Summary
Lymphknoten sind die immunologischen Gewebe, die die Immunantwort orchestrieren und ein kritisches Ziel für Impfstoffe sind. Biomaterialien wurden eingesetzt, um Lymphknoten besser anzusprechen und die Abgabe von Antigenen oder Hilfsstoffen zu kontrollieren. Dieser Artikel beschreibt eine Technik, die diese Ideen kombiniert, um biokompatible Polymerpartikel in Lymphknoten zu injizieren.
Abstract
Die Generierung der adaptiven Immunantwort beruht auf einer effizienten Drainage oder dem Handel mit Antigen-Lymphknoten zur Verarbeitung und Darstellung dieser fremden Moleküle in T- und B-Lymphozyten. Lymphknoten sind somit zu kritischen Zielen für neue Impfstoffe und Immuntherapien geworden. Eine neue Strategie zur Gezielten Ausrichtung auf diese Gewebe ist die direkte Lymphknoteninjektion von löslichen Impfstoffkomponenten, und klinische Studien mit dieser Technik waren vielversprechend. Mehrere Biomaterialstrategien wurden ebenfalls untersucht, um das Lymphknotenziel zu verbessern, z. B. die Partikelgröße für eine optimale Drainage von biomaterial-Impfstoffpartikeln. In diesem Beitrag stellen wir eine neue Methode vor, die die direkte Lymphknoteninjektion mit biologisch abbaubaren Polymerpartikeln kombiniert, die mit Antigen-, Adjuvans- oder anderen Impfstoffkomponenten beladen werden können. Bei diesem Verfahren werden polymere Mikropartikel oder Nanopartikel durch ein modifiziertes Doppelemulsionsprotokoll mit Lipidstabilisatoren synthetisiert. Partikeleigenschaften(z.B. Größe, Ladungsbelastung) werden durch Laserbeugung bzw. Fluoreszenzmikroskopie bestätigt. Maus-Lymphknoten werden dann durch periphere Injektion eines ungiftigen Tracerfarbstoffs identifiziert, der die Visualisierung der Zielinjektionsstelle und die anschließende Ablagerung von Polymerpartikeln in Lymphknoten ermöglicht. Diese Technik ermöglicht eine direkte Kontrolle der Dosen und Kombinationen von Biomaterialien und Impfstoffkomponenten, die an Lymphknoten geliefert werden, und könnte bei der Entwicklung neuer biomaterialbasierter Impfstoffe genutzt werden.
Introduction
Die Lymphknoten (LNs) sind die Kommandozentralen des Immunsystems. An dieser immunologischen Stelle, Antigen präsentieren den Zellen Primieren naiver Lymphozyten gegen bestimmte fremde Antigene, um zelluläre und humorale Immunantworten zu aktivieren. LNs sind damit zu einem attraktiven Ziel für die Lieferung von Impfstoffen und Immuntherapien geworden. Leider führen die meisten Impfstoffstrategien zu einer ineffizienten, vorübergehenden Abgabe von Antigenen und Hilfsstoffen an das Lymphgewebe1. Ansätze, die die Ausrichtung und Retention von Impfstoffkomponenten in LNs verbessern, könnten daher erhebliche Auswirkungen auf die Wirksamkeit und Effizienz neuer Impfstoffe haben.
Eine Strategie zur Umgehung der Herausforderung des LN-Targetings, die großes Interesse an neuen klinischen Studien gezeigt hat, ist die direkte, intra-LN (i.LN.) Injektion2-4. Diese Studien verwendeten Ultraschall-Leitlinien, um Impfstoffe an LNs als einfaches ambulantes Verfahren zu liefern. Im Vergleich zu herkömmlichen peripheren Injektionsrouten führte dieser Ansatz zu einer signifikanten dosissparenden und verbesserten Wirksamkeit in therapeutischen Kontexten, einschließlich Allergien und Krebs2-4. In diesen Studien wurden i.LN.-Injektionen von löslichen Impfstoffen(d.h. biomaterialfrei) eingesetzt, die durch Lymphdrainage schnell gerodet wurden. Daher wurden mehrere Injektionen - oder Zyklen von Mehrfachinjektionen - verabreicht, um diese beeindruckenden therapeutischen Effekte zu erzielen. Verbesserte Retention in der LN könnte die Interaktion zwischen Antigen und /oder adjuvanten und Immunzellen verbessern, weiter verbesserung der Wirksamkeit der Immunzellgrundierung. Dieses Potenzial wird durch aktuelle Studien unterstützt, die zeigen, dass die Kinetik der Antigen- und Adjuvans-Entbindung eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der spezifischen Immunantwort spielt, die5-7erzeugt wird. Darüber hinaus könnte die Lokalisierung und Minimierung von Medikamenten- und Impfstoffdosen systemische Effekte wie chronische Entzündungen reduzieren oder eliminieren.
