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Bioengineering

बायोडिग्रेडेबल पॉलीमर कणों का इंट्रा-लिम्फ नोड इंजेक्शन

Published: January 2, 2014 doi: 10.3791/50984
* These authors contributed equally

Summary

लिम्फ नोड्स प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को आर्केस्ट्रा करने वाले प्रतिरक्षा ऊतक हैं और टीकों के लिए एक महत्वपूर्ण लक्ष्य हैं। बायोमैटेरियल्स को बेहतर लक्ष्य लिम्फ नोड्स को लक्षित करने और एंटीजन या एडजुवेंट्स के वितरण को नियंत्रित करने के लिए नियोजित किया गया है। यह पेपर इन विचारों के संयोजन वाली तकनीक का वर्णन करता है ताकि बायोस्पैटिबल पॉलीमर कणों को लिम्फ नोड्स में इंजेक्ट किया जा सके।

Abstract

अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का उत्पादन टी और बी लिम्फोसाइट्स के लिए इन विदेशी अणुओं के प्रसंस्करण और प्रस्तुति के लिए लिम्फ नोड्स के लिए एंटीजन की कुशल जल निकासी या तस्करी पर निर्भर करता है। इस प्रकार लिम्फ नोड्स नए टीकों और इम्यूनोथेरपी के लिए महत्वपूर्ण लक्ष्य बन गए हैं। इन ऊतकों को लक्षित करने के लिए हाल ही में एक रणनीति घुलनशील वैक्सीन घटकों के प्रत्यक्ष लिम्फ नोड इंजेक्शन है, और इस तकनीक से जुड़े नैदानिक परीक्षणों का वादा किया गया है । लिम्फ नोड लक्ष्यीकरण में सुधार के लिए कई बायोमटेरियल रणनीतियों की भी जांच की गई है, उदाहरण के लिए, बायोमटेरियल वैक्सीन कणों के इष्टतम जल निकासी के लिए ट्यूनिंग कण आकार। इस पेपर में हम एक नई विधि पेश करते हैं जो बायोडिग्रेडेबल बहुलक कणों के साथ सीधे लिम्फ नोड इंजेक्शन को जोड़ती है जो एंटीजन, एडजुवेंट या अन्य वैक्सीन घटकों से लदी हो सकती है। इस विधि में पॉलीमेरिक माइक्रोकण या नैनोकणों को लिपिड स्टेबलाइजर को शामिल करते हुए एक संशोधित डबल पायस प्रोटोकॉल द्वारा संश्लेषित किया जाता है। कण गुणों(जैसे आकार, कार्गो लोडिंग) क्रमशः लेजर विवर्तन और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा पुष्टि की जाती है। माउस लिम्फ नोड्स को तब एक नॉनटॉक्सिक ट्रेसर डाई के परिधीय इंजेक्शन द्वारा पहचाना जाता है जो लक्ष्य इंजेक्शन साइट के दृश्य और लिम्फ नोड्स में पॉलीमर कणों के बाद जमा करने की अनुमति देता है। यह तकनीक लिम्फ नोड्स को वितरित बायोमैटेरियल्स और वैक्सीन घटकों की खुराक और संयोजनों पर प्रत्यक्ष नियंत्रण की अनुमति देती है और नए बायोमैटेरियल-आधारित टीकों के विकास में उपयोग किया जा सकता है।

Introduction

लिम्फ नोड्स (एलएनएस) प्रतिरक्षा प्रणाली के कमांड सेंटर हैं। इस प्रतिरक्षा साइट पर, एंटीजन पेश कोशिकाओं को सेलुलर और विनोदी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को सक्रिय करने के लिए विशिष्ट विदेशी एंटीजन के खिलाफ प्राइम भोले लिम्फोसाइट्स पेश करता है। इस प्रकार एलएन टीकों और इम्यूनोथेरपी के वितरण के लिए एक आकर्षक लक्ष्य बन गए हैं । दुर्भाग्य से, अधिकांश वैक्सीन रणनीतियों के परिणामस्वरूप एंटीजन और एडजुवेंट्स की अक्षम, क्षणिक डिलीवरी लिम्फोइड ऊतक1में होती है। इसलिए एलएन में वैक्सीन घटकों को लक्षित करने और बनाए रखने में सुधार करने वाले दृष्टिकोणों का नए टीकों की शक्ति और दक्षता पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ सकता है।

नए नैदानिक परीक्षणों में काफी रुचि का प्रदर्शन करने वाले एलएन लक्ष्यीकरण की चुनौती को दरकिनार करने के लिए एक रणनीति प्रत्यक्ष, इंट्रा-एलएन(यानी एलएन)इंजेक्शन2-4है। इन परीक्षणों में एक साधारण आउट पेशेंट प्रक्रिया के रूप में एलएन को टीके देने के लिए अल्ट्रासाउंड मार्गदर्शन नियोजित किया गया था। पारंपरिक परिधीय इंजेक्शन मार्गों की तुलना में, इस दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप एलर्जी और कैंसर2-4सहित चिकित्सीय संदर्भों में महत्वपूर्ण खुराक-बख्शते और बेहतर प्रभावकारिता हुई। इन अध्ययनों में घुलनशील टीकों(यानी बायोमटेरियल-फ्री) के आईआईएलए इंजेक्शन को नियोजित किया गया था, जिन्हें लिम्फेटिक ड्रेनेज द्वारा तेजी से मंजूरी दी गई थी । इसलिए, इन प्रभावशाली चिकित्सीय प्रभावों को प्राप्त करने के लिए कई इंजेक्शन-या कई इंजेक्शन के चक्र-प्रशासित किए गए थे। एलएन में बेहतर प्रतिधारण एंटीजन और/या एडजुवेंट और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच बातचीत को बढ़ा सकता है, प्रतिरक्षा कोशिका भड़काना की शक्ति में सुधार । यह क्षमता हाल के अध्ययनों द्वारा समर्थित है जो एंटीजन और एडजुवेंट डिलीवरी की गतिज दिखाते हैं,जो 5-7उत्पन्न विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इसके अलावा, स्थानीयकरण और दवा और वैक्सीन की खुराक को कम करने या इस तरह के पुरानी सूजन के रूप में प्रणालीगत प्रभाव, को खत्म कर सकता है ।

