Summary
हम हम जीवित कोशिकाओं की confocal इमेजिंग के माध्यम से जालिका (ईआर) में निवासी ट्रांसफ़ेक्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन के वितरण और गतिशीलता की जांच करने के लिए उपयोग इमेजिंग तरीकों का वर्णन. हम भी ultrastructurally इस subcellular डिब्बे की वास्तुकला पर उनकी अभिव्यक्ति के प्रभाव का विश्लेषण.
Abstract
इन तीव्र interorganelle आणविक यातायात के बावजूद उनकी विशिष्ट संरचना और कार्यों को बनाए रखने हालांकि कोशिकाओं में लिपिड और प्रोटीन लगातार सेल के डिब्बों के बीच विमर्श कर रहे हैं. इस पत्र में वर्णित तकनीक vivo में और उनके मनोवैज्ञानिक वातावरण में प्रोटीन और लिपिड गतिशीलता और तस्करी का अध्ययन कर के शक्तिशाली साधन हैं. (फ्लिप) photobleaching में (FRAP) और प्रतिदीप्ति नुकसान photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली व्यापक रूप Exo-endocytic मार्ग, organelles या subcompartments के बीच निरंतरता, प्रोटीन परिसरों के गठन, और प्रोटीन स्थानीयकरण के माध्यम से intracellular तस्करी के अध्ययन के लिए जीना सेल इमेजिंग तकनीक का इस्तेमाल कर रहे हैं लिपिड microdomains में, जो सभी के लिए शारीरिक और रोग परिस्थितियों में देखा जा सकता है. इन तरीकों की सीमाओं के कारण फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन का उपयोग करने के लिए मुख्य रूप से कर रहे हैं, और उनके संभावित कमियां अधिक व्यक्त artifactual शामिलकोशिकाओं में आयन और टैग और देशी प्रोटीन की तह और स्थानीयकरण में मतभेद की संभावना. अंत में, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी (लगभग 200 एनएम) के संकल्प की सीमा के रूप में तनाव के तहत कोशिकाओं में पैदा कर सकते हैं कि ईआर या विशिष्ट subcompartments के ठीक संरचना की जांच की अनुमति नहीं है (यानी हाइपोक्सिया, औषधि प्रशासन, transmembrane की अभिव्यक्ति से अधिक ईआर निवासी प्रोटीन) या रोग की स्थिति के तहत, हम ultrastructural साथ सुसंस्कृत ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के रहने कक्ष इमेजिंग गठबंधन ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी पर आधारित विश्लेषण करती है.
Introduction
हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) और उसके वर्णक्रम वेरिएंट, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का समानांतर विकास की खोज, कोशिकाओं में प्रोटीन व्यवहार की जांच के लिए पूरी तरह से नए रास्ते खोल दिया है. क्योंकि तीव्र रोशनी के तहत उनके प्रतिदीप्ति बुझाने fluorophores की आंतरिक क्षमता के संभव हैं जो (फ्लिप), photobleaching में (FRAP) और प्रतिदीप्ति नुकसान photobleaching के बाद इस तरह के प्रतिदीप्ति वसूली के रूप में तकनीक, confocal जीना सेल इमेजिंग के आधार पर कर रहे हैं और का उपयोग ट्रांसफ़ेक्ट फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन 1-3. उन्होंने व्यापक रूप से उनके कार्य 4 के विषय में महत्वपूर्ण सुराग प्रकट कर सकते हैं, जो प्रोटीन का स्थानीयकरण, लेकिन यह भी अपनी गतिशीलता और vesicular परिवहन, न केवल आकलन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं.
कोशिकाओं की अनूठी विशेषता विशिष्ट लिपिड और प्रोटीन रचनाओं है कि intracellular डिब्बों की उपस्थिति है. Organelles शारीरिक रूप से ISOLAT यद्यपिएड, वे एक दूसरे के साथ संवाद करने और सेलुलर homeostasis को बनाए रखने के क्रम में आणविक घटकों को साझा करने की आवश्यकता है. स्रावी मार्ग ईआर में संश्लेषित प्रोटीन और लिपिड वे उनके कार्य डालती है, जिसमें सही अंतिम गंतव्य तक पहुँचने कि गारंटी देता है. Intracellular organelles भी अणु (लिपिड) सीधे डिब्बों के बीच विमर्श किया जा करने की अनुमति है कि गतिशील संपर्क साइटों से जोड़ा जा सकता है. इसके अलावा, कई प्रोटीन को बड़े heteromeric परिसरों में इकट्ठे या कार्यात्मक रूप से सक्रिय हो या उनके अंतिम गंतव्य के लिए ले जाया जा क्रम में विशिष्ट लिपिड प्रजातियों (लिपिड rafts / microdomains) के साथ जुड़े है. इन जैविक पहलुओं के सभी बहुत प्रोटीन की गतिज गुणों को प्रभावित है, और इसलिए उचित नीचे वर्णित तकनीकों के माध्यम से जांच की जा सकती है.