Biomaterialien wurden ausgiebig untersucht, um die Wirksamkeit und Effizienz von Impfstoffen zu verbessern1,8,9. Die Verkapselung oder Adsorption auf Biomaterialträgern kann Fracht physisch vor Demintizugung schützen und Löslichkeitsbeschränkungen überwinden. Ein weiteres bemerkenswertes Merkmal von Biomaterialträgern, wie z. B. polymeren Mikro- oder Nanopartikeln, ist die Fähigkeit, mehrere Ladungsklassen zu beladen und anschließend diese Ladungen in kontrollierten Intervallen freizugeben. Eine signifikante Einschränkung, die Biomaterial-Impfstoffe und Immuntherapien in vivo weiterhin behindert, ist jedoch eine ineffiziente Ausrichtung auf Immunzellen und der eingeschränkte Handel mit Lymphknoten. Beispielsweise weist die periphere Injektion von Biomaterialimpfstoffen über konventionelle Wege(z. B. intradermale, intramuskuläre) in der Regel eine schlechte LN-Ausrichtung auf, wobei bis zu 99 % des injizierten Materials an der Injektionsstelleverbleiben 4,10. In jüngerer Zeit wurde die Größe der Träger von Biomaterial-Impfstoffen darauf abgestimmt, den präferenziellen Handel oder die Entwässerung dieser Impfstoffe an LNs durch interstitielle Strömungenden 8,10zu verbessern. Diese Fortschritte haben zu verbesserten zellulären und humoralen Immunreaktionen geführt und die Bedeutung der Ausrichtung und Entwicklung der LN-Umgebung für neue Impfstoffe unterstrichen.
Dieses Papier stellt ein Impfprotokoll vor, das lipidstabilisierte Polymerpartikel und i.LN. Lieferung kombiniert, um kontrollierte Freisetzungsimpfstoffdepots zu erzeugen5,11. Aufbauend auf neueren Studien mit chirurgischen Techniken für i.LN. bei Mäusen6,7,12,13haben wir eine schnelle, nicht-chirurgische Strategie zur Injektion von Biomaterial-Impfstoffen bei Kleintieren entwickelt5. Kombination der i.LN-Lieferung mit Biomaterial-Impfstoffträgern verbesserte die CD8-T-Zellreaktion innerhalb von 7 Tagen nach einer einmaligen Injektion von kontrollierten Freisetzungsimpfstoffdepots5. Es wurde auch eine starke humoristische Reaktion(d.h. Antikörpertiter) erzeugt; Beide Verbesserungen waren mit einer erhöhten Retention von Impfstoffkomponenten in Lymphknoten verbunden, die durch kontrollierte Freisetzung aus den Biomaterialträgern vermittelt wurde. Interessanterweise veränderte die Größe der Impfstoffpartikel das Schicksal dieser Materialien einmal in den LNs: Nanopartikel zeigten eine erhöhte direkte Aufnahme durch Zellen, während größere Mikropartikel in der extrazellulären LN-Umgebung blieben und freigesetzte Ladung(z. B. Adjuvans) freigesetzt wurde, die von LN-residenten Antigen-Darstellungszellen5aufgenommen wurde. Diese Daten deuten auf zwei Wege hin, die durch die Kontrolle der Größe der i.LN injizierten Biomaterialien für neue Impfstoffe genutzt werden könnten.
In diesem Artikel werden biologisch abbaubare lipidstabilisierte Polymerpartikel (mikro- und nanoskal) mit einer modifizierten Doppelemulsionsstrategie synthetisiert5,11. Die Partikeleigenschaften zeichnen sich durch Laserbeugung und Mikroskopie aus. Diese Partikel werden dann direkt in die Leisten-LNs injiziert, die nichtchirurgisch mit einem gemeinsamen, ungiftigen Tracerfarbstoff14identifiziert wurden. Die Nachinjektionsanalyse von LNs durch Histologie oder Durchflusszytometrie kann verwendet werden, um die Verteilung von Partikeln innerhalb der LN-Umgebung zu überprüfen sowie die zelluläre Aufnahme und Retention von Partikeln im Laufe der Zeit zu überwachen. Für Protokolle, die die histologische Verarbeitung und die Durchflusszytometrie beschreiben, werden die Leser auf aktuelle JoVE-Artikel und Journalberichte15-22verwiesen. Typische Ergebnisse zeigen lokale LN-Targeting dieser Depots, die genutzt werden könnten, um potente, effiziente Immunantworten zu erreichen oder die Immunität für Zielerreger anzupassen.