टीकोंकी शक्ति और दक्षता बढ़ाने के लिए बायोमैटेरियल्स का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है । जैव सामग्री वाहकों पर अवशोषण में एनकैप्सुलेशन शारीरिक रूप से कार्गो को गिरावट से ढाल सकता है और घुलनशीलता सीमाओं को दूर कर सकता है। पॉलीमेरिक माइक्रो या नैनोकणों जैसे जैव सामग्री वाहकों की एक और उल्लेखनीय विशेषता कार्गो के कई वर्गों को कोसा करने की क्षमता है और बाद में, इन कार्गो को नियंत्रित अंतराल पर जारी करती है। हालांकि, एक महत्वपूर्ण सीमा जो वीवो में बायोमैटेरियल टीकों और इम्यूनोथेरपी में बाधा जारी रहती है, प्रतिरक्षा कोशिकाओं और लिम्फ नोड्स के लिए सीमित तस्करी का अक्षम लक्ष्यीकरण है। उदाहरण के लिए, पारंपरिक मार्गों(जैसे इंट्राडरमल, इंट्रामस्कुलर) के माध्यम से बायोमटेरियल टीकों का परिधीय इंजेक्शन आम तौर पर खराब एलएन लक्ष्यीकरण प्रदर्शित करता है, जिसमें इंजेक्शन4,10की साइट पर शेष इंजेक्शन सामग्री का 99% तक होता है। हाल ही में, जैव सामग्री वैक्सीन वाहकों के आकार को इन टीकों के तरजीही अवैध व्यापार या जल निकासी को बेहतर बनाने के लिए ट्यून किया गया है, जो इंटरस्टिशियल फ्लो8,10के माध्यम से एलएन को दिया गया है। इन अग्रिमों ने नए टीकों के लिए एलएन पर्यावरण को लक्षित करने और इंजीनियरिंग करने के महत्व को रेखांकित करते हुए सेलुलर और विनोदी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को बढ़ाया है ।

यह पेपर एक टीकाकरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो लिपिड-स्थिर बहुलक कणों और आईएलए डिलीवरी को नियंत्रित रिलीज वैक्सीन डिपो5,11उत्पन्न करने के लिए जोड़ती है। आई.एलएनके लिए सर्जिकल तकनीकों को नियोजित करने वाले हालिया अध्ययनों पर निर्माण । चूहों6,7,12,13में, हम छोटे जानवरों में बायोमटेरियल टीके इंजेक्शन के लिए एक त्वरित, गैर शल्य रणनीति विकसित5. बायोमटेरियल वैक्सीन वाहकों के साथ आई.एलएन डिलीवरी के संयोजन ने नियंत्रित रिलीज वैक्सीन डिपो 5 के एक इंजेक्शन के बाद 7 दिनों के भीतर सीडी8टी सेल प्रतिक्रिया को बढ़ाया। एक मजबूत विनोदी प्रतिक्रिया(यानी एंटीबॉडी टाइटर्स) भी उत्पन्न हुई थी; दोनों संवर्द्धन लिम्फ नोड्स में वैक्सीन घटकों की बढ़ी हुई अवधारण से जुड़े थे जिन्हें बायोमटेरियल वाहकों से नियंत्रित रिलीज द्वारा मध्यस्थता की गई थी। दिलचस्प बात यह है कि टीके के कणों के आकार ने एलएन में एक बार इन सामग्रियों के भाग्य को बदल दिया: नैनोस्केल कणों ने कोशिकाओं द्वारा सीधे तेज को दिखाया, जबकि बड़े सूक्ष्मकण बाह्य एलएन पर्यावरण में बने रहे और कार्गो(जैसे adjuvant) जारी किए गए जो एलएन-निवासी एंटीजन पेश कोशिकाओं द्वारा उठाए गए थे5। इन आंकड़ों से दो रास्तों का सुझाव दिया गया है कि नए टीकों के लिए इंजेक्शन i.LN इंजेक्शन बायोमैटेरियल्स के आकार को नियंत्रित करके शोषण किया जा सकता है ।

इस लेख में बायोडिग्रेडेबल लिपिड-स्थिर बहुलक कणों (माइक्रो-और नैनोस्केल) को संशोधित डबल पायस रणनीति5,11का उपयोग करके संश्लेषित किया जाता है। कण गुण लेजर विवर्तन और माइक्रोस्कोपी की विशेषता है। इन कणों को तब सीधे इंजिनियल एलएन में इंजेक्ट किया जाता है, जो एक आम, नॉनटॉक्सिक ट्रेसर डाई14का उपयोग करके गैर-पहचाना जाता है। हिस्टोलॉजी या फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एलएन के इंजेक्शन के बाद विश्लेषण का उपयोग एलएन पर्यावरण के भीतर कणों के वितरण को सत्यापित करने के साथ-साथ समय के साथ कणों के सेलुलर तेज और प्रतिधारण की निगरानी करने के लिए किया जा सकता है। हिस्टोलॉजिकल प्रोसेसिंग और फ्लो साइटोमेट्री का ब्यौरा देने वाले प्रोटोकॉल के लिए, पाठकों को हाल ही में जोवे लेख और जर्नल रिपोर्ट15-22के लिए संदर्भित किया जाता है। विशिष्ट परिणाम इन डिपो के स्थानीय एलएन लक्ष्यीकरण को प्रदर्शित करते हैं जिनका उपयोग शक्तिशाली, कुशल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करने या लक्षित रोगजनकों के लिए प्रतिरक्षा दर्जी करने के लिए किया जा सकता है।