हमारे समूह ईआर की वास्तुकला और इसकी विभिन्न उप अध्ययन करने के क्रम में व्यापक रूप से FRAP इस्तेमाल किया गया है और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त फ्लिपडोमेन. ईआर स्रावी मार्ग का पहला स्टेशन है और प्रोटीन और 5 छँटाई लिपिड में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. यह किसका अलग उप डोमेन उसके कई विभिन्न कार्यों (यानी प्रोटीन और लिपिड जैवसंश्लेषण और तस्करी, प्रोटीन तह, 2 Ca + भंडारण और जारी है, और जीनोबायोटिक चयापचय) को प्रतिबिंबित एक अत्यधिक गतिशील organelle है. वे स्थानिक, आकृति विज्ञान के हैं, और कार्यात्मक अलग हालांकि, हालांकि, इन डोमेन एक दूसरे के साथ लगातार कर रहे हैं, और उनके रिश्तेदार बहुतायत शारीरिक और रोग की शर्तों के तहत कोशिकाओं में संशोधित किया जा सकता है. सबसे अच्छा ज्ञात और ईआर की आमतौर पर स्थानिक अलग डोमेन परमाणु लिफाफा, और चिकनी और किसी न किसी एर रहे हैं, लेकिन, हम और दूसरों ईआर संरचनाओं विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में एक अधिक विस्तृत वास्तुकला और तीन आयामी संगठन के साथ कर रहे हैं कि प्रदर्शन किया और है भी ऐसी हाइपोक्सिया, दवा के रूप में तनावपूर्ण उत्तेजनाओं के माध्यम से प्रेरित किया जा सकता है कि शारीरिक शर्तों के अधीन ऊतकोंप्रशासन, या ईआर निवासी transmembrane प्रोटीन 2,6 की अभिव्यक्ति से अधिक (और उसमें संदर्भ).
हम भी हाल ही में मानव रोगों 1,7 की सेल मॉडल में ऐसी संरचनाओं की उपस्थिति का प्रदर्शन किया है. चिकनी ईआर की खड़ी cisternae से होने वाले वे भी उनके वास्तुकला के आधार पर karmellae, lamellae, और स्फटिकवत् ईआर के रूप में जाना जाता है, वे 2003 6 में संगठित चिकनी जालिका (OSER) का सामूहिक नाम दिया गया है, जो की तरह अपने का आकार, भिन्न हो सकते हैं. कोशिकाओं पूंछ लंगर (टीए) ईआर निवासी प्रोटीन (डी EGFP-ईआर), ट्रांस में GFP के कमजोर dimerizing प्रवृत्ति नाटकीय रूप से ईआर के संगठन और संरचना बदल के साइटोसोलिक क्षेत्र से जुड़े हुए GFP के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे हैं. FRAP और फ्लिप प्रयोगों डी EGFP-ईआर OSERs भीतर फैलाना करने के लिए स्वतंत्र है कि पता चला है, और यह OSER को जालीदार ईआर से चलता रहता है और ठीक इसके विपरीत <तथ्य यह है कि/ उन्हें> समुच्चय आसपास के जालीदार ईआर के साथ लगातार कर रहे हैं कि इंगित करता है. Ultrastructural विश्लेषण हमें nanoscale स्तर पर OSER वास्तुकला और संगठन की एक विस्तृत विवरण के साथ प्रतिदीप्ति डेटा सहसंबंधी करने की अनुमति दी: OSERs हमेशा चिकनी ईआर की बनती cisternae के ढेर से बना रहे हैं, लेकिन इस तरह के नियमित sinusoidal की व्यवस्था के रूप में स्थानिक संगठन के विभिन्न रूपों, हो सकता है सरणियों या whorls, या हेक्सागोनल "बिल्लौर की तरह" ट्यूबलर सरणियों. इन rearrangements वे शारीरिक स्थितियों 9 और ऐसे हाइपोक्सिया 10, दवा उपचार 11, और कैंसर 9 के रूप में निम्नलिखित तनावों के तहत कोशिकाओं में पाया गया है, के रूप में ultrastructural मार्कर के रूप में महत्वपूर्ण क्षमता हो सकती है, जो घन morphologies 8 को जन्म दे.