Protocol
Alle Tierstudien in diesem Protokoll wurden in Übereinstimmung mit den Bundes-, Landes- und lokalen Richtlinien abgeschlossen und unter Verwendung von Protokollen, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Maryland überprüft und genehmigt wurden.
1. Synthese von lipidstabilisierten Mikro- und Nanopartikeln
- In einer 7 ml Glasdurchstechflasche(en) DOPC,DSPE-PEG und DOTAP Lipide in einem Molarenverhältnis von 60:20:20 kombinieren, um eine Master-Lipidmischung vorzubereiten.
- Zur Synthese einer einzelnen Probe: Übertragen Sie 242,9 l, 287,4 l und 71,9 l von DOPC, DSPE-PEG bzw. DOTAP mit 2 ml serologischen Pipetten aus Glas in die Durchstechflasche.
- Um mehrere Proben zu synthetisieren: Multiplizieren Sie jedes Lipidvolumen oben mit der Anzahl der Proben und kombinieren Sie sie in einer einzigen Durchstechflasche, und übertragen Sie dann gleiche Aliquots dieser Lipidmischung in Fläschchen, die jeder zu bereitenden Probe entsprechen.
- Trocknen Sie Lipide unter einem sanften Strom von Stickstoffgas für 10 min, oder über Nacht in den Vakuumofen stellen.
- In einer einzigen, leeren 20 ml Glasdurchstechflasche 80 mg PLGA in 5 ml Dichlormethan für jede Partikelprobe auflösen, um eine 16 mg/ml Polymerstofflösung zu erzeugen.
- 5 ml Polymerlösung in die Durchstechflasche geben, die die getrockneten Lipide, Kappe und Wirbel für 30 Sek. enthält.
- So synthetisieren Sie Mikropartikel:
- Beginnen Sie mit der Beschallung der organischen Phase, die das Polymer, Lipid und andere wasserunlösliche Ladung auf Eis bei 12 W mit einem Beschallungsgerät enthält.
- Erstellen Sie die Wasser-in-Öl-Emulsion (w/o) mit einer Pipette, um 500 l destilliertehupteH2O oderH2O mit 1 mg Peptid, Protein oder anderer wasserlöslicher Ladung hinzuzufügen.
- 30 Sek. bei 12 W auf Eis weiter beschallen, die Durchstechflasche sanft nach oben und unten schaukeln und seitlich um die Beschallungsspitze kreisen, um eine vollständige Emulgierung zu gewährleisten.
- Erstellen Sie die Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsion (w/o/w) durch Gießen der w/o-Emulsion in 40 mlH2O in einem 150 ml Becherglas.
- Mit einem digitalen Homogenisator 3 min bei 16.000 Umdrehungen pro Minute homogenisieren.
- Fügen Sie einen magnetischen Rührstab hinzu, übertragen Sie den Becher auf eine Rührplatte und lassen Sie die w/o/w-Emulsion über Nacht rühren, um das überschüssige Lösungsmittel zu entfernen.
- So synthetisieren Sie Nanopartikel:
- Beginnen Sie mit der Beschallung der organischen Phase, die die Polymer-, Lipid- und andere wasserunlösliche Ladung auf Eis bei 14 W enthält.
- Erstellen Sie die w/o-Emulsion, indem Sie eine Pipette verwenden, um 500 l destilliertehupH2O oderH2O mit 1 mg Peptid, Protein oder anderer wasserlöslicher Ladung hinzuzufügen.
- 30 Sek. bei 14 W auf Eis weiter beschallen.
- Erstellen Sie die w/o/w-Emulsion, indem Sie die w/o-Emulsion auf 40 mlH2O in ein 150 ml Becherglas gießen und 5 min bei 16 W auf Eis beschallen. Schaukeln Sie die Durchstechflasche vorsichtig nach oben und unten und seitlich um die Beschallungsspitze, um eine vollständige Emulgierung zu gewährleisten.
- Fügen Sie einen magnetischen Rührstab hinzu, übertragen Sie den Kolben auf eine Rührplatte und lassen Sie die w/o/w-Emulsion über Nacht rühren, um das überschüssige Lösungsmittel zu entfernen.
- Am nächsten Morgen, waschen und sammeln Partikel:
- Gießen Sie Emulsion durch 40 'm Nylon-Netzzellensieb in ein 50 ml konisches Rohr.