Protocol

इस प्रोटोकॉल में सभी पशु अध्ययन संघीय, राज्य और स्थानीय दिशानिर्देशों के अनुपालन में पूरे किए गए थे, और मैरीलैंड विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा समीक्षा और अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग कर रहे थे।

1. लिपिड-स्थिर माइक्रो और नैनोकणों का संश्लेषण

  1. एक 7 मिलीलीटर ग्लास शीशी (एस) में, एक मास्टर लिपिड मिश्रण तैयार करने के लिए 60:20:20 मोलर अनुपात में DOPC, DSPE-खूंटी, और DOTAP लिपिड गठबंधन ।
    1. एक नमूने को संश्लेषित करने के लिए: 2 मिलीलीटर ग्लास सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके क्रमशः डीओपीसी, डीएसपीई-खूंटी और DOTAP के 242.9 माइक्रोन, 287.4 माइक्रोन, और 71.9 माइक्रोन को स्थानांतरित करें।
    2. कई नमूनों को संश्लेषित करने के लिए: नमूनों की संख्या से ऊपर प्रत्येक लिपिड मात्रा गुणा करें और एक ही शीशी में गठबंधन करें, फिर तैयार होने वाले प्रत्येक नमूने के अनुरूप शीशियों में इस लिपिड मिश्रण के बराबर एलिकोट्स स्थानांतरित करें।
    3. 10 मिनट के लिए नाइट्रोजन गैस की एक कोमल धारा के नीचे सूखी लिपिड, या रात भर वैक्यूम ओवन में जगह है ।
  2. एक एकल, खाली 20 मिलीलीटर ग्लास शीशी में, 16 मिलीग्राम/मिलीलीटर बहुलक स्टॉक समाधान उत्पन्न करने के लिए प्रत्येक कण नमूने के लिए 5 मिलीलीटर डाइक्लोरोमेथेन में 80 मिलीग्राम पीएलजीए को भंग करें।
  3. 30 सेकंड के लिए सूखे लिपिड, टोपी और भंवर युक्त शीशी (ओं) में 5 मिलीलीटर बहुलक समाधान जोड़ें।
  4. सूक्ष्मकणों का संश्लेषण करने के लिए:
    1. एक सोनिकेटर का उपयोग करके 12 डब्ल्यू पर बर्फ पर बहुलक, लिपिड और अन्य पानी-अघुलनशील कार्गो युक्त कार्बनिक चरण को सोनिकेट करना शुरू करें।
    2. एक पिपेट का उपयोग करके पानी में तेल (w/o) पायस बनाएं ताकि आसुत एच2हे, या एच2ओ के 500 माइक्रोन को जोड़ा जा सके जिसमें 1 मिलीग्राम पेप्टाइड, प्रोटीन या अन्य जल घुलनशील कार्गो होते हैं।
    3. बर्फ पर 12 डब्ल्यू में 30 सेकंड के लिए sonicating जारी रखें, धीरे से शीशी ऊपर और नीचे और पक्ष के साथ ध्वनिक टिप के आसपास की ओर कमाल करने के लिए पूरा पायस सुनिश्चित करने के लिए ।
    4. 150 मिली बीकर में 40 मिली एच2ओ में डब्ल्यू/ओ पायल डालकर पानी में तेल में पानी (w/o/w) पायस पैदा करें।
    5. डिजिटल होमोजेनाइजर का उपयोग करके 16,000 आरपीएम पर 3 मिनट के लिए समरूप।
    6. एक चुंबकीय हलचल बार जोड़ें, एक हलचल प्लेट में बीकर स्थानांतरित करें, और अतिरिक्त विलायक को हटाने के लिए रात भर हलचल करने के लिए w/o/w पायस की अनुमति दें ।
  5. नैनोकणों का संश्लेषण करने के लिए:
    1. 14 डब्ल्यू पर बर्फ पर बहुलक, लिपिड, और अन्य पानी अघुलनशील कार्गो युक्त कार्बनिक चरण को सोनिकेट करना शुरू करें।
    2. एक पिपेट का उपयोग करके 500 माइक्रोन डिस्टिल एच2ओ, या एच2ओ को 1 मिलीग्राम पेप्टाइड, प्रोटीन या अन्य पानी में घुलनशील कार्गो से युक्त जोड़कर डब्ल्यू/ओ पायस बनाएं।
    3. बर्फ पर 14 डब्ल्यू में 30 सेकंड के लिए सोनिकिंग जारी रखें।
    4. w/o/w पायस को 150 मिलीलीटर बीकर में 40 मिलीलीटर एच2ओ में डालकर और बर्फ पर 16 डब्ल्यू पर 5 मिनट के लिए सोनिकिंग करके बनाएं। धीरे-धीरे शीशी को ऊपर और नीचे और साइड में सोनिकेटर टिप के चारों ओर रॉक करें ताकि पूर्ण पायसिफिकेशन सुनिश्चित किया जा सके।
    5. एक चुंबकीय हलचल बार जोड़ें, एक हलचल प्लेट में फ्लास्क स्थानांतरित करें और अतिरिक्त विलायक को हटाने के लिए रात भर हलचल करने की अनुमति दें।
  6. अगली सुबह, धोने और कणों को इकट्ठा:
    1. एक 50 मिलीलीटर शंकु नली में 40 μm नायलॉन जाल सेल छलनी के माध्यम से पायस डालो।
    2. सूक्ष्मकणों के लिए 5,000 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रलाइज कण या नैनोकणों के लिए 24,000 x ग्राम पर 5 मिनट।
    3. डीडेंट सुपरनेट और वॉश पार्टिकल्स को 1 मिलीलीटर एच2ओ में रिसिपेंड करके।
    4. निलंबित कणों को 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    5. माइक्रोकणों के लिए 5,000 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रलाइज या नैनोकणों के लिए 24,500 x ग्राम पर 5 मिनट।
    6. सुपरनैंट को हटाकर कणों को दो बार अधिक धोएं, 1 मिलीलीटर एच2ओ में पुनर्व्यय करें, और चरण 1.6.5 के रूप में अपकेंद्रित्र करें। धोने के बाद, तत्काल उपयोग के लिए 1 मिलीलीटर एच2ओ में कणों को निलंबित करें, या विस्तारित भंडारण के लिए लियोफिलिज़ करें।