GFP संलयन प्रोटीन का उपयोग इस पहले प्रदर्शन के बाद, हम औषधीय उपचार 12, asse के जवाब में ईआर डोमेन के प्रसार का विश्लेषण करने के लिए इमेजिंग प्रयोगों में इस्तेमाल कियाएसएस कोशिकाओं 13 में oligomerise के लिए, और उसके pathogenicity 1,8 के लिए प्रासंगिक हो सकता है कि ईआर मूल के intracellular समुच्चय के गठन में एक उत्परिवर्ती, ए एल एस से जुड़े टीए प्रोटीन की भूमिका की जांच करने के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन की प्रवृत्ति. यह (कई neurodegenerative रोगों 14 में होता है) intracellular समुच्चय के गठन विषाक्त उत्परिवर्ती प्रोटीन और आसपास सेल घटकों 15 के बीच बातचीत को रोकने के लिए बनाया गया एक सुरक्षा तंत्र है, हो सकता है कि सुझाव दिया गया है.
इसके बाद जिसका सी टर्मिनल हाइड्रोफोबिक डोमेन ईआर की झिल्ली में डाला जाता है, और उनके गतिशील व्यवहार के विश्लेषण और ईआर डोमेन पर उनकी अभिव्यक्ति के प्रभाव निर्माणों की जांच के लिए ऑप्टिकल और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तरीकों का एक संयोजन का वर्णन है सभ्य कोशिकाओं में वास्तुकला (प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की एक प्रवाह संचित्र के लिए चित्रा 1 देखें).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ईआर फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ प्लाज्मिड, सेल संस्कृति, और अभिकर्मक
- इस अध्ययन में इस्तेमाल प्लाज्मिड चूहा साइटोक्रोम बी के ईआर isoform की पूंछ क्षेत्र को अपनी सी टर्मिनस पर जुड़े हुए GFP के एक बढ़ाया संस्करण के होते हैं (5) एक linker अनुक्रम के माध्यम से (ख के रूप में (5) यहाँ संक्षिप्त). पूंछ क्षेत्र (5), नदी के ऊपर और नीचे की ओर ध्रुवीय दृश्यों से घिरे 17 अवशेषों TMD (Transmembrane डोमेन), (यूपीएस और डीपीएस) सहित देशी बी की trypsin दरार के बाद जुड़े झिल्ली बनी हुई है कि पूरे दृश्य (Pro94-Asp134) शामिल . लिंकर [(Gly) 4 सर्विसेज] 3 द्वारा पीछा Myc मिलान के होते हैं, और पूरे सीडीएनए स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर pCDNA3 की Hind3-Xba1 साइटों में डाला जाता है. इस प्लाज्मिड के निर्माण का ब्यौरा यह GFP-ईआर 16 के रूप में भेजा है, जिसमें पिछले एक प्रकाशन में वर्णित किया गया है.
- 10% feta के साथ पूरक Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में COS-7 कोशिकाओं को विकसितएल गोजातीय सीरम, 2 मिमी एल glutamine, 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 10% सीओ 2.
- अभिकर्मक. निर्माता के रूप में वर्णित प्लेट 3 एक्स 10 5 6 अच्छी तरह से थाली में एक दौर गिलास coverslip पर कोशिकाओं और, अगले दिन, JetPEI प्रणाली के साथ transfect. इष्टतम JetPEI / डीएनए अनुपात का इस्तेमाल किया प्लाज्मिड और सेल लाइन के आधार पर अधिकतम अभिकर्मक दक्षता की स्थापना के लिए परीक्षण किया गया है कि ध्यान दें: हमारे मामले में, एक JetPEI: 2:1 के डीएनए अनुपात 70-80% अभिकर्मक दक्षता की ओर जाता है.
2. लाइव प्रतिदीप्ति confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग
- लाइव सेल इमेजिंग. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं डब्ल्यू / 10% FBS, 2 मिमी एल glutamine, 1% पेन / Strep, 25 मिमी HEPES के साथ पूरक फिनोल लाल, ओ DMEM के साथ भरा 24 मिमी coverslips के लिए एक इस्पात संस्कृति सेल चेंबर में वरीयता प्राप्त थे जिस पर coverslip रखो , photobleaching से नमूने को रोकने के लिए 50 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर cycloheximide और 1:100 OxyFluor. एक SP5 confocal microscopडी GFP-ईआर एक 488 एनएम लेजर और एक 525/50 बैंड पास उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग कल्पना होने के साथ तापमान नियंत्रित सीओ 2 इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2) के साथ सुसज्जित ई, जीना सेल इमेजिंग प्रयोगों के लिए प्रयोग किया जाता है.
- (FRAP) photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली. एक OSER संरचना के लिए इसी ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र ड्रा, और यह (नमूना में 5.5-6 μW, इसी लिए एक 30 मेगावाट आर्गन लेजर का 100%) 20 पुनरावृत्तियों और 488 एनएम का एक संयोजन का उपयोग और 405 एनएम ब्लीच हमारे अनुभव में, कुशल और तेजी से photobleaching की ओर जाता है, (नमूना पर 11.6 μW को इसी 30 मेगावाट डायोड 405 लेजर का 60%,) लेज़रों.
- 10 मिनट (पिक्सेल समय = 1.61 μsec / पिक्सेल) के लिए एक ही फ्रेम हर 10 सेकंड लेने के द्वारा प्रक्षालित ROIs में प्रतिदीप्ति की वसूली रिकार्ड.
- (फ्लिप) photobleaching में प्रतिदीप्ति नुकसान. एक एक OSER संरचना को इसी रॉय, और ऊपर वर्णित के रूप में ब्लीच ड्रा. विरंजन हर 30 सेकंड दोहराया है,और बाद विरंजन छवियों 30 मिनट (पिक्सेल समय = 1.61 μsec / पिक्सेल) के लिए हर 10 सेकंड दर्ज हैं.
- FRAP और फ्लिप विश्लेषण. छवियों के सभी ImageJ सॉफ्टवेयर (विश्लेषण का उपयोग कर रहे हैं http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html ). FRAP प्रयोगों में, प्रक्षालित रॉय के प्रतिदीप्ति वसूली समय और हमेशा समय के साथ लगातार होने की जाँच की है जो प्रक्षालित सेल की कुल प्रतिदीप्ति, सामान्यीकृत पर मापा जाता है.
- फ्लिप प्रयोगों के लिए, प्रक्षालित OSER और पूरे सेल कवर के बाहर एक रॉय आकर्षित. समय के साथ इसके प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने और इमेजिंग खुद की वजह से प्रतिदीप्ति में किसी भी कमी के लिए सही करने के क्रम में एक कड़ा सेल पर तैयार एक रॉय का प्रतिदीप्ति स्तर को मानक के अनुसार.
- प्रयोगों के सभी में, ROIs के फ्लोरोसेंट तीव्रता से (कोशिकाओं के बाहर एक क्षेत्र में निर्धारित) पृष्ठभूमि संकेत घटाया. अंत में, जीआर का उपयोग कर परिणाम साजिशaphPad चश्मे सॉफ्टवेयर.
3. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से Ultrastructural विश्लेषण
अभिकर्मकों के कई की विषाक्तता को देखते हुए, प्रक्रियाओं की सभी एक उपयुक्त प्रयोगशाला पहने बाहर किया जाना चाहिए. एक धूआं हुड के तहत कोट और दस्ताने.
- पेट्री डिश से coverslip को हटाने के बाद, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 0.1 एम cacodylate बफर, 7.4 पीएच में फ़िल्टर्ड 2% glutaraldehyde का उपयोग कर एक monolayer के रूप में पकवान के नीचे, पर हो शेष कोशिकाओं को ठीक.
- एक Teflon खुरचनी का उपयोग कोशिकाओं परिमार्जन और 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूबों में उन्हें स्थानांतरण. 10 मिनट के लिए 9,000 ग्राम पर centrifugation के माध्यम से गोली कोशिकाओं. सतह पर तैरनेवाला निकालें ताजा लगानेवाला जोड़ने, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर छोड़ दें
- बफर के साथ छर्रों धो लें, फिर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए cacodylate बफर में 1% आज़मियम tetroxide का एक समाधान के साथ के बाद तय कर लो.
- MilliQ पानी से कुल्ला, और साथ गुट दाग एन20-60 के बीच मिनट के लिए आसुत जल में 1% uranyl एसीटेट.
- इथेनॉल श्रृंखला (70%, 80%, 90%, 100%, और 10 मिनट प्रत्येक के लिए 100%) बढ़ाने में नमूने निर्जलीकरण, और (15 मिनट प्रत्येक) propylene ऑक्साइड में दो बार संक्षिप्त धो लो.
- (2 घंटे से करने के लिए रातोंरात) propylene ऑक्साइड + EPON (1:1) के मिश्रण में नमूने घुसपैठ.
- कम से कम 24 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर ठीक हो EPON epoxy राल में शामिल करें.
- धारा 60-70 एनएम की मोटाई के साथ वर्गों को प्राप्त करने के लिए एक 45 डिग्री हीरा चाकू से लैस एक ultramicrotome LEICA UC6 का उपयोग कर मैन्युअल रूप से छंटनी की राल ब्लॉक. 300 जाल तांबे ग्रिड पर वर्गों लीजिए.
- Uranyl एसीटेट (20 मिनट) के एक संतृप्त समाधान के साथ ग्रिड पर वर्गों दाग और साइट्रेट (7 मिनट) नेतृत्व, अच्छी तरह से द्वि आसुत फ़िल्टर्ड पानी में उन्हें विसर्जित करके ग्रिड धोने, और उन्हें कमरे के तापमान पर शुष्क करने की अनुमति देते हैं.
- दाग ग्रिड एक Tecnai G2 ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर रहे हैं मनाया, और छवियों को एक Bott का उपयोग कर लिया कर रहे हैं(आम तौर पर 6,000-39,000 एक्स से लेकर) विभिन्न अंतिम आवर्धन पर ओम घुड़सवार सीसीडी कैमरा.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
चित्रा 2 प्रोटीन गतिशीलता का एक उदाहरण FRAP अध्ययन से पता चलता है. डी EGFP-ईआर प्रोटीन की गतिशीलता प्रक्षालित OSERs में photobleaching के बाद तेजी से प्रतिदीप्ति वसूली द्वारा प्रदर्शन किया है. मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, आधे समय और मोबाइल अंश निम्नलिखित monoexponential समीकरण फिटिंग द्वारा मापा प्रयोगात्मक डेटा से प्राप्त किए गए:
एफ (टी) = च पोस्ट + (एफ आरईसी एफ पोस्ट) (1 ए टी / τ)
एफ पद photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति संकेत है जहां, एफ आरईसी पंजीकरण के समय टी, विरंजन के बाद तक पहुँचने और समय लगातार τ है कि अधिकतम प्रतिदीप्ति वसूली मान है.
प्रतिदीप्ति वसूली को बदलने और इसके परिणामस्वरूप, प्रोटीन गतिशीलता विश्लेषण कर सकता है कि संतृप्त पिक्सल के बिना छवियों को प्राप्त करने के महत्व पर ध्यान दें. यह मैंहमेशा ध्यान केंद्रित विमान में छवि अधिग्रहण या छोटे परिवर्तन के दौरान विरंजन के कारण प्रतिदीप्ति तीव्रता विविधताओं पर विचार करने के क्रम में एक ही सेल की कुल प्रतिदीप्ति को प्रक्षालित आरओआई में प्रतिदीप्ति संकेत सामान्य करने के लिए भी आवश्यक है.
Intracellular डिब्बों के बीच निरंतरता का अध्ययन करने के लिए एक फ्लिप प्रयोग का एक उदाहरण 3 चित्र में दिखाया गया है. OSER डोमेन लगातार प्रक्षालित है जब ईआर की प्रगतिशील खाली करके प्रदर्शन के रूप में OSERs शारीरिक रूप से ईआर के आराम के साथ जुड़े हुए हैं.
एक उचित विश्लेषण के लिए, संतृप्त पिक्सल के अधिग्रहण (ऊपर देखें) से बचा जाना चाहिए, इसके अलावा, अधिग्रहण मापदंडों छवि अधिग्रहण की वजह से photobleaching से बचने के लिए जितना संभव हो कम लेजर शक्तियों के साथ स्थापित किया जाना चाहिए. इस कारण से यह दृढ़ता से छवि को प्रक्षालित सी के प्रतिदीप्ति संकेत मानक के अनुसार करने के लिए उपयोग किया जाएगा कि एक ही क्षेत्र में एक कड़ा सेल की सिफारिश की हैपक्ष.
सभी प्रयोगों के कारण प्रोटीन जैवसंश्लेषण के लिए किसी भी ईआर प्रतिदीप्ति संकेत में वृद्धि (और फलस्वरूप कुल प्रतिदीप्ति) से बचने के लिए, cycloheximide एक अनुवाद अवरोध करनेवाला की उपस्थिति में किया जाना है.
ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी डी EGFP-ईआर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट संवर्धित कोशिकाओं में मनाया फ्लोरोसेंट समुच्चय चिकनी के धब्बे का प्रतिनिधित्व करते हैं कि प्रदर्शन किया और स्थानिक अपने पैटर्न के आधार पर वर्गीकृत अच्छी तरह से परिभाषित 3 डी geometries में खुद को संगठित कि ईआर cisternae चपटा: अक्सर रेखीय या घुमावदार ढेर ( sinusoidal ईआर के क्षेत्रों के साथ निरंतर हो सकता है कि परमाणु लिफाफा,) नहीं दिखाया (आंकड़े -4 ए और बी) (चित्रा -4 ए) के साथ जुड़े हैं, कुछ क्षेत्रों में झिल्ली एक वर्ग या हेक्सागोनल समरूपता (स्फटिकवत् ईआर साथ lattices में आयोजन किया जाता है, दिखाया नहीं ). निकटस्थ cisternae की एक पतली परत से अलग हो रहे हैं थोड़ा इलेक्ट्रॉनसघन कोशिका द्रव्य मोटी के बारे में 11 एनएम समुच्चय है कि आसपास के कोशिका द्रव्य के साथ निरंतर है.
चित्रा 1. प्रयोगात्मक प्रक्रिया का चार्ट प्रवाह. संवर्धित कोशिकाओं पहले ब्याज की फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन व्यक्त खत्म करने के क्रम में jetPEI (प्रोटोकॉल देखें) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट रहे हैं. 24 घंटे के बाद, लाइव ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं कल्पना कर रहे हैं और FRAP और फ्लिप प्रयोगों एक नियंत्रित तापमान सीओ 2 इनक्यूबेटर से लैस एक confocal खुर्दबीन का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं, और दर्ज की छवियों का निर्यात किया और उपयुक्त सॉफ्टवेयर (जैसे ImageJ) का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं. Ultrastructural विश्लेषण के लिए, कोशिकाओं, तय pelleted और EPON epoxy राल ब्लॉक में एम्बेडेड रहे हैं. Ultrathin अनुभागों सी पर एकत्र, एक हीरे की चाकू का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैंopper ग्रिड, और एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के नीचे देखा. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. FRAP प्रयोग क्षणिक डी EGFP-ईआर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट COS-7 कोशिकाओं का उपयोग कर. ए) दो OSER संरचनाओं (लाल ROIs) प्रक्षालित थे, और प्रतिदीप्ति वसूली समय के साथ दर्ज की गई थी. साफ प्रतिदीप्ति वसूली 1 मिनट के बाद विरंजन पता लगाया जा सकता है और संकेत आगे बढ़ जाती 4 मिनट बाद (पैमाने बार 10 माइक्रोन) ख):. ठीक होने के आधे समय दिखा FRAP प्रयोग के मात्रात्मक विश्लेषण और डी EGFP के मोबाइल अंश ईआर प्रोटीन. सीएलबड़ा आंकड़ा देखने के लिए ick
चित्रा 3. क्षणिक डी EGFP-ईआर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट COS-7 कोशिकाओं का उपयोग फ्लिप प्रयोग. ए) लाल आरओआई ने संकेत दिया एक OSER () की सतत विरंजन पीले आरओआई ने संकेत दिया ईआर के बाकी हिस्सों में और एक ही कक्ष के भीतर अन्य OSER संरचनाओं में प्रतिदीप्ति में एक प्रगतिशील कमी () का कारण बनता है. पीले तीर प्रतिदीप्ति संकेत समय के साथ निरंतर है, जिसमें एक कड़ा सेल के एक हिस्से को इंगित करता है. (स्केल बार 10 माइक्रोन). बी) फ्लिप प्रयोग के मात्रात्मक विश्लेषण. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए क्लिक करें
चित्रा 4. निर्धारण और एम्बेड करने के बाद, OSER संरचनाओं प्रतिदीप्ति ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से पता लगाया जा सकता है जिसमें डी EGFP-ईआर के उच्च स्तर व्यक्त कोशिकाओं एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के माध्यम से मनाया गया. खड़ी cisternae और लहरदार sinusoidal झिल्ली से मिलकर OSER युक्त एक सेल के cytoplasm के एक हिस्से के क) कम बढ़ाई देखें. राइबोसोम सबसे बाहरी cisternae (तीर और इनसेट) की ही झिल्ली को सजाने जबकि mitochondria (एम), OSER संरचनाओं के आसपास एकत्रित देखा जा सकता है. झिल्ली के बीच 11 एनएम मोटी इलेक्ट्रॉन घने अंतरिक्ष कोशिका द्रव्य (तीर और इनसेट) (एल = लाइसोसोम / (ऑटो) phagosomes) के साथ निरंतर है (पैमाने बार 1.5 माइक्रोन, इनसेट 0.25 माइक्रोन). ख) एक OSER का गठन किया जा सकता है सतत या fragme हो सकता है कि चपटी ईआर cisternae यानी ढेर: तहदार ईआर द्वारापतली वर्गों में उनकी उपस्थिति में nted. ढेर की सबसे बाहरी cisternae से नवोदित vesicles कभी कभी (तारांकन) (प्रधानमंत्री, प्लाज्मा झिल्ली) (स्केल बार 150 एनएम) मनाया जा सकता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इस पत्र में वर्णित प्रोटोकॉल और इमेजिंग दृष्टिकोण जीवित कोशिकाओं के ईआर में निवासी ट्रांसफ़ेक्ट टीए फ्लोरोसेंट प्रोटीन का वितरण और गतिशीलता की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है. हम भी ultrastructural विश्लेषण के माध्यम से इस subcellular डिब्बे की वास्तुकला पर इन प्रोटीनों की अभिव्यक्ति के प्रभाव का विश्लेषण किया है.