- Zentrifugenpartikel für 5 min bei 5.000 x g für Mikropartikel oder 5 min bei 24.000 x g für Nanopartikel.
- Dekantieren überstand und waschen Partikel durch Wiederaufsetzen in 1 mlH2O.
- Schwebeteilchen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr übertragen.
- Zentrifuge für 5 min bei 5.000 x g für Mikropartikel oder 5 min bei 24.500 x g für Nanopartikel.
- Waschen Sie die Partikel zweimal, indem Sie überstand, in 1 mlH2O wieder aufhängen und zentrifugieren wie in Schritt 1.6.5. Nach dem Waschen Partikel in 1 mlH2O zur sofortigen Verwendung aussetzen oder Lyophilize für eine längere Lagerung.
2. Messung der Syntheseausbeute
- Eine leere 20 ml Glasflasche vorwiegen. Fügen Sie der vorgewogenen Durchstechflasche 100 l Partikelsuspension hinzu, nachdem Sie mit einer Mikropipette nach oben und unten gepfnet haben.
- Lyophilisieren Sie die Partikel oder trocknen Sie unter einem sanften Stickstoffstrom.
- Wiegen Sie die Durchstechflasche, die das getrocknete Polymer enthält. Bestimmen Sie die Partikelausbeute in der Durchstechflasche, indem Sie das ursprüngliche Gewicht der Durchstechflasche von der Masse der Durchstechflasche subtrahieren, die die getrockneten Partikel enthält.
- Bestimmen Sie die Gesamtpartikelausbeute, indem Sie die Partikelmasse in der Durchstechflasche mit dem Verdünnungsfaktor multiplizieren. Um die prozentuale Ausbeute zu bestimmen, dividieren Sie die Partikelmasse durch die maximale theoretische Eingangsmasse und multiplizieren Sie sie mit 100 %.
3. Bestimmung der Partikelgröße
- Reinigen Sie die mitgelieferte Glasfraktionszelle im Küvetten-Stil, indem Sie sie mit entionisiertem Wasser füllen und mit wattestäblichem Tupfer abwischen. Übertragen Sie 10 ml destilliertesH2O in die gereinigte Fraktionszelle, fügen Sie einen magnetischen Mikrorührstab hinzu und laden Sie die Bruchzelle in die Zellhalterung des Partikelgrößenanalysators.
- Passen Sie die magnetische Rührgeschwindigkeit im Partikelanalysator an, um eine vollständige Durchmischung in der Bruchzelle zu erreichen und schließen Sie die Fachtür.
- Richten Sie die Laser über die Instrumentensoftware-Schnittstelle an der Bruchzelle aus.
- Verwenden Sie die Instrumentensoftware-Schnittstelle, um einen Basiswert mit der Bruchzelle aufzuzeichnen, die nur destilliertes H2O enthält.
- Pipette die ursprüngliche Partikelsuspension nach oben und unten mit einer Mikropipette zu mischen.
- Pipette 10 l Partikelsuspension (in der Regel ca. 0,5 mg) in die Bruchzelle. Stellen Sie sicher, dass das Volumen der Partikelprobe, die der Zelle zugesetzt wird, ausreicht, um eine Signalstärke im entsprechenden Bereich zu erzeugen, wie auf der Gerätesoftware-Schnittstelle angegeben. Die tatsächliche Masse der benötigten Partikel hängt von der prozentualen Ausbeute und den optischen Eigenschaften der Partikelprobe ab.
- Schließen Sie die Partikelgrößenanalysatorfachtür und messen Sie die Partikelgröße mit einem Brechungsindex von 1,60 für PLGA.
- Verwenden Sie die Software-Schnittstelle, um den Partikeldurchmesser anhand einer Zahlenbasis zu berechnen.
4. Visualisierung von Partikeln
- Pipette Partikel Suspension nach oben und unten mit Mikropipette zu mischen. Partikelsuspension in entionisiertem Wasser auf 1 mg/ml verdünnen.
- Bereiten Sie einen Mikroskopschlitten vor, indem Sie 3 l verdünnte Partikelsuspension hinzufügen und einen Abdeckschlupf in einem 45°-Winkel montieren, um Blasenbildung zu vermeiden. Platzieren Sie das Dia auf der Mikroskopbühne und das Bild mit den entsprechenden Filtersätzen für jede fluoreszierende Ladung.
5. Vorbereitung von Mäusen für i.LN. Injektion
- Tracer-Farbstofflösung vorbereiten:
- Bereiten Sie eine 0,1% (w/v) Lösung des Tracerfarbstoffs vor, indem Sie 10 mg Farbstoffpulver mit 10 ml destilliertem H2O auflösen.
