uma das principais vantagens deste modelo é o aparecimento gradual de sobrecarga de pressão sobre o coração 5, </ Sup> 6. Este modelo é clinicamente relevante por causa de sua progressão lenta, mas constante de hipertrofia cardíaca compensada para a fase descompensada e, finalmente, para a fase de insuficiência cardíaca. A duração para a progressão da hipertrofia cardíaca para a insuficiência cardíaca e as alterações fisiológicas associadas são influenciados, principalmente, pelo grau de estenose produzido 7. Constrição da aorta ascendente pode ser realizada de duas maneiras, usando suturas ou pela aplicação de clipes metálicos 8, 9. A principal vantagem da utilização de um grampo metálico para a constrição da aorta é que os procedimentos cirúrgicos são menos complicados. Neste método, é preciso localizar a aorta ascendente supra valvular e insira o clipe ao redor da aorta para obter o nível desejado de constrição. Um afastador peito não é necessário este procedimento. A EAo por sutura requer manipulações mais cirúrgicos para colocar a agulha calibre ao lado da aorta ascendente e sutura em torno dele paraproduzir o nível desejado de constrição da aorta. A última técnica é mais demorada em comparação com a utilização de grampos metálicos para a constrição da aorta. O método descrito neste vídeo demonstra o procedimento cirúrgico para a constrição da aorta ascendente em ratos que permite a criação de pressão modelo de hipertrofia ventricular esquerda sobrecarregado.
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Protocol
Experimentos em animais foram realizados após a obtenção da aprovação do Comitê de Ética animal Institucional. Ratos Wistar foram alojados sob um escuro de 12 horas para ciclo de luz, temperatura ambiente constante (24 ± 2 ° C) com comida e água ad libitum (conforme as orientações CPCSEA).
1) Cuidados pré-operatório e anestesia
- Mantenha rato (cerca de 200 g de peso corporal) sob antibiótico guarda-chuva de 24 horas antes da cirurgia, através da administração de amoxicilina por via oral (dose: 500 mg / L de água).
- Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos (como tesouras, pinças, clipe aplicador, agulhas de sutura, e porta-agulha) em autoclave a 121 ° C por 15 min.
- Use uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo do animal em cerca de 37 ° C para evitar uma rápida queda da frequência cardíaca.
- Tome cuidado para evitar a desidratação do animal antes e durante a cirurgia.
- Anestesiar o rato numa câmara de indução com 3% de isoflurano misturado com0,5-1,0 L / min 100% de oxigênio; manter a anestesia com 1,5% de isoflurano.
- Verifique o reflexo pedal para confirmar anestesia bem sucedida.
2) Preparação do sítio cirúrgico
- Manter o rato no topo de uma almofada de aquecimento de temperatura controlada, na posição supina.
- Posicione uma faixa de borracha sobre os dentes da frente do rato para manter o animal na posição, mantendo a anestesia com um cone de nariz.
- Retire a pele do decote e deixou região peito do rato (de preferência usando um barbeador elétrico).
- Desinfectar local cirúrgico com uma solução de povidona-iodo e, em seguida, com álcool etílico a 70%.
- Use um campo estéril para expor somente o sítio cirúrgico durante o procedimento cirúrgico.
Nota: Como uma opção adicional para o cuidado com os animais, 0,25% bupivicaine ID (2,5 mg / kg) podem ser incorporados antes da incisão em cada local da incisão para anestesia local / analgesia.
3) Intubação Traqueal em Rat
- Fazer uma pequena incisão na pele paralela à traqueia usando uma lâmina de bisturi estéril e separar cuidadosamente o tecido subjacente de modo a expor a traqueia.
- Aplicar um empate de 4-0 fio de seda por baixo da traquéia e levantar delicadamente o laço para cima.
- Fazer uma maneira incisão meio entre dois anéis de cartilagem e inserir a cânula traqueal na traqueia do rato.
- Ligue a cânula traqueal a um ventilador de roedores para manter uma taxa respiratória de 50 ciclos / min, volume corrente de 1,70 ml e hora inspiração de 0,60 seg (para rato com 200 g de peso corporal).
4) A constrição da aorta ascendente
- Depois de detectar a posição das nervuras com os dedos, fazer uma incisão da pele de cerca de 2 cm em relação à parede torácica esquerda entre as segunda e terceira costelas.
- Separa-se a camada de musculatura intercostal por camada e fazer uma incisão de cerca de 1,5 cm de comprimento entre as segunda e terceira costelas. (Cuidado deve ser tomadan para evitar qualquer prejuízo para os pulmões ao fazer incisão entre as costelas)
- Recolha as costelas e localizar a parte ascendente da aorta.
- Coloque um pequeno grampo de titânio de tamanho em torno da aorta ascendente, com a ajuda de um aplicador, em que a constrição da aorta para 50-60% do diâmetro original.