2. संश्लेषण उपज का मापन

  1. एक खाली 20 मिलीलीटर कांच की शीशी को प्रीवीग करें। मिश्रण करने के लिए एक माइक्रोपिपेट के साथ ऊपर और नीचे पाइपिंग के बाद प्रीवीग्ड शीशी में कण निलंबन के 100 माइक्रोल जोड़ें।
  2. नाइट्रोजन की कोमल धारा के नीचे कणों या सूखी को ल्योफफिलाइज करें।
  3. सूखे बहुलक युक्त शीशी का वजन करें। सूखे कणों वाली शीशी के द्रव्यमान से शीशी के मूल वजन को घटाकर शीशी में कण उपज का निर्धारण करें।
  4. कमजोर पड़ने वाले कारक द्वारा शीशी में कण द्रव्यमान को गुणा करके समग्र कण उपज का निर्धारण करें। प्रतिशत उपज निर्धारित करने के लिए, कण द्रव्यमान को अधिकतम सैद्धांतिक इनपुट द्रव्यमान से विभाजित करें और 100% से गुणा करें।

3. कण आकार का निर्धारण

  1. डिओनाइज्ड पानी से भरकर और कॉटन-इत्तला वाले झाड़ू से पोंछते हुए सप्लाई किए गए क्यूवेट-स्टाइल ग्लास फ्रैक्शन सेल को साफ करें । साफ गुट सेल के लिए आसुत एच2ओ के 10 मिलीलीटर हस्तांतरण, चुंबकीय माइक्रो हलचल बार जोड़ने के लिए, और कण आकार विश्लेषक के सेल माउंट में अंश सेल लोड ।
  2. अंश कोशिका में पूर्ण मिश्रण प्राप्त करने और डिब्बे के दरवाजे को बंद करने के लिए कण विश्लेषक में चुंबकीय सरगर्मी गति को समायोजित करें।
  3. उपकरण सॉफ्टवेयर इंटरफेस का उपयोग कर अंश सेल के लिए लेजर संरेखित करें।
  4. केवल आसुत एच2ओ युक्त अंश सेल के साथ एक बेसलाइन रीडिंग रिकॉर्ड करने के लिए इंस्ट्रूमेंट सॉफ्टवेयर इंटरफेस का उपयोग करें।
  5. मिश्रण करने के लिए एक माइक्रोपिपेट के साथ मूल कण निलंबन ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  6. पिपेट 10 माइक्रोन ऑफ पार्टिकल सस्पेंशन (आमतौर पर लगभग 0.5 मिलीग्राम) अंश कोशिका में। सुनिश्चित करें कि सेल में जोड़े गए कण नमूने की मात्रा उचित रेंज में संकेत शक्ति उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त है जैसा कि साधन सॉफ्टवेयर इंटरफेस पर इंगित किया गया है। आवश्यक कणों का वास्तविक द्रव्यमान प्रतिशत उपज और कण नमूने के ऑप्टिकल गुणों पर निर्भर है।
  7. कण आकार एनालाइजर डिब्बे के दरवाजे को बंद करें और पीएलजीए के लिए 1.60 के अपवर्तक सूचकांक का उपयोग करके कण आकार को मापें।
  8. एक नंबर के आधार का उपयोग कर कण व्यास की गणना करने के लिए सॉफ्टवेयर इंटरफेस का उपयोग करें।

4. कणों का दृश्य

  1. पिपेट कण मिश्रण करने के लिए माइक्रोपिपेट के साथ ऊपर और नीचे निलंबन। डिवियोनाइज्ड पानी में 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर तक पतला कण सस्पेंशन।
  2. बुलबुला गठन से बचने के लिए 45 डिग्री कोण पर 3 माइक्रोन पतला कण निलंबन जोड़कर और एक कवरस्लिप बढ़ते हुए माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयार करें। प्रत्येक फ्लोरोसेंट कार्गो के लिए उपयुक्त फ़िल्टर सेट का उपयोग करके माइक्रोस्कोप स्टेज और इमेज पर स्लाइड रखें।