- Sterilisieren Sie die Farbstofflösung in eine Glasdurchstechflasche mit einem 0,2 m Spritzenfilter.
- Einen Tag vor der Injektion beanmaßen Sie die Maus mit Isofluran gemäß einem von der IACUC zugelassenen Tierprotokoll. Um die Tiefe der Anästhesie zu bewerten, führen Sie einen Zehenkneifenreflextest durch und überwachen Sie die Atemfrequenz, um eine Atemfrequenz von etwa 100-140 Atemzügen pro Minute zu gewährleisten.
- Rasieren Sie Haare an der Basis des Schwanzes und Hinterviertel mit Clippers, während die Maus beästhestisiert wird. Entfernen Sie das Haar von der ventralen Seite des Tieres und seitlich um die dorsale Seite knapp über dem Gelenk des Hinterbeins (Hüfte).
- Tracerfarbstoff injizieren.
- Verwenden Sie für jede Farbstoffinjektion eine Mikropipette, um 10 l Farbstofflösung in ein Mikrozentrifugenrohr zu übertragen, und saugen Sie die gesamte 10 l in eine 31G-Nadel, die an einer 1 ml Spritze befestigt ist.
- Injizieren Sie 10 l Farbstofflösung subkutan auf jeder Seite der Schwanzbasis, wo das Haar abgeschnitten wurde, nachladen zwischen den Injektionen.
- Entfernen Sie das restliche Haar, indem Sie eine milde Enthaarungscreme über Wattestäbchen auftragen. Achten Sie darauf, den Bereich zwischen hinteren Oberschenkel und Bauch zu beschichten.
- Enthaarungscreme 3 min auf der Haut brüten lassen. Nach der Inkubation die nasse Hand mit warmem H2O und die Enthaarungscreme vorsichtig in die Haut reiben.
- Entfernen Sie sofort Enthaarungscreme durch Benetzung der Hand mit warmer H2O und reiben den Schwanzboden und das Hinterviertel. Wiederholen Sie dies, bis die überschüssige Enthaarung entfernt ist, und achten Sie darauf, die Hand nass zu halten, um Reizungen zu vermeiden.
- Entfernen Sie die Restenthaarung von der Maus, indem Sie ein weiches Tuch oder Papiertuch mit warmemH2O und in einer einzigen Bewegung benetzen, wobei der untere Teil der Maus abwischt wird. Vermeiden Sie eine Reibbewegung, um Abrieb oder Hautschäden an der Maus zu verhindern.
- Lassen Sie die Maus unter einer Wärmelampe erholen und zum Halten zurückkehren.
6. i.LN. Injektion von Partikeln
- Am folgenden Tag beanmaßen Sie die Maus mit Isofluran gemäß einem von der IACUC zugelassenen Tierprotokoll.
- Untersuchen Sie die Maus, um die Drainage des Tracerfarbstoffs in jeden Leistenlymphknoten zu bestätigen. Der Lymphknoten sollte als dunkler Fleck in der Nähe von Hinterschenkf und Bauch sichtbar sein.
- Bereiten Sie Partikelinjektionslösung vor:
- Partikel in destilliertemH2O bei gewünschter Injektionskonzentration wieder aufsetzen. Verwenden Sie für jede Injektion eine Mikropipette, um 10 l Partikellösung in ein Mikrozentrifugenrohr zu übertragen.
- Die gesamte 10 l in eine 31G Insulinnadel, die an einer 1 ml Spritze befestigt ist, ansaugen.
- Injektion der Partikeldosis:
- Nach der Visualisierung von LN, straffen Sie die Haut um LN mit Daumen, Zeigefinger und Mittelfinger, um die Haut zu verspotten und eine kontrollierte Platzierung des Injektionsvolumens zu ermöglichen.
- Nähern Sie sich dem LN mit der Nadel in einem 90°-Winkel zur Haut und durchdringen Sie die Haut über den gefärbten LN bis zu einer Tiefe von 1 mm.
- Injizieren Sie langsam das gesamte Volumen. Während der Injektion, beobachten Sie das LN-Volumen durch die Haut, um die Injektion durch sichtbare LN-Vergrößerung zu bestätigen.
- Lassen Sie die Maus unter einer Wärmelampe erholen und kehren Sie zum Halten zurück oder führen Sie zusätzliche Tests durch.
Für relevante Analysetechniken(z.B. Histologie, Durchflusszytometrie) siehe JoVE Artikel 265, 1743 und 3054 und aktuelle Protokolle in der Immunologie,Kapitel 5 und 2115-22.
