Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Nucleofection من القوارض Neuroblasts لدراسة الهجرة أرومة عصبية doi: 10.3791/50989 Published: November 12, 2013
* These authors contributed equally

Summary

الهجرة أرومة عصبية هو خطوة حاسمة في تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة. وصف بروتوكول هنا يمكن أن تستخدم للتحقيق في دور المنظمين مرشح للهجرة أرومة عصبية من خلال توظيف DNA / RNA الصغيرة دبوس (shRNA) nucleofection ومقايسة 3D الهجرة مع neuroblasts معزولة عن القوارض بعد الولادة منقاري تيار المهاجرة.

Abstract

منطقة subventricular (SVZ) الموجود في الجدار الجانبي من البطينين الوحشي يلعب دورا أساسيا في تكوين الخلايا العصبية الكبار. في هذه المنطقة المحظورة من الدماغ، والخلايا الجذعية العصبية تتكاثر وتولد باستمرار neuroblasts التي تهاجر بشكل طفيف في سلاسل على طول تيار المهاجرة منقاري (RMS) لتصل إلى البصلة الشمية (OB). مرة واحدة في OB، neuroblasts التحول إلى الهجرة شعاعي ثم تفرق في الخلايا العصبية الناضجة قادرة على أن تدرج في الشبكة العصبية الموجودة مسبقا. الهجرة أرومة عصبية الصحيح هو خطوة أساسية في تكوين الخلايا العصبية، وضمان نضوج وظيفية الصحيح من الخلايا العصبية الوليد. ونظرا لقدرة neuroblasts SVZ المستمدة من استهداف المناطق المصابة في الدماغ، والتحقيق في الآليات داخل الخلايا الكامنة وراء الحركة التي لن تعزز فقط فهم تكوين الخلايا العصبية ولكن أيضا يمكن أن تعزز وضع استراتيجيات neuroregenerative.

يصف هذا المخطوط مفصلةبروتوكول لترنسفكأيشن من القوارض الأولية RMS neuroblasts بعد الولادة وتحليل حركية بهم باستخدام 3D في المختبر فحص الهجرة تلخص طريقتهم في الهجرة لوحظت في الجسم الحي. ويمكن لكل من الجرذان والفئران neuroblasts تكون بسرعة وكفاءة transfected عبر nucleofection مع أي الحمض النووي البلازميد، دبوس صغير (ش) RNA أو قصيرة التدخل (الاشتراكية) oligos RNA استهداف الجينات في المصالح. لتحليل الهجرة، وreaggregated الخلايا nucleofected في 'قطرات شنقا' وبعد ذلك جزءا لا يتجزأ في مصفوفة ثلاثية الأبعاد. Nucleofection في حد ذاته لا يضعف بشكل كبير من الهجرة من neuroblasts. ويمكن أيضا العلاج الدوائي من neuroblasts nucleofected وreaggregated أن يؤديها لدراسة دور مسارات الإشارات التي تنطوي عليها الهجرة أرومة عصبية.

Introduction

في الثدييات بعد الولادة الدماغ، وتوليد خلايا عصبية جديدة (تكوين الخلايا العصبية) ويحدث في جميع مراحل الحياة ويقتصر على اثنين من منافذ العصبية: منطقة subventricular (SVZ) من البطينين الوحشي والمنطقة جزئي التحبب من التلفيف المسنن من الحصين 1. وقد أظهرت العديد من الدراسات الحديثة على الدور الهام للتكوين الخلايا العصبية الكبار في تسهيل مهام التعلم والذاكرة 2،3. علاوة على ذلك، دليل على انتشار وتجنيد الأسلاف العصبية التالية إصابات الدماغ 4-7 يثير إمكانية تفعيل الدوائية من تكوين الخلايا العصبية في إصلاح العصبية.

وينظم تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة بدقة في جميع مراحلها، والتي تشمل انتشار العصبية السلف، والهجرة، والتمايز والبقاء، والتكامل متشابك النهائي من الخلايا العصبية المولود حديثا 8. الأسلاف العصبية (neuroblasts) المشتقة من الخلايا الجذعية في SVZ الهجرة على مسافة كبيرة من خلال المهاجرة منقاريتيار (RMS) نحو البصلة الشمية (OB) حيث تنضج الخلايا العصبية الوظيفية في 9. neuroblasts المهاجرة في الغالب أحادي القطب، مع خلايا الجسم ممدود تمتد عملية رائدة واحد. هذه الخلايا تتحرك في سلاسل بطريقة جماعية، ينزلق أكثر من 10 آخرين. الهجرة هي خطوة حاسمة لنضوج اللاحقة من الأسلاف SVZ المستمدة من الخلايا العصبية الوظيفية في 11 وتسيطر عليها عوامل متعددة والجزيئات التوجيه بما في ذلك: polysialylated العصبية جزيء التصاق الخلية (PSA-NCAM) 12، 13 Ephrins، لل integrins 14، 15 الشقوق، عوامل النمو 16 و 17 الناقلات العصبية، ولكن الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه العملية ليست مفهومة تماما. وسوف تحقق في مسارات الإشارات داخل الخلايا تنظيم الهجرة أرومة عصبية ليس فقط توفير فهم أفضل لتكوين الخلايا العصبية الكبار، ولكن سوف تسهم أيضا في تطوير علاجية جديدةالنهج لتعزيز إصلاح الدماغ.