5. i.LN के लिए चूहों की तैयारी। इंजेक्शन

  1. ट्रेसर डाई समाधान तैयार करें:
    1. 10 मिलीलीटर आसुत एच2ओ के साथ 10 मिलीग्राम डाई पाउडर को भंग करके ट्रेसर डाई का 0.1% (w/v) समाधान तैयार करें।
    2. डाई समाधान को 0.2 माइक्रोन सिरिंज फ़िल्टर का उपयोग करके कांच की शीशी में स्टरलाइज करें।
  2. इंजेक्शन से एक दिन पहले, आईएसीयूसी अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल के अनुसार आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके माउस को एनेस्थेटाइज करें। संज्ञाहरण की गहराई का मूल्यांकन करने के लिए, एक पंजे चुटकी पलटा परीक्षण प्रदर्शन और प्रति मिनट लगभग 100-140 सांस की एक श्वसन दर सुनिश्चित करने के लिए सांस लेने की दर की निगरानी ।
  3. माउस को एनेस्थेटाइज्ड करते समय क्लिपर्स का उपयोग करके पूंछ और हिंदक्वार्टर के आधार पर बाल शेव करें। जानवर के वेंट्रल साइड से बाल निकालें और पार्श्व में पिछले पैर (कूल्हे) के संयुक्त के ठीक ऊपर पृष्ठीय पक्ष के आसपास।
  4. ट्रेसर डाई इंजेक्ट करें।
    1. प्रत्येक डाई इंजेक्शन के लिए, एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में डाई समाधान के 10 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करने के लिए एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करें, और एक 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी एक 31G सुई में पूरे 10 माइक्रोन को एस्पिरेट करें।
    2. पूंछ के आधार के प्रत्येक तरफ डाई समाधान के 10 माइक्रोन इंजेक्ट करें जहां बालों को काटा गया था, इंजेक्शन के बीच में फिर से लोड करना।
  5. सूती झाड़ू के माध्यम से एक हल्के डिपिलेटरी क्रीम लगाने से शेष बालों को हटा दें। पिछली जांघ और पेट के बीच के क्षेत्र को कोट करना सुनिश्चित करें।
  6. 3 मिनट के लिए त्वचा पर इनक्यूबेट करने के लिए डिपिलेटरी क्रीम की अनुमति दें। इनक्यूबेशन के बाद, गर्म एच2ओ के साथ गीले दस्ताने हाथ और धीरे से त्वचा में depilatory क्रीम रगड़ें।
  7. तुरंत गर्म एच2ओ और रगड़ पूंछ आधार और हिंडक्वार्टर के साथ दस्ताने हाथ गीला द्वारा depilatory क्रीम हटा दें । जब तक अतिरिक्त डिपिलेटरी हटा नहीं जाती है, तब तक दोहराएं, जिससे जलन से बचने के लिए हाथ गीला रखना सुनिश्चित करें।
  8. माउस के निचले हिस्से को पोंछते हुए, गर्म एच2ओ के साथ और एक ही गति में एक नरम कपड़े या कागज तौलिया गीला करके माउस से अवशिष्ट depilatory निकालें। माउस को घर्षण या त्वचा को नुकसान से रोकने के लिए रगड़ गति से बचें।
  9. माउस को गर्मी के दीपक के नीचे ठीक होने दें और होल्डिंग पर लौटें।

6. यानी एलएन। कणों का इंजेक्शन

  1. अगले दिन, एक IACUC अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल के अनुसार आइसोफ्लुएन का उपयोग कर माउस एनेस्थेटाइज करें।
  2. प्रत्येक इंगिनल लिम्फ नोड में ट्रेसर डाई की जल निकासी की पुष्टि करने के लिए माउस की जांच करें। लिम्फ नोड को पिछली जांघ और पेट के पास एक अंधेरे स्थान के रूप में दिखाई देना चाहिए।
  3. कण इंजेक्शन समाधान तैयार करें:
    1. वांछित इंजेक्शन एकाग्रता पर आसुत एच2ओ में कणों को फिर से एंसुस्ट करें। प्रत्येक इंजेक्शन के लिए, एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में कण समाधान के 10 माइक्रोल स्थानांतरित करने के लिए एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करें।
    2. एक 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी एक 31G इंसुलिन सुई में पूरे 10 μl aspirate।
  4. कण की खुराक इंजेक्ट करें:
    1. एलएन की कल्पना करने के बाद, त्वचा के ताने खींचने और इंजेक्शन की मात्रा को नियंत्रित करने के लिए अंगूठे, इंडेक्स फिंगर और मिडिल फिंगर का उपयोग करके एलएन के आसपास त्वचा को कस दें।
    2. त्वचा के लिए 90 डिग्री कोण पर सुई के साथ एलएन से संपर्क करें और रंगे हुए एलएन पर त्वचा को 1 मिमी की गहराई तक प्रवेश करें।
    3. धीरे-धीरे पूरी मात्रा इंजेक्ट करें। इंजेक्शन के दौरान, दिखाई एलएन वृद्धि द्वारा इंजेक्शन की पुष्टि करने के लिए त्वचा के माध्यम से एलएन मात्रा का निरीक्षण करें।
  5. माउस को गर्मी के दीपक के नीचे ठीक होने दें और अतिरिक्त परीक्षण करने या कराने के लिए वापस जाएं।

प्रासंगिक विश्लेषण तकनीकों के लिए(जैसे हिस्टोलॉजी, फ्लो साइटोमेट्री) जोव आर्टिकल्स 265, 1743, और 3054 और इम्यूनोलॉजी में वर्तमान प्रोटोकॉल,अध्याय 5 और 2115-22देखें।

Representative Results

इस पांडुलिपि में प्रस्तुत प्रोटोकॉल के लिए अपेक्षित परिणामों को तीन श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है: कण संश्लेषण, पशु तैयारी और कण इंजेक्शन।