Representative Results
Die erwarteten Ergebnisse für die in diesem Manuskript vorgestellten Protokolle lassen sich in drei Kategorien unterteilen: Partikelsynthese, Tieraufbereitung und Partikelinjektion.
Abbildung 1 zeigt die Synthese und Charakterisierung biologisch abbaubarer Polymerpartikel, die durch amphiphile Lipide stabilisiert werden. Die Ergebnisse des Emulsions-/Lösungsmittelverdampfungssyntheseprotokolls (Abbildung 1A) können durch visuelle Inspektion der erzeugten Endemulsionen qualitativ bewertet werden; Partikelchargen sollten homogene, stabile Emulsionen mit undurchsichtigem Aussehen sein. Komplikationen sind Emulsionen, die Creme oder Flocculate, oft aufgrund unsachgemäßer Lagerung von Lipidstabilisatoren. Um diese Instabilität zu vermeiden, sollten Lipide bei -80 °C in einem dehydrierten Zustand oder in einer versiegelten Durchstechflasche mit Stickstoff gereinigt gelagert werden. Quantitative Bewertung der Partikelsynthese kann mit Laserbeugung oder dynamischer Lichtstreuung durchgeführt werden, um die Größenverteilung zu analysieren (Abbildung 1B). Zu den erwarteten Ergebnissen gehören eng verteilte, monomodale Partikelgrößen, die auf eine gleichmäßige Partikelpopulation hinweisen. Die in diesem Manuskript beschriebenen Syntheseparameter erzeugen zahlengemittelte Verteilungen, die bei etwa 100 nm bzw. 3 m für Nanopartikel bzw. Mikropartikel zentriert sind. Eine weitere qualitative Bewertung der Partikelsynthese kann durch eine Änderung des obigen Protokolls erreicht werden, um mehrere Klassen von fluoreszierender Ladung zu integrieren. In Abbildung 1Cbestätigen Mikroskopiebilder von Mikropartikeln, die mit einem fluoreszierenden Peptid (FITC, grün), einem lipophilen Farbstoff (DiD, rot) und einem Overlay-Bild (gelb) beladen sind, die Bildung von Partikeln innerhalb des gewünschten Größenbereichs und die Verkapselung von Peptid innerhalb des Volumens des Partikels.
Die ersten beiden Panels von Abbildung 2 fassen die erwarteten Ergebnisse der Tiervorbereitung für die in diesem Papier beschriebene i.LN.-Injektionsstrategie zusammen. Die Methode beinhaltet die Kennzeichnung von Leisten-LNs durch periphere Injektion eines ungiftigen Tracers, um den Ort für die nachfolgende i.LN.-Injektion von Partikeln zu identifizieren (Abbildung 2A)5. Wie bereits erwähnt, ermöglicht die Drainage des Tracerfarbstoffs nach subkutaner Injektion an der Schwanzbasis die Visualisierung der leistenförmigen LNs (Abbildung 2B)5. Die Einnahme von zugelassenen Enthaarungscremes kann eine Gefahr für die Mäuse darstellen. Daher sollte darauf geachtet werden, alle aufgetragene Creme gründlich zu entfernen, wobei besonders auf die Pfoten und die ventrale Seite der Mäuse zu achten ist. Enthaart sollte mit einem nassen, weichen Tuch oder einem nassen Papiertuch in einer einzigen, glatten Bewegung entfernt werden. Vermeiden Sie Reiben, um Creme zu entfernen, da dies zu Abschürfungen auf der exponierten Haut der Mäuse führen kann.
Bestätigung der lokalen Lieferung an die Leisten-LN kann durch Beobachtung oder Histologie bewertet werden. Das LN-Volumen kann während der Injektion visuell als Indikator für eine erfolgreiche Injektion überwacht werden. Zu den erwarteten Ergebnissen gehört eine effiziente Frachtverteilung in der LN-Struktur, ohne dass angrenzende Gewebe oder Zellen signifikant austreten. Da die injizierte Flüssigkeit den Tracer in der LN verdrängt/verdünnt, sollte die Farbstoffkonzentration/Färbung nach der Injektion weniger intensiv werden. Die Beobachtung des Gewebes sollte eine intakte, aber vergrößerte LN durch Flüssigkeitsinjektion offenbaren. Mögliche Herausforderungen sind die zu schnelle Injektion oder das Fehlen der LN, die beide zu einer Elution des Volumens in das umgebende Subkutangewebe führen können. Diese unerwünschten Ergebnisse können durch Nekropsie oder Histologie bestätigt werden, wo die Partikelsuspension beobachtet wird, die sich auf Zellen und Gewebe ausbreitet, die von Knoten entfernt sind, die zur Injektion bestimmt sind. Ein erwartetes Ergebnis wäre dagegen die Identifizierung einer vergrößerten Leisten-LN aufgrund der Eindämmung von Partikeln innerhalb der LN-Struktur. Die histologische Verarbeitung verbrauchsteuerrwerdener LNs kann die Lieferung von Fracht an das Lymphgewebe endgültig bestätigen, wie in den Abbildungen 2C und 2Ddargestellt. Beachten Sie, dass die Partikel in Abbildung 2 fluoreszierende Ladung enthalten, um die Visualisierung der Ladung während der Injektion sowie während der histologischen Verarbeitung und fluoreszierenden Mikroskopie zu ermöglichen.