रहते सेल confocal इमेजिंग और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के संयोजन प्रोटीन की गतिशील संपत्तियों की जांच के लिए एक बहुत शक्तिशाली साधन है प्रतिनिधित्व करता है, और प्रोटीन समारोह के विषय में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकता है. वर्णित विधियों समय (आमतौर पर काम के तीन दिन) उपभोग नहीं कर रहे हैं, और छवि के अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए कई उपयोगकर्ता के अनुकूल सॉफ्टवेयर अनुप्रयोगों के विकास photobleaching आधारित, जीना सेल इमेजिंग अपेक्षाकृत सरल बना देता है.
इन तकनीकों की मुख्य सीमा फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन का इस्तेमाल होता है क्योंकिफ्लोरोसेंट टैग ब्याज की प्रोटीन की उचित तह और / या विधानसभा को प्रभावित कर सकते हैं. इसके अलावा, अधिक अभिव्यक्ति ट्रांसफ़ेक्ट, fluorescently टैग प्रोटीन के व्यवहार को बदल सकते हैं, और इसलिए अंतर्जात प्रोटीन का असली गुण शामिल न हो, लेकिन, इस अभिव्यक्ति के स्तर हो सकता है जिसमें inducible और stably ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का उपयोग करके दूर किया जा सकता है ठीक अंतर्जात प्रोटीन 1,7 के लोगों के साथ बराबर के स्तर को प्राप्त करने के संग्राहक. oligomerise लिए एफपीएस की प्रवृत्ति व्यापक रूप से प्रलेखित किया गया है और काफी chimeric प्रोटीन का व्यवहार (यानी कैनेटीक्स, अवांछित प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत और समुच्चय के गठन) को बदल सकता है. अनुकूलित मोनोमेरिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग इसलिए 17 विचार किया जाना चाहिए.
प्रतिदीप्ति और photobleaching का उपयोग कर गतिशील इमेजिंग अध्ययन का एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू कुशलतापूर्वक प्रतिदीप्ति ब्लीच और प्रतिदीप्ति फिर से मापने के लिए आवश्यक समय हैcovery (और इस प्रकार प्रोटीन गतिशीलता) ठीक है, यह भी रॉय और स्थानीय सेल मोटाई के क्षेत्र पर निर्भर करता है. एक दिया GFP टैग प्रोटीन एक उच्च प्रसार गुणांक है, तो प्रसार विरंजन के दौरान पाए जाते हैं और इस प्रकार वसूली समय माप के साथ हस्तक्षेप कर सकता है. तेजी से और कुशल विरंजन प्राप्त करने के लिए, यह दृढ़ता से एक समारोह "में ज़ूम" (यदि उपलब्ध हो) और एक से अधिक लेजर लाइन इस्तेमाल किया जा सिफारिश की है. एक तेजी से स्कैन मॉड्यूल (यानी एक गुंजयमान स्कैनर) का उपयोग बहुत एक प्रयोग की वसूली चरण के दौरान इमेजिंग की गति में सुधार कर सकते हैं, हमारे हाथ में यह भी काफी विरंजन क्षमता कम कर देता. हालांकि, (जैसे एक समर्पित photobleaching डिवाइस से सुसज्जित एक कताई डिस्क के रूप में) वैकल्पिक स्कैनिंग सिस्टम, और अधिक शक्तिशाली लेजर विरंजन दक्षता और अधिग्रहण की गति दोनों सुधार कर सकते हैं.
FRAP और फ्लिप प्रयोगों में इस्तेमाल सबसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन प्रतिवर्ती photobleaching और BLI के कुछ डिग्री दिखानेमात्रात्मक विश्लेषण करते समय nking कि विचार किया जाना चाहिए. फ्लोरोसेंट और अंधेरे राज्यों के बीच उतार चढ़ाव मिनट समय पैमाने पर करने के लिए दूसरे में होते हैं. EGFP के लिए, यह विरंजन प्रयोगों के दौरान, प्रतिदीप्ति विविधताओं इस प्रकार वर्तमान प्रोटोकॉल में इस घटना नगण्य है, अणुओं के कम से कम 10% शामिल हो सकता है कि दिखाया गया है. सभी शर्तों को स्थिर रखा जाता है, तो इस परिणाम में एक निरंतर पूर्वाग्रह को लागू करेगा. अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन प्रतिवर्ती अंश (यानी YFP) काफी अधिक है, या photobleaching उलटने का पता लगाने और मूल्यांकन करने के लिए जो में उपयोग किया जाता है, तो इस पूरे जीवित कोशिका में photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली को मापने के द्वारा किया जा सकता है, वसूली मनाया जाता है अगर यह कर सकते हैं केवल उलटने 18 photobleaching का नतीजा हो.
प्रयोगों के दौरान प्रकाश की संभावित विषाक्तता photobleaching मजबूत प्रकाश की आवश्यकता है, विशेषकर इसलिए क्योंकि एक और महत्वपूर्ण कारक है. यह wel हैएल उत्साहित fluorophores विभिन्न intracellular प्रक्रियाओं और यहां तक कि सेल व्यवहार्यता 19 प्रभावित कर सकते हैं कि मुक्त कण के उत्पादन के लिए ऑक्सीजन के साथ प्रतिक्रिया करते हैं कि जाना जाता है, और इसलिए यह कुशल विरंजन और न्यूनतम phototoxicity के बीच एक संतुलन स्थापित करने के लिए आवश्यक है, इसके अलावा, सेल व्यवहार्यता हमेशा जाँच की जानी चाहिए जीना सेल इमेजिंग प्रयोगों के बाद. छोटे रिकॉर्डिंग समय को देखते हुए, हम इस पत्र में वर्णित उदाहरण में छोटी तरंग दैर्ध्य प्रकाश (405 एनएम) के genotoxic प्रभाव पर विचार नहीं किया है, लेकिन एक लंबे समय तक प्रयोग की जरूरत है, तो, एक 405 एनएम लेजर लाइन नहीं किया जाना चाहिए.
हम क्योंकि OSER वास्तुकला की विषम प्रकृति और हम संभव के रूप में कई कोशिकाओं (और संरचनाओं) का पालन करना चाहता था कि इस तथ्य के संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए एक correlative दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए नहीं चुना है. कोशिकाओं में प्रोटीन समुच्चय के ठीक संरचना की विविधता विभिन्न रोगों की एक प्रमुख विशेषता हो सकता है और हम एसए का एक व्यापक रेंज प्राप्त करने में रुचि रखते थेmples, एक correlative दृष्टिकोण इसी अवधि के समय के दौरान कम घटनाओं के अवलोकन की अनुमति देता है, जबकि. आसानी से (जैसे कम प्रमुख ईआर उप डोमेन के रूप में) या (जैसे सूक्ष्म इंजेक्शन कोशिकाओं के रूप में) कोशिकाओं की एक सीमित संख्या में नहीं पहचाना जा सकता है कि संरचनाओं में घटनाओं की जांच करते हैं, तथापि, correlative प्रकाश इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (भूखों मरना) पहली पसंद किया जाना चाहिए. यह अन्यथा noncorrelatively OSER संरचनाओं का अवलोकन करने की संभावना काफी सीमित है, (कोशिकाओं का कम से कम 30% ट्रांसफ़ेक्ट थे) हमारे प्रयोगों अभिकर्मक दक्षता के एक उच्च स्तर की विशेषता थे कि ध्यान देने योग्य है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखक इस लेख के प्रकाशन में अपनी सहायता और समर्थन के लिए Fondazione Filarete के लिए आभारी हैं. हम भी Tecnai G2 संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के इस्तेमाल के लिए सेंट्रो Europeo di Nanomedicina धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 41966029 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) w/o phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10270106 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine 200 mM solution | Invitrogen | 25030-024 | |
| jetPEI | Polyplus Transfection | PP10110 | |
| OxyFluor | Oxyrase Inc. | OF-0005 | |
| Glutaraldehyde Grade I | Sigma Aldrich | G5882 | |
| Sodium Cacodylate Trihydrate | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Osmium Tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Science | 19150 | |
| Uranyl Acetate Dihydrate | Sigma Aldrich | 73943 | slightly radioactive |
| Propylene Oxide | Sigma-Aldrich | 82320 | |
| EPON embedding medium kit | Sigma-Aldrich | 45359-1EA-F | |
| Lead Citrate | Electron Microscopy Science | 17800 | |
| Bench top centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Spectral Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CO2 Microscope Cage Incubation System | OkoLab | ||
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 ° | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G2 | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc | ||
| Steel culture cell chamber for 24 mm coverslip | Bioscience Tools | CSC-25 | |
| Electron Microscopy grids | Electron Microscopy Science | G300Cu |
References
- Fasana, E., et al. A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum. FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).
- Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux. Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).
- Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum. J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).
- Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. Bi-directional protein transport between the ER and. 20, 87-123 (2004).
- Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).
- Papiani, G., et al. Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome. J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).
- Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization. J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).
- Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. The dynamic ER: experimental approaches and current questions. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).
- Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells. Neuron. 12, 327-342 (1994).
- Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital. Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).
- Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells. J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13, 643-649 (2012).
- Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres. J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic proteins in neurodegenerative disease. Science. 296, 1991-1995 (2002).
- Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases. EMBO J. 27, 336-349 (2008).
- Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways. Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
- Michida, T., et al. Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats. Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).