يصف هذا المخطوط بروتوكول مفصلة لدراسة دور المنظمين مرشح للهجرة أرومة عصبية في المختبر باستخدام nucleofection ومقايسة الهجرة 3D. Nucleofection هو أسلوب ترنسفكأيشن الخلية يعتمد على طريقة محسنة من التثقيب الكهربائي. خلية من نوع التيار الكهربائي محددة والحل nucleofection السماح بنقل الجزيئات polyanionic مثل الحمض النووي وناقلات shRNA وأليغنوكليوتيد سيرنا مباشرة في نواة الخلية وترنسفكأيشن تصريح تقسيم ببطء أو ميتوتيكلي الخلايا الخاملة مثل الخلايا العصبية الجنينية والثدييات 18. هذا الأسلوب هو سريعة وسهلة نسبيا لأداء ونتائج في ترنسفكأيشن تكرار للغاية من مجموعة واسعة من أنواع الخلايا بما في ذلك الخلايا العصبية الابتدائية وneuroblasts 19-21.

تفكك الأنسجة RMS يسمح عزلة neuroblasts المهاجرة، والتي يمكن nucleofected بنجاح مع الحمض النووي / SHRناقلات NA أو oligos سيرنا استهداف الجينات في المصالح. nucleofection التالية، يتم reaggregated neuroblasts في شنقا قطرات وجزءا لا يتجزأ في وقت لاحق في Matrigel مصفوفة ثلاثية الأبعاد. هذه الظروف تسمح neuroblasts إلى الهجرة من المجاميع الخلية تلخص وضع الهجرة لوحظت في الجسم الحي، وبالتالي توفير نظام نموذجا ممتازا للتحقيق في مسارات الإشارات التي تنطوي عليها الهجرة وأرومة عصبية لتقييم تأثير العلاجات الدوائية على حركية هذه الخلايا.

Protocol

هذا الإجراء هو وفقا للوائح وزارة الداخلية في المملكة المتحدة (قانون الإجراءات العلمية الحيوانية، 1986). ينبغي أن تتبع العلماء المبادئ التوجيهية الموضوعة والتي وافقت عليها الهيئات التنظيمية الحيوان المؤسسية والوطنية.

1. تشريح والتفكك من الجرذ RMS Neuroblasts

  1. إعداد الحلول المطلوبة للتشريح والتفكك RMS:

تشريح المتوسطة (100 مل)
محلول الملح هانك المتوازن (HBSS) - 98.5 مل
5 M HEPES الرقم الهيدروجيني 7،4-0،5 مل
البنسلين الستربتوميسين (10،000 وحدة / مل و 10،000 ميكروغرام / مل) - 1 مل

تفارق المتوسطة (2 مل)
HBSS - 1.760 مل
10X التربسين (2.5٪) - 200 ميكرولتر
DNAse1 (1 ملغ / مل) - 40 ميكرولتر

Dulbecco التعديل النسر متوسطة (DMEM) + 10٪ الجنين مصل العجل (FCS) (40 مل)
DMEM -36 مل
FCS - 4 مل

متوسطة كاملة (12 مل)

متوسطة Neurobasal - 11.46 مل
B27 الملحق - 250 ميكرولتر
L-الجلوتامين (200 ملي) - 125 ميكرولتر
الجلوكوز (45٪) - 165 ميكرولتر

2. فلتر تعقيم٪ السفح DMEM + 10 والمتوسطة كاملة وpreequilibrate لهم في 37 ° C / 5٪ CO 2 الحاضنة.