Abbildung 1. Synthese und Charakterisierung von Lipid stabilisierten Partikeln. A) Schematische Darstellung der Synthese von lipidstabilisierten Partikeln, die durch Emulsion/Lösungsmittelverdampfung hergestellt werden. B) Größenverteilungen von Mikropartikeln (feste Linie, Durchmesser = 2,8 m) und Nanopartikeln (gestrichelte Linie, Durchmesser = 113 nm). C) Fluoreszierende Mikroskopiebilder von Partikeln, die mit fluoreszierend markiertem Peptid und einem fluoreszierenden Partikelfarbstoff beladen sind. Etiketten: Peptid (grün) und Partikel (rot). Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. i.LN. Injektion und Verteilung biologisch abbaubarer Partikel innerhalb von LN. A) Methodik für i.LN.-Injektion. B) Visualisierung von LNs in einer Maus durch die Haut (oberes Bild) und die folgende Nekropsie (unteres Bild)5. C) Histologische Färbung eines LN, das die Ablagerung und Verteilung fluoreszierend markierter Polymermikropartikel (Partikel, grün; T-Zellen, rot; B-Zellen, blau). D) Fluoreszierend markierte Nanopartikel (50 nm, linkes Bild) und Mikropartikel (6 m, rechtes Bild) in LNs 24 Stunden nach der Injektion. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.
Discussion
Die in diesem Protokoll beschriebene Technik ermöglicht die kontrollierte Abgabe von Impfstoffen an LNs und an LN-residente Antigen-präsentierende Zellen. Biomaterial verkapselte Ladung kann innerhalb der LN lokalisiert werden, so dass die Dosen einer oder mehrerer Arten von Fracht, die an die LN-Mikroumgebung geliefert werden, manipuliert werden können. Die Lokalisierung und kontrollierte Freisetzung von Polymerpartikeln hat gezeigt, dass eine starke zelluläre und humorale Immunantwort bei deutlich niedrigeren Dosen als herkömmliche Ansätze erzeugt wird. Darüber hinaus kann durch die Manipulation der Biomaterialträgergröße die primäre Art der zellulären Verarbeitung zwischen der direkten Aufnahme von Nanopartikeln oder der extrazellulären Ladungsfreisetzung aus größeren Mikropartikelnmoduliertwerden 5 . Diese Ergebnisse belegen die Machbarkeit der i.LN. Biomaterial-Lieferung als Plattform für die therapeutische Impfstoffabgabe.
Die Synthese von PLGA-Partikeln durch Emulsion/Lösungsmittelverdampfung wurde in Anwendungen zur Arzneimittelabgabe weit verbreitet23,24. Potenzielle Herausforderungen im Zusammenhang mit dieser Technik betreffen daher vor allem die erfolgreiche Identifizierung und Ablagerung von Impfstoffen am LN-Zielstandort. Obwohl die Verwendung von Tracerfarbstoff die Visualisierung der gezielten Leisten-LNs erleichtert, sind die Zielgröße und -tiefe unter der Haut klein. Daher empfehlen die Autoren, Zeit und Mäuse für die Zubereitung und Injektion von Mäusen zu zuteilen. Während der Tiervorbereitung(d.h. Rasur und Anwendung der Enthaarung) sollte darauf geachtet werden, die Mäuse nicht auf der ventralen Seite des Tieres zu schneiden, wo der Winkel des Beins mit dem Bauch die Haut anfälliger für Verletzungen durch Clippers macht. Darüber hinaus sollte alle Enthaarungsmittel mit warmem Wasser entfernt werden, um zu verhindern, dass Tiere die Creme während des normalen Pflegeverhaltens vernehmen. Um LN-Injektionen zu praktizieren, kann eine höhere Tracer-Farbstoff-Konzentration verabreicht und Praxistiere eingeschläfert und dann mehrmals injiziert werden. Nach der Injektion können Mäuse nekroropiniert werden und die Größe von LNs von injizierten Tieren kann mit einer nicht injizierten Kontrolle LN verglichen werden. Eine Einschränkung dieser Technik ist die physikalische Grenze des Injektionsvolumens, die in die LN-Struktur geladen werden kann. Unser Protokoll schlägt ein Injektionsvolumen von 10 l bei Mäusen vor, obwohl andere Studien größere Injektionsvolumina von mindestens 20 l berichtet haben.13 Die direkte Lieferung von Impfstoffen über i.LN. Die Injektion ermöglicht jedoch eine dramatische Dosisersparnis, so dass die Funktion dieser Impfstoffe in der Regel nicht durch Volumenbeschränkungen eingeschränkt werden sollte.