- Após a constrição da aorta, aproximar as segundas e terceiras nervuras com 3,0 prolene num padrão de sutura interrompida. Ao mesmo tempo, interromper o ventilador para cerca de 2-4 segundos, a fim de re-inflar os pulmões.
- Appose as camadas musculares com prolene 3.0 e pele com 4,0 suturas de seda em um padrão de sutura interrompida. Suturas absorvíveis sintéticos não pode ser usado em vez de seda para sutura da pele.
- Remova a cânula traqueal do rato respiração espontânea é uma vez restabelecida.
- Feche a abertura traqueal com 3,0 prolene e da camada da pele com fio de seda 4.0.
- Permitir que o animal se recuperar em tele aquecimento pad por redução gradual da anestesia e ventilador respiração assistida.
- Nos animais do grupo controle pareados por idade, realizar traqueostomia e toracotomia sem constrição da aorta ascendente.
5) Cuidados pós-operatórios
- Desinfetar área cirúrgica com solução de iodo-povidona.
- Como analgesia pós-operatória, injectar tramadol intraperitonealmente (10 mg / kg de peso corporal / dia) durante 1 semana.
- Injetar estéril salina normal intra-peritoneal, se os sinais de desidratação aparecer após a cirurgia (cerca de 1 ml).
- Administrar por via oral de amoxicilina, misturado com a água de beber, durante sete dias (dosagem: 500 mg / L de água).
- Remova qualquer fio de seda restantes da pele pós 10 dias de cirurgia sob anestesia inalatória.
6) A confirmação da constrição de sucesso da aorta ascendente
- Realize uma trans-torácica bidimensional com Doppler-ecocardiografia para determinar a intensidade da sobrecarga de pressão produzida pela constrição da aorta ascendente.
- Anestesiar os ratos uma semana após a cirurgia, como descrito anteriormente (passo 1.5)
- Coloque o transdutor de ultra-som na posição esternal supra para gravar o gradiente de pressão através da parte estreitada da aorta ascendente.
Nota: Os ratos com um gradiente de pressão de cerca de 60 mm de Hg no local de constrição aórtica irá desenvolver hipertrofia cardíaca grave por cerca de 8-10 semanas após a cirurgia.
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Representative Results
Nas nossas experiências que são capazes de atingir taxas de sobrevivência de mais de 80%. A eficácia da constrição aórtica foi confirmada pela realização de ecocardiograma Doppler. Os ratos (n = 6) com um gradiente de pressão de cerca de 60 mm de Hg no local da constrição da aorta foram observados durante 8 semanas e sacrificaram-se para análise do desenvolvimento de hipertrofia cardíaca (Figura 1). Após 8 semanas de avaliação ecocardiográfica pós-operatória revelou um aumento significativo nos parâmetros do ventrículo esquerdo, como espessura do septo ventricular inter, espessura da parede posterior do ventrículo esquerdo e diminuição do diâmetro interno do ventrículo esquerdo em estado diastólica, em animais que foram submetidos a constrição da aorta, em comparação com sham operado controles (Tabela 1, Figura 2). Observou-se aumento significativo no coração relações de peso de peso / corpo e relações de peso de peso / corpo do ventrículo esquerdo em ratos com constrição aórtica (Tabela 2, Figura 3). Estes dadossugerem que os ratos oito semanas após a cirurgia, com constrição aórtica desenvolver um nível significativo de hipertrofia cardíaca, em comparação com sham operado controles.
Figura 1. Ecocardiograma em ratos que representam o gradiente de pressão através da aorta ascendente. Aa) O ecocardiograma representante de um rato com a constrição de aorta e com um gradiente de pressão de 63,0 milímetros de Hg e Ab representa eco Doppler colorido do local através da aorta onde gradiente de pressão foi medido. Ba) O ecocardiograma representante de uma farsa operado controle rato ter um gradiente de pressão de 2,86 mm de Hg e Bb representa eco Doppler colorido do local através da aorta, onde o gradiente de pressão foi medida d. Este aumento no gradiente de pressão indica bandas de sucesso da aorta em ratos que foram submetidos à constrição da aorta ascendente parcial.
. Figura 2 ecocardiograma modo M do ventrículo esquerdo em ratos com constrição da aorta (A) e controle de ratos (B) retratando dimensões do ventrículo esquerdo na altura do sacrifício oito semanas pós-cirurgia IVST = espessura do septo ventricular Inter.; EDVE = espessura da parede do ventrículo esquerdo posterior; LVID = diâmetro interno do ventrículo esquerdo em diástole. Em ratos com a constrição da aorta de um aumento significativo da espessura entre septo ventricular, espessura da parede posterior do ventrículo esquerdo e diminuição do diâmetro interno do ventrículo esquerdo no estado diastólica podem ser observados.