चित्र 1 में एम्फीफिलिक लिपिड द्वारा स्थिर बायोडिग्रेडेबल बहुलक कणों के संश्लेषण और लक्षण वर्णन को दर्शाया गया है। पायस/सॉल्वेंट वाष्पीकरण संश्लेषण प्रोटोकॉल(चित्रा 1A) केपरिणामों को उत्पन्न अंतिम पायस के दृश्य निरीक्षण द्वारा गुणात्मक रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है; कण बैचों को अपारदर्शी उपस्थिति के साथ समरूप, स्थिर पायस होना चाहिए। जटिलताओं में पायस शामिल होते हैं जो क्रीम या फ्लॉस्केट करते हैं, अक्सर लिपिड स्टेबलाइजर के अनुचित भंडारण के कारण। इस अस्थिरता से बचने के लिए, लिपिड को निर्जलित अवस्था में -80 डिग्री सेल्सियस पर या नाइट्रोजन के साथ पर्ज की गई सीलबंद शीशी में संग्रहीत किया जाना चाहिए। कण संश्लेषण का मात्रात्मक मूल्यांकन आकार वितरण(चित्रा 1 बी)का विश्लेषण करने के लिए लेजर विवर्तन या गतिशील प्रकाश बिखरने का उपयोग करके किया जा सकता है। अपेक्षित परिणामों में कसकर वितरित, मोनोमोडल कण आकार शामिल हैं, जो कणों की एक समान आबादी का संकेत देते हैं। इस पांडुलिपि में वर्णित संश्लेषण मापदंडों से नैनोकणों और सूक्ष्मकणों के लिए क्रमशः लगभग 100 एनएम या 3 माइक्रोन पर केंद्रित संख्या औसत वितरण उत्पन्न होती है। फ्लोरोसेंट कार्गो के कई वर्गों को शामिल करने के लिए उपरोक्त प्रोटोकॉल के संशोधन के माध्यम से कण संश्लेषण का और गुणात्मक मूल्यांकन प्राप्त किया जा सकता है। चित्रा 1Cमें, फ्लोरोसेंट पेप्टाइड (फिटसी, हरे), एक लिपोफिलिक डाई (डीआईडी, लाल), और एक ओवरले छवि (पीला) से भरे सूक्ष्मकणों की सूक्ष्मकॉपी छवियां कण की मात्रा के भीतर वांछित आकार सीमा और पेप्टाइड के एनकैप्सुलेशन के भीतर कणों के निर्माण की पुष्टि करती हैं।

चित्रा 2 के पहले दो पैनल इस पेपर में वर्णित आई.एलएन इंजेक्शन रणनीति के लिए पशु तैयारी के अपेक्षित परिणामों को संक्षेप में प्रस्तुत करते हैं। इस पद्धति में कणों के बाद के यानी एलएन इंजेक्शन(चित्र 2ए)5के लिए स्थान की पहचान करने के लिए नॉनटॉक्सिक ट्रेसर के परिधीय इंजेक्शन द्वारा इंगिनल एलएन को चिह्नित करना शामिल है । जैसा कि उल्लेख किया गया है, पूंछ के आधार पर चमड़े के नीचे इंजेक्शन के बाद ट्रेसर डाई की जल निकासी से इंजिनियन एलएन(चित्रा 2बी)5का दृश्य हो सकेगा। अनुमोदित डिपिलेटरी क्रीम का घूस चूहों के लिए खतरा पैदा कर सकता है। इस प्रकार, पंजे पर विशेष ध्यान देने, और चूहों के वेंट्रल साइड को लागू करने के लिए सभी क्रीम को अच्छी तरह से हटाने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। एक एकल, चिकनी गति में गीले, नरम कपड़े या गीले कागज तौलिया का उपयोग करके डेपिलेटरी को हटा दिया जाना चाहिए। क्रीम को हटाने के लिए रगड़ से बचें, क्योंकि इससे चूहों की उजागर त्वचा पर घर्षण हो सकता है।

इंजिनियल एलएन को प्रसव के स्थानीय की पुष्टि अवलोकन या हिट्टोलॉजी के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है। एलएन मात्रा सफल इंजेक्शन के संकेतक के रूप में इंजेक्शन के दौरान नेत्रहीन निगरानी की जा सकती है। अपेक्षित परिणामों में आसन्न ऊतकों या कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण रिसाव के बिना, एलएन संरचना में कुशल कार्गो वितरण शामिल है। इसके अलावा, जैसा कि इंजेक्शन तरल पदार्थ एलएन में ट्रेसर को विस्थापित/पतला करता है, इंजेक्शन के बाद डाई एकाग्रता/रंग कम तीव्र हो जाना चाहिए । ऊतक का अवलोकन तरल इंजेक्शन के कारण एक बरकरार, लेकिन बढ़े हुए एलएन को प्रकट करना चाहिए। संभावित चुनौतियों में बहुत तेजी से इंजेक्शन या एलएन याद आ रही है, जिनमें से दोनों आसपास के चमड़े के नीचे ऊतक में मात्रा की कमी पैदा कर सकता है शामिल हैं । इन अवांछनीय परिणामों की पुष्टि नेक्रॉप्सी या हिस्टोलॉजी द्वारा की जा सकती है, जहां कण निलंबन इंजेक्शन के लिए लक्षित नोड्स से कोशिकाओं और ऊतकों को दूर तक फैलते हुए देखा जाएगा। इसके विपरीत, एक अपेक्षित परिणाम एलएन संरचना के भीतर कणों की रोकथाम के कारण एक बढ़े हुए इंजिनियल एलएन की पहचान होगी। उत्पादित एलएन की हिस्टोलॉजिकल प्रोसेसिंग निश्चित रूप से लिम्फोइड ऊतक में कार्गो की डिलीवरी की पुष्टि कर सकती है, जैसा कि आंकड़े 2C और 2Dमें दिखाया गया है। ध्यान दें कि चित्रा 2 में कणों में फ्लोरोसेंट कार्गो को शामिल किया गया है ताकि इंजेक्शन के दौरान कार्गो के दृश्य के साथ-साथ हिस्टोलॉजिकल प्रोसेसिंग और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के दौरान अनुमति दी जा सके।