Wie bereits erwähnt, ist die Änderung der physikalischen Eigenschaft der Partikel(d. h. Größe) ein effektiver Mechanismus, um den Durchweg oder die Ergebnisse zu verändern, die durch Biomaterialien und verkapselte Ladungen im LN-Gewebe induziert werden. Das Emulsions-/Lösungsmittelverdampfungsprotokoll kann leicht geändert werden, um physikalische oder chemische Eigenschaften wie Oberflächenladung oder Funktionalität und die Rate der biologischen Abbau-/Ladungsfreisetzung23,24zu verändern. Beispielsweise kann die Freisetzungskinetik durch alternative Polymerzusammensetzungen abgestimmt werden, und die Oberflächenfunktion kann mit modifizierten Lipidzusammensetzungen oder Poly(Vinylalkohol) verändert werden. Die in Partikel verladene Ladung kann leicht manipuliert werden, um verschiedene Antigene oder Hilfsstoffe für Zielerreger zu enthalten. Der Vorteil dieses Ansatzes wird durch die Kombination von i.LN. Lieferung mit lokaler, kontrollierter Freisetzung von Ladung aus Biomaterialien erreicht. Diese Synergie schafft eine Plattform, die genutzt werden kann, um effiziente adaptive Immunantworten mit winzigen Dosen und mit reduzierten unspezifischen/systemischen Nebenwirkungen zu generieren.
Disclosures
Produktionskosten und Zugangsgebühren für diese Artikel wurden teilweise von HORIBA, Ltd. gesponsert.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil von der PhRMA-Stiftung und einem Research and Scholar Award der University of Maryland, College Park, finanziert. Wir danken Prof. Darrell Irvine für die Unterstützung der ersten Arbeiten, die bei der Fertigstellung der"In-situ-Engineering des Lymphknoten-Mikroumgebung sperekten Durchdriniierung von adjuvant-releasing Polymerpartikeln" durchgeführt wurden. 5
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | 10 mg/ml stock in chloroform |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] ammonium salt (DSPE-PEG) | Avanti Polar Lipids | 880128 | 10 mg/ml stock in chloroform |
| 1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride salt (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890 | 10 mg/ml stock in chloroform |
| Polylactic-co-glycolic acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | P2191 | Lactide:Glycolide (50:50). MW 30,000-60,000 |
| Dichloromethane (DCM) | VWR | BDH1113 | |
| Isoflurane | Vetone | 502017 | |
| Nair | Nair | ||
| Evans blue tracer dye | VWR | AAA16774-09 | |
| U-100 BD Ultra-Fine Short Insulin Syringes, 31 G 5/16 in needle | VWR | BD328418 | |
| Single-Use Needles, BD Medical, 21 G, 1.5 in needle | VWR | BD305167 | |
| Syringes with BD Luer-Lok Tip, BD Medical, 1 ml | VWR | BD309628 | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, 40 µm | VWR | 21008-949 | |
| Vybrant DiD Cell-Labeling Solution | Invitrogen | V-22887 | |
| Fluoresbrite YG Microspheres 6.00 µm | Polysciences | 17149 | |
| Fluoresbrite YG Microspheres 0.05 µm | Polysciences | 17156 | |
| Ovalbumin, Purified | Worthington Biochemical | LS003056 | |
| Qsonica Sonicator Ultrasonic Processor Q125 | Qsonica | Q125 | 1/8 in diameter microtip probe |
| Ultra-Turrax T 25 digital homogenizer | IKA | YO-04739-22 | 10 G dispersing element |
| Fluorescent Microscope | Olympus | IX-83 | |
| Laser Diffraction Particle Size Distribution Analyzer | Horiba | LA-950 | Including provided cuvette-style glass fraction cell |
| Professional 8685 Peanut Classic Clippers | Wahl |
References
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