  1. تشريح
    1. تضحية القمامة الفئران P6-P7 (حوالي 12 الجراء) من قبل خلع عنق الرحم وقطع رأس مع مقص.
    2. إجراء شق في الجلد الأمامي الخلفي على طول الدرز منتصف السهمي من الأنف إلى المخيخ بشفرة المشرط. سلخ الجلد وتكرار نفس شق على طول الجمجمة.
    3. بلطف إزالة اللوحات الجمجمة مع ملقط وإزالة بعناية الدماغ مع ملعقة، مع الحرص على تضمين بصيلات الشم.
    4. خفض ثالث أكثر الذيلية من الدماغ وتخلص منه.
    5. ختم عشره أنسجة المخ إلى 1.4 ملم شرائح سميكة الاكليلية باستخدام المروحية الأنسجة.
    6. وضع شرائح في الأطباق التي تحتوي على تشريح الباردة المتوسطة وفصلها بعناية باستخدام إبرة.
    7. وRMS يظهر على شكل الثلاثي، منطقة شفافة في وسط أقسام OB ونتيجة ل، منطقة دائرية صغيرة في أكثر شرائح الدماغ الذيلية. قطع RMS من كل شريحة بسكين المجهرية، مع الحرص على تجنب بما في ذلك الأنسجة المحيطة. في الفئران الوليدة P7، وعادة ما ~ 8 شرائح الأكثر منقاري (بما في ذلك OB) تحتوي على RMS.
    8. جمع شظايا RMS مع البلاستيك ماصة باستير ووضعها في صحن صغير يحتوي على تشريح الباردة المتوسطة على الجليد.
    9. عند تشريح كاملة، نقل شظايا RMS في أنبوب 15 مل مع ماصة بلاستيكية. ترك شظايا ليستقر في الجزء السفلي من الأنبوب.
  2. تفكك
    1. استبدال المتوسطة تشريح مع 2 مل من التفكك المتوسط.
    2. يسحن شظايا RMS بواسطة بلطف عipetting تعليق جزء صعودا وهبوطا حول 10X باستخدام ماصة P1000.
    3. ترك الأنبوب مع شظايا الأنسجة في 37 ° C حمام الماء لمدة 2 دقيقة.
    4. ماصة الحل مرة أخرى 10X والتأكد من أن شظايا وقد فصل (ينبغي أن تصبح تعليق غائم).
    5. إبطال نشاط التربسين وذلك بإضافة 5 مل من prewarmed DMEM + 10٪ FCS.
    6. الطرد المركزي تعليق خلية في 433 x ج لمدة 5 دقائق.
    7. في غضون ذلك قسامة المبلغ المطلوب من سيرنا / الحمض النووي في أنابيب إيبندورف (عادة 3-5 DNA ميكروغرام / shRNA أو 5-9 ميكروغرام سيرنا بنسبة ضئيلة في nucleofection، ولكن كمية الحمض النووي / سيرنا قد تتطلب الأمثل).
    8. إزالة الزائدة المتوسطة و resuspend بيليه الخلية من قبل pipetting لطيف في 5 مل من prewarmed DMEM + 10٪ FCS.
    9. تنفيذ عدد خلايا. نتوقع ~ 1 × 10 6 خلايا في الفئران الجرو الدماغ. وثمة حاجة إلى الحد الأدنى من 2.5 × 10 6 خلايا لكل nucleofection، في حينوتتحقق أفضل النتائج باستخدام 3-4 × 10 6 خلايا في nucleofection.
    10. الطرد المركزي تعليق خلية في 433 x ج لمدة 5 دقائق. تأكد من إزالة أكبر قدر ممكن المتوسطة.

2. Nucleofection

  1. في resuspend فورا بيليه خلية في الفئران (الماوس أو إذا باستخدام خلايا فأر) الخلايا العصبية حل nucleofection المحتضنة سابقا في درجة حرارة الغرفة. استخدام 100 ميكرولتر لكل nucleofection ملاحظة: عادة القمامة الفئران من 12 الجراء هي كافية لتنفيذ 4 nucleofections والقمامة الماوس (12 الجراء) كافية لأداء nucleofections 2.
  2. نقل 100 ميكرولتر من تعليق خلية لكل أنبوب إيبندورف تحتوي على سيرنا / الحمض النووي والمزيج بلطف 2-3X من قبل pipetting مع ماصة P200.
  3. إضافة نموذج (cell-DNA/siRNA التعليق) إلى الجزء السفلي من nucleofectioncuvette، مع الحرص على تجنب الفقاعات.
  4. Nucleofect باستخدام برنامج G-013 (للخلايا الفئران) أو O-005 (لخلايا فأر). واحد nucleofection يستغرق حوالي 5 ثانية.
  5. بسرعة إضافة 1 مل من prewarmed DMEM + 10٪ FCS إلى عينة nucleofected.
  6. كرر الخطوات من 2.4 و 2.5 لجميع العينات الأخرى. ملاحظة: لأفضل النتائج، يجب إجراء nucleofection بأكمله لن يدوم أكثر من 5 دقائق.
  7. نقل كل عينة إلى أنبوب 15 مل تحتوي على 5 مل من prewarmed DMEM + 10٪ FCS باستخدام ماصة بلاستيكية المقدمة من عدة nucleofection. تجنب نقل أي حطام الخلوية في أنبوب.
  8. عينات الطرد المركزي في 433 x ج لمدة 5 دقائق.
  9. إزالة بعناية كل المتوسطة الزائدة و resuspend بيليه في 25-30 ميكرولتر من prewarmed DMEM + 10٪ FCS باستخدام ماصة P20. لا تستخدم أكثر من 30 ميكرولتر من المتوسط.
  10. ماصة التعليق كشرط قطرة على الجانب الداخلي من غطاء طبق P35.
  11. عكس غطاء على طبق P35 يحتوي على 2 مل من المتوسط ​​كاملة (انظر أيضا الشكل 1).
  12. ترك في الحاضنة (37 درجة مئوية / 5٪ CO 2) في للا يقل عن 5 ساعة وتصل إلى 7 ساعة. أطول فترة حضانة يسمح إعادة تجميع أفضل من مجموعات الخلايا.
  13. نقل قطرات شنقا من الغطاء في المتوسط ​​كاملة في طبق باستخدام ماصة P1000 مع خفض الحافة.
  14. احتضان عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة لnucleofections DNA و 48 ساعة لnucleofections سيرنا / shRNA.