Figure 1
चित्रा 1. लिपिड स्थिर कणों का संश्लेषण और लक्षण वर्णन। ए)योजनाबद्ध आरेख जो पायस/सॉल्वेंट वाष्पीकरण द्वारा तैयार लिपिड-स्थिर कणों के संश्लेषण का वर्णन करता है । B)सूक्ष्मकणों का आकार वितरण (ठोस रेखा, व्यास = 2.8 माइक्रोन) और नैनोकण (धराशायी रेखा, व्यास = 113 एनएम)। ग)फ्लोरोसेंट लेबल पेप्टाइड और फ्लोरोसेंट कण डाई से भरे कणों की फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियां । लेबल: पेप्टाइड (हरा) और कण (लाल)। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 2
चित्रा 2। i.L.. एलएन के भीतर बायोडिग्रेडेबल कणों का इंजेक्शन और वितरण। A) आई.एलएन इंजेक्शन के लिए कार्यप्रणाली। B)त्वचा (ऊपरी छवि) के माध्यम से माउस में एलएनएस का दृश्य और नेक्रॉप्सी (निचली छवि)5 का पालन करना। ग)एक एलएन के हिस्टोलॉजिकल धुंधला जमाव और फ्लोरोसेंटली लेबल बहुलक सूक्ष्मकणों (कणों, हरे रंग के वितरण की पुष्टि; टी कोशिकाओं, लाल; बी-कोशिकाएं, नीला)। घ)इंजेक्शन के बाद एलएन 24 घंटे में फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले नैनोकण (50 एनएम, लेफ्ट इमेज) और माइक्रोकण (6 माइक्रोन, राइट इमेज) । बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें। 

Discussion

इस प्रोटोकॉल में वर्णित तकनीक एलएन और एलएन-निवासी एंटीजन पेश कोशिकाओं को टीकों की नियंत्रित डिलीवरी की अनुमति देती है। बायोमैटेरियल समझाया कार्गो एलएन के भीतर स्थानीयकृत किया जा सकता है, एलएन माइक्रोएनवायरमेंट को वितरित कार्गो के एक या अधिक प्रकार की खुराक में हेरफेर को सक्षम करता है। बहुलक कणों से स्थानीयकरण और नियंत्रित रिलीज को पारंपरिक दृष्टिकोणों की तुलना में काफी कम खुराक पर एक शक्तिशाली सेलुलर और विनोदी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न करने के लिए दिखाया गया है। इसके अलावा, बायोमटेरियल कैरियर आकार के हेरफेर के माध्यम से, सेलुलर प्रसंस्करण के प्राथमिक मोड को नैनोकणों के सीधे तेज या बड़े माइक्रोकणियल5से बाह्य कार्गो रिलीज के बीच संग्राहक किया जा सकता है। ये परिणाम चिकित्सीय वैक्सीन वितरण के लिए एक मंच के रूप में यानी एलएन बायोमटेरियल डिलीवरी की व्यवहार्यता स्थापित करते हैं।

पायस/सॉल्वेंट वाष्पीकरण द्वारा पीएलजीए कणों के संश्लेषण को दवा वितरण अनुप्रयोगों में व्यापक रूप से नियोजित किया गया है23,24. इस प्रकार इस तकनीक से जुड़ी संभावित चुनौतियां ज्यादातर एलएन लक्ष्य स्थल में टीकों की सफल पहचान और जमाव से संबंधित हैं । हालांकि ट्रेसर डाई का उपयोग लक्षित इंजिनियल एलएन के दृश्य की सुविधा देता है, लेकिन त्वचा के नीचे लक्ष्य आकार और गहराई छोटी होती है। इस प्रकार, लेखक चूहों की तैयारी और इंजेक्शन का अभ्यास करने के लिए समय और चूहों को आवंटित करने की सलाह देते हैं। पशु तैयारी(यानी शेविंग और डिपिलेटरी के आवेदन) के दौरान, जानवर के वेंट्रल साइड पर चूहों को न काटने के लिए देखभाल की जानी चाहिए जहां पेट के साथ पैर का कोण त्वचा को क़ैंची से चोट से अधिक प्रवण बनाता है। इसके अतिरिक्त, सभी डिपिलेटरी को गर्म पानी से हटा दिया जाना चाहिए ताकि जानवरों को सामान्य ग्रूमिंग व्यवहार के दौरान क्रीम को निगलने से रोका जा सके। एलएन इंजेक्शन का अभ्यास करने के लिए, एक उच्च ट्रेसर डाई एकाग्रता प्रशासित की जा सकती है और जानवरों को इच्छामृत्यु दी जा सकती है, और फिर कई बार इंजेक्शन दिया जा सकता है। निम्नलिखित इंजेक्शन चूहों को नेक्रिप्स किया जा सकता है और इंजेक्शन वाले जानवरों से एलएन के आकार की तुलना एक यूनिजेनेक्टेड नियंत्रण एलएन से की जा सकती है। इस तकनीक की एक सीमा इंजेक्शन की मात्रा की भौतिक सीमा है जिसे एलएन संरचना में लोड किया जा सकता है। हमारे प्रोटोकॉल चूहों में 10 माइक्रोन के एक इंजेक्शन की मात्रा का सुझाव है, हालांकि अंय अध्ययनों से कम से कम 20 μl के रूप में उच्च के रूप में बड़े इंजेक्शन की मात्रा की सूचना दी है ।13 हालांकि, i.LN. इंजेक्शन के माध्यम से टीकों की सीधी डिलीवरी नाटकीय खुराक-बख्शते तो इन टीकों के समारोह आम तौर पर मात्रा की कमी से सीमित नहीं होना चाहिए ।