Figura 3. Imagens dos corações inteiros de um rato, que foram submetidos a constrição da aorta (A) e uma farsa operados rato controle (B) 8 semanas após a cirurgia. O rato com a constrição da aorta tem hipertrofia cardíaca significativa em relação ao sham operado controle.
Tabela 1 M-mode parâmetros ecocardiográficos de ventrículo esquerdo cardíaco no momento do sacrifício, oito semanas após a cirurgia IVST = espessura do septo ventricular Inter..; EDVE = espessura da parede do ventrículo esquerdo posterior; LVID = diâmetro interno do ventrículo esquerdo em estado diastólica; AAC = ascendente constrição aórtica.
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Discussion
Existem vários modelos cirúrgicos para a indução de sobrecarga de pressão, bem como a hipertrofia cardíaca e insuficiência cardíaca. Em pequenos animais, Lorell e seus colegas desenvolveram o modelo que descrevemos aqui e eles relataram a ocorrência de hipertrofia cardíaca compensada oito semanas de bandas pós aórtica 5. Alterações cardíacas gradualmente progredir para um estado descompensada e resultar em insuficiência cardíaca. A principal vantagem deste modelo é o aparecimento gradual de aumento da pressão ventricular esquerda e, portanto, semelhante às situações clínicas em hipertensão crônica. Também é um modelo animal adequado para o estudo da insuficiência cardíaca esquerdo associada a hipertensão pulmonar 10.
Outros modelos animais para a insuficiência cardíaca sobrecarga de pressão, como ratos sensíveis Dahl, ratos espontaneamente hipertensos e ratos com constrição de aorta abdominal, também desenvolvem sobrecarga crônica de pressão. Eles, no entanto, tomar longos períodos de tempo para a progressão from hipertrofia cardíaca para a insuficiência cardíaca. O custo de manutenção de ratos experimentais é, portanto, também mais alta 1. deAlmeida e colegas empregados constrição aórtica transversal para induzir a hipertrofia ventricular esquerda em ratos 11. A técnica envolve a esternotomia mediana e retração do esterno e, portanto, é mais desafiador.
Certifique-se de uma mudança rápida de anestesia do nariz cone à intubação traqueal antes de toracotomia e de intubação traqueal com nariz cone após os procedimentos operatórios. Um método alternativo para a intubação traqueal em ratos é usando tubo de polietileno para entubação endotraqueal em vez de traqueotomia. No entanto, esta técnica requer habilidade adequada. Cuidados devem ser tomados para evitar qualquer prejuízo para os pulmões ao fazer incisão entre as costelas. A aplicação de clipes de titânio suficientes para produzir constrição aórtica crítica para o estresse ventricular esquerda, mas não é grave o suficiente para produzir insuficiência ventricular esquerda aguda e pedema ulmonar. Uso de prolene para a aproximação das costelas é fundamental para a recuperação bem-sucedida do animal. Durante a aproximação das costelas, pause o ventilador por cerca de 2-4 segundos, a fim de re-inflar os pulmões.
Tivemos apenas 20% de mortalidade operatória nos animais e não houve complicações pós-operatórias. A técnica que descrevemos aqui é, portanto, uma ferramenta eficiente e adequado para o estudo de alterações crônicas fisiopatológicas em hipertrofia cardíaca e insuficiência cardíaca progressiva.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia para o apoio financeiro a este projeto. Ajith Kumar GS foi apoiado com bolsa de pesquisa sênior do Conselho de Pesquisa Científica e Industrial, Governo da Índia e Binil Raj com bolsa de pesquisa sênior do Conselho Indiano de Pesquisa Médica, Governo da Índia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wistar rats | Maintained at ARF, RGCB | ||
| Inhalation anaesthesia systems | VetEquip | AB19276 | |
| Rodent ventilator | CWE Inc | SAR- 830/AP | |
| Rat tracheal cannula | CWE Inc | 13-21032 | |
| Ultrasound system | Philips | HD7 | |
| Ultrasound transducer | Philips | S 12 | |
| Titanium clip (small) | Horizon | 1204 | |
| Clip applicator | Weck | 137081 | |
| Electric shaver | Vinverth | VBT0817 | |
| BP blade (size:11) | Surgeon | REF10111 | Preparation of surgical site |
| Tramadol | Orchid health care | OCH043 | |
| Amoxycillin Hydrochloride | Ranbaxy | ||
| Isoflurane | Piramal health care | A23M10A | |
| Syringes | BD | 2015-09 | |
| 4-0 braided silk | Diamond | ||
| 3-0 prolene | Johnson&Johnson | NW018 | |
| Surgical tape | Romsons | SH 6301 | |
| Povidone iodine | Win Medicare | ||
| Temp. controlled heating pad | Flamingo | HC1003 |
References
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