3. تضمين

  1. إعداد المتوسطة كاملة (25 مل) وpreequilibrate ذلك عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 لبضع ساعات.
  2. اخراج مأخوذة المجمدة من مصفوفة الغشاء القاعدي من -80 ° C الفريزر وذوبان الجليد على الجليد في غرفة باردة.
  3. لكل nucleofection إعداد الطبق 6 سم تحتوي على ما يصل إلى ثمانية 13 ملم coverlips العقيمة.
  4. وضع الأطباق على الجليد مربع مغطاة تتشبث فيلم. فمن المهم للحفاظ لل coverslips بارد لمنع تصلب مصفوفة أثناء إجراء التضمين.
  5. للحفاظ على الرطوبة، ووضع شريط من الأنسجة رطبة داخل صحن 15 سم أن ثسوء استخدامها لاستيعاب ما يصل إلى ثلاثة أطباق 6 سم تحتوي على neuroblasts المضمنة.
  6. إضافة المتوسطة كاملة إلى مصفوفة إذابة في نسبة 01:03. على سبيل المثال، مزيج 40 ميكرولتر من المتوسطة كاملة مع 120 ميكرولتر من المصفوفة من قبل pipetting. هذا المبلغ من مصفوفة كافية لتضمين المجاميع على ثمانية 12 ملم coverslips.
  7. نقل مجموعات الخلايا reaggregated إلى أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 433 x ج لمدة 5 دقائق.
  8. إزالة الزائدة المتوسطة و resuspend بيليه في 10 ميكرولتر من المتوسطة كاملة.
  9. وضع 2 ميكرولتر من تعليق خلية الكلي على كل ساترة العقيمة وإضافة 18 ميكرولتر من المصفوفة / كاملة خليط المتوسطة. استخدام غيض ماصة لنشر مصفوفة على ساترة بأكمله.
  10. وضع على الفور 6 سم صحن يحتوي لل coverslips في صحن 15 سم وتترك في الحاضنة (37 درجة مئوية / 5٪ CO 2) لمدة 15-20 دقيقة. عندما عزز المصفوفة، إضافة بلطف 5 مل المتوسطة كاملة لكل 6 سم أخذ الطبق الرعاية لدفعأسفل أي ساترة العائمة مع طرف ماصة.
  11. احتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 للسماح neuroblasts تهاجر من المجاميع الخلية.

4. 3D الهجرة الفحص

  1. إعداد الحلول المطلوبة للالمناعية.
    1. إعداد الحل كتلة:
      الحل كتلة الماعز (50 مل)
      الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) - 5 مل
      مصل الماعز - 7.5 مل
      10٪ تريتون X-100 - 1.5 مل
      BSA - 50 ملغ
      H 2 O - 36 مل
    2. مرشح وتخزينها في 4 درجات مئوية.
    3. إعداد الحل تحديد:
      تحديد الحل (100 مل)
      بارافورمالدهيد (PFA) - تنبيه 4 ز: دائما التعامل مع PFA تحت غطاء محرك السيارة
      السكروز - 20 غ (اختياري)
      برنامج تلفزيوني يصل إلى 100 مل
    4. على طبق ساخن وتحت التحريك المستمر بحل PFA في 80 مل الحفاظ على برنامج تلفزيوني في 65 درجة مئوية.
    5. مرة واحدة وقد حل PFA، إضافة 20 غرام من السكروز.
    6. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى7.4 (عادة عن طريق إضافة 60 ميكرولتر 1 ~ M هيدروكسيد الصوديوم في 100 مل من محلول).
    7. إحضار إلى وحدة تخزين ما مجموعه 100 مل مع برنامج تلفزيوني.
  2. المناعية
    1. وضع coverslips في 24 لوحة جيدا.
    2. شطف coverslips مع PBS 2X.
    3. إصلاح المجاميع أرومة عصبية RMS مع الحل تحديد لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. شطف coverslips مع PBS 3X (5 دقيقة / غسيل - على منصة هزاز).
    5. منع لمدة 30-60 دقيقة مع كتلة الحل الماعز.
    6. تمييع الأجسام المضادة الأولية في الماعز حل كتلة واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. (إذا رغبت في ذلك، phalloidin الفلورسنت (1:400) وهويشت صبغ (1:10،000) ويمكن أيضا أن يضاف إلى حل الأجسام المضادة الأولية لتصور أكتين الخيطية ونوى).
    7. شطف coverslips مع PBS 3X (5 دقيقة / غسيل).
    8. تمييع الأجسام المضادة الثانوية الماعز في حل كتلة واحتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    9. شطف coversliملاحظة 3X مع برنامج تلفزيوني (5 دقيقة / غسيل)
    10. جبل coverslips مع الفلورسنت المتوسطة المتزايدة وتترك لتجف بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
  3. تحليل الهجرة
    1. التقاط الصور من RMS المجاميع أرومة عصبية ثابتة مع المجهر الفلورسنت باستخدام الهدف 10X. تشمل شريط النطاق في صورة العينة.
    2. لإعداد مقياس لتقدير وقياس حجم شريط في الصورة عن طريق اختيار أداة "خط مستقيم" على شريط الأدوات يماغيج.
    3. اختر الخيار 'تحليل' وانقر على 'تعيين نطاق'.
    4. في إطار نطاق تعيين "مسافة المعروف 'ووضع علامة في مربع' العالمية 'للحفاظ على نفس الإعدادات لكافة القياسات.
    5. استخدام أداة "خط مجزأة" على شريط الأدوات يماغيج لقياس المسافة من حافة مجموعها إلى أبعد أرومة عصبية هاجر في 6 قطاعات مختلفة في جميع أنحاء المجموعة بأكملها (الشكل 3B). تنظر AG معزولة فقطgregates للتحليل.
    6. حساب مسافة متوسط ​​الهجرة من القيم التي تم الحصول عليها 6 لكل الكلي.
    7. قياس 10-20 المجاميع لكل حالة في كل المستقلة نتائج التجربة وبركة من حد أدنى من ثلاث تجارب مستقلة. وتشمل دائما السيطرة nucleofection (على سبيل المثال. GFP أو ركلات الترجيح السيطرة / سيرنا).