जैसा कि उल्लेख किया गया है, कणों की भौतिक संपत्ति(यानी आकार) को बदलना एलएन ऊतक में बायोमैटेरियल्स और एनकैप्सुलेटेड कार्गो द्वारा प्रेरित मार्ग या परिणामों को बदलने के लिए एक प्रभावी तंत्र है। पायस/सॉल्वेंट वाष्पीकरण प्रोटोकॉल को आसानी से भौतिक या रासायनिक गुणों जैसे सतह प्रभार या कार्यक्षमता को बदलने के लिए संशोधित किया जा सकता है, और बायोडिग्रेडेशन/कार्गो रिलीज की दर23,24। उदाहरण के लिए, रिलीज गतिज को वैकल्पिक बहुलक रचनाओं के माध्यम से ट्यून किया जा सकता है, और संशोधित लिपिड रचनाओं या पॉली (विनाइल अल्कोहल) का उपयोग करके सतह समारोह को बदला जा सकता है। कणों में भरे कार्गो को आसानी से लक्षित रोगजनकों के लिए विभिन्न एंटीजन या एडजुवेंट को नियंत्रित करने के लिए हेरफेर किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण का लाभ बायोमैटेरियल्स से कार्गो की स्थानीय, नियंत्रित रिहाई के साथ i.LN. वितरण के संयोजन के माध्यम से प्राप्त किया जाता है। यह तालमेल एक मंच स्थापित करता है जिसका फायदा मिनट की खुराक का उपयोग करके और कम गैर-विशिष्ट/प्रणालीगत दुष्प्रभावों के साथ अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को कुशलतापूर्वक उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है ।

Disclosures

उत्पादन लागत और इस लेख के लिए उपयोग शुल्क आंशिक रूप से HORIBA, लिमिटेड द्वारा प्रायोजित किया गया

Acknowledgments

इस काम के हिस्से में PhRMA फाउंडेशन और मैरीलैंड विश्वविद्यालय, कॉलेज पार्क से एक अनुसंधान और विद्वान पुरस्कार द्वारा वित्त पोषित किया गया था । हम एडजुवेंट-रिलीजिंग पॉलीमर कणों के इंट्रा नोडल इंजेक्शन के माध्यम से लिम्फ नोड माइक्रोएनवायरमेंट केसीटू इंजीनियरिंग के पूरा होने में किए गए प्रारंभिक कार्य के समर्थन के लिए प्रो डेरेल इरविन को धन्यवाद देते हैं । 5

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids 850375 10 mg/ml stock in chloroform
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] ammonium salt (DSPE-PEG) Avanti Polar Lipids 880128 10 mg/ml stock in chloroform
1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride salt (DOTAP) Avanti Polar Lipids 890890 10 mg/ml stock in chloroform
Polylactic-co-glycolic acid (PLGA) Sigma-Aldrich P2191 Lactide:Glycolide (50:50). MW 30,000-60,000
Dichloromethane (DCM) VWR BDH1113
Isoflurane Vetone 502017
Nair Nair
Evans blue tracer dye VWR AAA16774-09
U-100 BD Ultra-Fine Short Insulin Syringes, 31 G 5/16 in needle VWR BD328418
Single-Use Needles, BD Medical, 21 G, 1.5 in needle VWR BD305167
Syringes with BD Luer-Lok Tip, BD Medical, 1 ml VWR BD309628
Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, 40 µm VWR 21008-949
Vybrant DiD Cell-Labeling Solution Invitrogen V-22887
Fluoresbrite YG Microspheres 6.00 µm Polysciences 17149
Fluoresbrite YG Microspheres 0.05 µm Polysciences 17156
Ovalbumin, Purified Worthington Biochemical LS003056
Qsonica Sonicator Ultrasonic Processor Q125 Qsonica Q125 1/8 in diameter microtip probe
Ultra-Turrax T 25 digital homogenizer IKA YO-04739-22 10 G dispersing element
Fluorescent Microscope Olympus IX-83
Laser Diffraction Particle Size Distribution Analyzer Horiba LA-950 Including provided cuvette-style glass fraction cell
Professional 8685 Peanut Classic Clippers Wahl

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बायोइंजीनियरिंग अंक 83 बायोमटेरियल इम्यूनोलॉजी माइक्रोपार्टिकल नैनोपार्टिकल वैक्सीन एडुवेंट लिम्फ नोड टारगेटिंग पॉलिमर
बायोडिग्रेडेबल पॉलीमर कणों का इंट्रा-लिम्फ नोड इंजेक्शन
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Andorko, J. I., Tostanoski, L. H.,More

Andorko, J. I., Tostanoski, L. H., Solano, E., Mukhamedova, M., Jewell, C. M. Intra-lymph Node Injection of Biodegradable Polymer Particles. J. Vis. Exp. (83), e50984, doi:10.3791/50984 (2014).

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