Representative Results

Neuroblasts يمكن عزل بنجاح من تشريح الأنسجة RMS (الشكل 1A) وجزءا لا يتجزأ في مصفوفة ثلاثية الأبعاد. الخلايا المعزولة من الفئران أو الماوس إما RMS ما بعد الولادة هي immunopositive لعلامات أرومة عصبية المهاجرة، مثل doublecortin (DCX)، βIII تويولين أو PSA-NCAM (أرقام 1B-C).

neuroblasts يمكن فصلها nucleofected بكفاءة مع الحمض النووي (على سبيل المثال. GFP البلازميد ترميز، الشكل 2) أو البلازميدات shRNA (الشكل 4) لتحقيق استنزاف البروتين، والتي يمكن تقييمها من خلال تحليل لطخة غربية (الشكل 4B) أو المناعي (لا يظهر) .

خلايا nucleofected مع البلازميدات ترميز GFP ترحيل شعاعيا للخروج مجموعات أرومة عصبية reaggregated (الشكل 3A). الكمي من النسبية ترحيلها مسافة 24 آخر ساعة تضمينها (الشكل 3B) لا يظهر أي اختلاف في الهجرة بين GFP-يفترض إيف الخلايا وGFP سلبية، وخلايا nonnucleofected (الشكل 3C)، مشيرا إلى أن nucleofection في حد ذاته لا يعطل الهجرة. هناك أيضا لا يوجد فرق كبير في مدى الهجرة بين neuroblasts وneuroblasts nucleofected المهاجرة مباشرة من إإكسبلنتس RMS (لا تظهر البيانات).

الشكل 1
الشكل 1. تشريح neuroblasts RMS. (أ) تمثيل تخطيطي للRMS أرومة عصبية تشريح. للحصول على وصف مفصل يرجى الرجوع إلى النص. (ب) خلايا الفئران المعزولة RMS هي immunopositive لصانعي أرومة عصبية المهاجرة DCX وتويولين βlll. بار، و 20 ميكرومتر. (C) خلايا المهاجرة من الماوس RMS إإكسبلنتس تعبر عن أرومة عصبية المهاجرة علامات DCX وPSA-NCAM. بار، و 20 ميكرومتر.0989/50989fig1highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 2
الشكل 2. الماوس أرومة عصبية nucleofection. تنفصل الماوس RMS تم nucleofected neuroblasts مع pMAX-GFP، reaggregated، جزءا لا يتجزأ في مصفوفة ثلاثية الأبعاد، وسمح للهجرة لمدة 6 ساعة. Neuroblasts المهاجرة من كتلة الخلية reaggregated (أعلى والصور الطوري) تظهر كفاءة عالية ترنسفكأيشن (القاع والصور قناة GFP). لوحات العمود الأيمن تظهر الصور التكبير أعلى المقابلة لإدراجات سلط عليها الضوء في لوحات العمود الأيسر. الحانات، و 20 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 3 ontent العرض = "6in" سرك = "/ files/ftp_upload/50989/50989fig3.jpg" العرض = "500px" />
الرقم 3. 3D فحص الهجرة. (A) وnucleofected neuroblasts الجرذ مع pMAX-GFP (GFP) أو pCAG-IRES-EGFP 22 (EV)، reaggregated، جزءا لا يتجزأ في مصفوفة وتترك لمدة 24 ساعة تهاجر. والخلايا ثم الثابتة وimmunostained لGFP (الخضراء) وβIII تويولين (الحمراء). بار، و 50 ميكرومتر. (B) قياس المسافة باستخدام يماغيج الهجرة. وتنقسم الكتلة الخلية reaggregated في 6 قطاعات متساوية. تقاس المسافة بين حافة الكتلة (الخط المنقط) والخلية هاجر أبعد لكل قطاع (C) الكمي من مسافة قريبة هاجر من قبل خلايا nucleofected (GFP إيجابية) والسيطرة، وخلايا nonnucleofected (GFP سلبية) . اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

</ HTML"الشكل 4" FO: محتوى العرض = "6in" سرك = "/ files/ftp_upload/50989/50989fig4.jpg" العرض = "500px" />
الشكل 4. مراقبة الهجرة أرومة عصبية بعد shRNA nucleofection. (A) وnucleofected neuroblasts الجرذ مع عنصر تحكم shRNA ناقلات (PCA-B-3 EGFPm5 كاتم الصوت، والذي يعبر أيضا EGFP 23) أو نفس متجه تحتوي على shRNA استهداف fascin، وهو البروتين تجميع الأكتين 24. تم reaggregated الخلايا أكثر من 48 ساعة، جزءا لا يتجزأ في مصفوفة وتترك لمدة 24 ساعة تهاجر. تم المجاميع ثم الثابتة وimmunostained لGFP (الخضراء) وβIII تويولين (الحمراء). بار، و 50 ميكرومتر. (B) fascin الفعال ويمكن الكشف عن استنزاف 50 ساعة بعد shRNA nucleofection عن طريق تحليل لطخة غربية. ويرد الأكتين هنا كعنصر تحكم التحميل (C) التحليل الكمي من مسافة قريبة الهجرة تبين أن استنزاف fascin يعوق إلى حد كبير الهجرة أرومة عصبية. (يعني ± SEM؛ ** ع <0.01، ن = 3 تجارب مستقلة).

Discussion

هجرة neuroblasts على طول RMS إلى الموقع النهائي في OB هو خطوة أساسية في تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة. ومع ذلك، فإن آليات الجزيئية التي تتحكم في هذه العملية المعقدة بعيدة كل البعد عن أن يكون مفهوما بشكل كامل.

إجراء التجارب وصفها هنا يسمح للدراسة الهجرة أرومة عصبية في المختبر. تكيفنا بروتوكول نشرت سابقا لعزل RMS neuroblasts من المبكر بعد الولادة الماوس أو الفئران 25. لتحقيق أفضل النتائج من المهم لإتقان الخطوة تشريح، لأنه أمر حاسم للحفاظ على الفاصل الزمني بين التشريح وnucleofection إلى الحد الأدنى. بعد nucleofection، neuroblasts يمكن reaggregated، جزءا لا يتجزأ في مصفوفة ثلاثية الأبعاد وغادر إلى الهجرة خلال فترة 24 ساعة. بدلا من ذلك، لأغراض أخرى غير الهجرة (على سبيل المثال المناعي أو تحليل لطخة غربية)، وخلايا يمكن مطلي مباشرة بعد nucleofection على polyornithine/laminin-coverslips المغلفة، حيث يعيش ما يصل إلى 4-5 أيام. الفأر والفئران تهاجر neuroblasts في Matrigel إلى حد مماثلة، ولكن تظهر خلايا فأر لديهم ميل إلى الهجرة أقوى في سلاسل من خلايا الفئران.

اعتمادا على الهدف من هذه الدراسة، neuroblasts يمكن nucleofected مع البلازميدات مختلفة ترميز البروتينات الفلورية أو نوع / متحولة البروتينات البرية من الفائدة. لأفضل البلازميدات البروتين التعبير مع المروج CAG (β أكتين المروج مع محسن CMV وغلوبين بولي β-A الذيل) ويوصى بشدة 26. علاوة على ذلك، oligos سيرنا أو البلازميدات shRNA يمكن nucleofected لضربة قاضية من الأهداف الفائدة. استنزاف البروتين فعالة يمكن تصور بواسطة المناعي أو لطخة غربية (عادة lysing المجاميع جزءا لا يتجزأ من 1 الفئران الجرو مع 50 ميكرولتر من العازلة تحلل قياسي).

Nucleofection هي طريقة بسيطة نسبيا لبالنقل neuroblasts الأولية، ويقدم بديلا أسهل وأسرع لالسادسراؤول بوساطة ناقلات ترنسفكأيشن، ويمكن تحقيق عالية (~ 70-80٪) كفاءة ترنسفكأيشن. فمن الأهمية بمكان أن تعمل بسرعة أثناء إجراء nucleofection، منذ ان ترك neuroblasts في حل nucleofection لفترة طويلة يقلل بشكل كبير بقاء الخلية.

ومتوسط ​​العائد خلية من RMS تشريح منخفضة نسبيا بالنسبة للفئران P7 (~ 5 × 10 5 خلية / الدماغ) بالمقارنة مع الفئران P7 (~ 1 × 10 6 خلية / الدماغ) ويطلب من لا يقل عن 3 × 10 6 خلايا في nucleofection لتحقيق الكفاءة ترنسفكأيشن مع ~ 50٪. علاوة على ذلك، تظهر neuroblasts الفئران لمقاومة أفضل للnucleofection مقارنة neuroblasts الماوس. وبالتالي، الجراء بعد الولادة المبكرة (P6-P7) الفئران قد تمثل مصدرا أرومة عصبية مريحة، معتبرا أيضا أن تنظيم الجرذان والفئران RMS هي سيمي بشكل ملحوظلار 27 وأن مدى الجرذان والفئران في المختبر أرومة عصبية الهجرة هي أيضا قابلة للمقارنة. فإنه من المستحسن عدم إبقاء الكتل reaggregated من neuroblasts nucleofected في التعليق لمدة أطول من 48 ساعة لتجنب آثار غير طبيعية على التشكل الخلية والهجرة (الملاحظات غير منشورة لدينا).

مقايسة 3D الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم لقياس الهجرة أرومة عصبية عند نقطة زمنية محددة بعد التضمين في المصفوفة (على سبيل المثال 24 ساعة). مجاميع من أحجام مختلفة يمكن استخدامها في التحليل، حيث لا يوجد ارتباط كبير بين حجم الركام وبعد الهجرة (الملاحظات غير منشورة لدينا). لتصور ومواصلة التحقيق في ديناميات الهجرة أرومة عصبية، ويمكن استخدام الوقت الفاصل بين التصوير. فمن المستحسن لإجراء التحليل الهجرة ضمن فاصل زمني 24 ساعة بعد التضمين، منذ سرعة neuroblasts يبدو أن ينخفض ​​بشكل كبير في نقاط زمنية أطول (الملاحظات غير منشورة لدينا). </ ع>

هناك بعض القيود على هذا البروتوكول. الأولى، nucleofection يمكن أن تستخدم حتى الآن في أوائل neuroblasts القوارض بعد الولادة، في حين العدوى الفيروسية مع نواقل يبقى الأسلوب الأكثر فعالية لترنسفكأيشن neuroblasts الكبار 28. الثانية، في المختبر فحص الهجرة لا تتكاثر بشكل كامل العمارة المعقدة للRMS لوحظت في الجسم الحي. في الواقع، على الرغم من neuroblasts الحفاظ على القدرة على الهجرة بطريقة مماثلة لنظيراتها في الجسم الحي، في الإعداد التجريبية وصفها هنا أنها تفتقر إلى التفاعل مع غيرها من مكونات RMS مثل الخلايا النجمية والأوعية الدموية، والتي تسهم أيضا في تنظيم الحركة على 9،29، 30. ويمكن معالجة هذه المسألة في المستقبل عن طريق الاستفادة المثلى من نظم نموذج coculture ثلاثية الأبعاد.

في الختام، والجمع بين nucleofection مع مقايسة الهجرة 3D يمثل أداة قيمة لفهم أفضل للآليات الجزيئية الكامنة وراءالهجرة أرومة عصبية. يوفر هذا الإجراء التجريبي وسيلة أولية وسريعة وبسيطة نسبيا لتقييم دور المنظمين مرشح للهجرة أرومة عصبية، والتي يمكن التحقق من صحتها عن طريق مزيد من المناهج الأخرى مثل التثقيب الكهربائي في الجسم الحي بعد الولادة والوقت الفاصل بين التصوير من الثقافات شريحة الدماغ 28،31،32 .

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل ويلكوم ترست مشروع المنح منحت لPD وGL (089236/Z/09/Z). وأيد من قبل SG التكنولوجيا الحيوية والدكتوراه مجلس بحوث العلوم البيولوجية studentship. نشكر ماتيو Vermeren للهدية نوع من ناقلات shRNA وجنيفر لShieh النصائح القيمة على أرومة عصبية nucleofection.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen Life Technologies 14175129
HEPES Sigma-Aldrich H3375-25G
Penicillin-Streptomycin Invitrogen Life Technologies 15140-122
2.5% Trypsin-EDTA (10x) Gibco 15090-046 store 200 µl aliquots at -20 °C
DNAse I Vial (D2) Worthington LK003170 ≥1,000 units per vial; store 50 µl aliquots at -20 °C
Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) Gibco 11960-044
Fetal Calf Serum (FCS) Hyclone SH3007902
Neurobasal medium Gibco 21103-049
B27 supplement Invitrogen Life Technologies 17504044
L-Glutamine (200 mM) Invitrogen Life Technologies 25030-081
D-(+)-Glucose solution (45%) Sigma-Aldrich G8769
Matrigel Basement Membrane Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-free, 10 ml, LDEV-Free BD Biosciences 356231 prepare 120 µl aliquots at 4 °C, then store at -80 °C
PFA Sigma-Aldrich 441242
Sucrose BDH 102745C
Goat serum Sigma-Aldrich 69023
Triton X-100 VWR International Ltd. 306324N
BSA Fisher Chemical BPE9701-100
Dako fluorescence mounting medium Dako S3023
Rat neuron nucleofection kit Lonza VPG-1003
Mouse neuron nucleofection kit Lonza VPG-1001
Microsurgical knife Angiotech 7516
McIlwain tissue chopper The Mickle Laboratory Engineering Company
Nucleofector II Lonza

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ming, G. L., Song, H. J. Adult Neurogenesis in the Mammalian Brain: Significant Answers and Significant Questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
  2. Alonso, M., et al. Activation of adult-born neurons facilitates learning and and memory. Nat. Neurosci. 15, 897-U127 (2012).
  3. Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction? Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
  4. Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
  5. Jin, K. L., et al. Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13198-13202 (2006).
  6. Kim, Y., Szele, F. G. Activation of subventricular zone stem cells after neuronal injury. Cell Tissue Res. 331, 337-345 (2008).
  7. Massouh, M., Saghatelyan, A. De-routing neuronal precursors in the adult brain to sites of injury: Role of the vasculature. Neuropharmacology. 58, 877-883 (2010).
  8. Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
  9. Lois, C., Alvarez-Buylla, A. Long-Distance Neuronal Migration in the Adult Mammalian Brain. Science. 264, 1145-1148 (1994).
  10. Lois, C., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Chain migration of neuronal precursors. Science. 271, 978-981 (1996).
  11. Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal Neuronal Migration Changes the Fate of Developing Neurons in the Postnatal Olfactory Bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
  12. Battista, D., Rutishauser, U. Removal of Polysialic Acid Triggers Dispersion of Subventricularly Derived Neuroblasts into Surrounding CNS Tissues. J .Neurosci. 30, 3995-4003 (2010).
  13. Conover, J. C., et al. Disruption of Eph/ephrin signaling affects migration and proliferation in the adult subventricular zone. Nat. Neurosci. 3, 1091-1097 (2000).
  14. Mobley, A. K., McCarty, J. H. beta 8 Integrin is Essential for Neuroblast Migration in the Rostral Migratory Stream. Glia. 59, 1579-1587 (2011).
  15. Nguyen-Ba-Charvet, K. T., et al. Multiple roles for slits in the control of cell migration in the rostral migratory stream. J. Neurosci. 24, 1497-1506 (2004).
  16. Garzotto, D., Giacobini, P., Crepaldi, T., Fasolo, A., De Marchis, S. Hepatocyte growth factor regulates migration of olfactory interneuron precursors in the rostral migratory stream through Met-Grb2 coupling. J. Neurosci. 28, 5901-5909 (2008).
  17. Platel, J. C., Stamboulian, S., Nguyen, I., Bordey, A. Neurotransmitter signaling in postnatal neurogenesis: The first leg. Brain Res. Rev. 63, 60-71 (2010).
  18. Dityateva, G., et al. Rapid and efficient electroporation-based gene transfer into primary dissociated neurons. J. Neurosci. Meth. 130, 65-73 (2003).
  19. Shieh, J. C., Schaar, B. T., Srinivasan, K., Brodsky, F. M., McConnell, S. K. Endocytosis Regulates Cell Soma Translocation and the Distribution of Adhesion Proteins in Migrating Neurons. PloS One. 6, (2011).
  20. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons. J. Vis. Exp. e2373 (2011).
  21. Gartner, A., Collin, L., Lalli, G. Nucleofection of primary neurons. Method Enzymol. 406, (06), 374-388 (2006).
  22. Causeret, F., et al. The p21-Activated Kinase Is Required for Neuronal Migration in the Cerebral Cortex. Cereb. Cortex. 19, 861-875 (2009).
  23. Bron, R., Eickholt, B. J., Vermeren, M., Fragale, N., Cohen, J. Functional knockdown of neuropilin-1 in the developing chick nervous system by siRNA hairpins phenocopies genetic ablation in the mouse. Dev. Dynam. 230, 299-308 (2004).
  24. Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).
  25. Ward, M., Rao, Y. Investigations of neuronal migration in the central nervous system. Methods Mol. Biol. 294, 137-156 (2005).
  26. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient Selection for High-Expression Transfectants with a Novel Eukaryotic Vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  27. Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp. Neurol. 487, 407-427 (2005).
  28. Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain. J. Vis. Exp. e4061 (2012).
  29. Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).
  30. Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood Vessels Form a Migratory Scaffold in the Rostral Migratory Stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
  31. Sonego, M., Ya, Z., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain. J. Vis. Exp. in press (2013).
  32. Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A., lique, Neonatal Subventricular Zone Electroporation. J. Vis. Exp. e50197 (2013).
Nucleofection من القوارض Neuroblasts لدراسة الهجرة أرومة عصبية<em&gt; في المختبر</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Falenta, K., Gajendra, S., Sonego, M., Doherty, P., Lalli, G. Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro. J. Vis. Exp. (81), e50989, doi:10.3791/50989 (2013).More

Falenta, K., Gajendra, S., Sonego, M., Doherty, P., Lalli, G. Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro. J. Vis. Exp. (81), e50989, doi:10.3791/50989 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter