Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Nucleofection gnaver neuroblasts til Studieinformationen neuroblast Migration doi: 10.3791/50989 Published: November 12, 2013
* These authors contributed equally

Summary

Neuroblast migration er et afgørende skridt i postnatal neurogenesis. Protokollen beskrevet her kan bruges til at undersøge, hvilken rolle af kandidat regulatorer af neuroblast migration ved at ansætte DNA / lille hårnål RNA (shRNA) nucleofection og en 3D migration assay med neuroblasts isoleret fra gnaver postnatal rostral vandrende stream.

Abstract

Den subventricular zone (SVZ) placeret i den laterale væg af de laterale ventrikler spiller en fundamental rolle i voksen neurogenesis. I denne begrænsede område af hjernen, neurale stamceller proliferere og genererer løbende neuroblaster, der vandrer tangentialt kæder langs rostralt vandrende strøm (RMS) for at nå lugtekolben (OB). Når i OB neuroblaster skifte til radial migration og differentierer til modne neuroner i stand til at inkorporere det forud eksisterende neuronale netværk. Korrekt neuroblast migration er et grundlæggende skridt i neurogenesis, sikre korrekt funktionelle modning af nyfødte neuroner. Grund af mulighederne i SVZ-afledte neuroblasts at målrette sårede områder i hjernen, undersøge de intracellulære mekanismer bag deres motilitet vil ikke blot øge forståelsen af ​​neurogenese, men kan også fremme udviklingen af ​​neuroregenerative strategier.

Dette håndskrift beskriver en detaljeretprotokol for transfektion af primær gnaver RMS postnatal neuroblasts samt analyse af deres motilitet hjælp af en 3D in vitro migration assay opridset deres tilstand af migration observeret in vivo. Både rotter og mus neuroblasts kan hurtigt og effektivt transficeret være via nucleofection med enten plasmid-DNA, lille hårnål (sh) RNA eller kort forstyrrende (si) RNA oligos rettet gener af interesse. At analysere migration, er nucleofected celler reaggregated i 'hængende dråber' og efterfølgende indlejret i en tre-dimensionel matrix. Nucleofection per se ikke væsentligt forringer migration af neuroblasts. Farmakologisk behandling af nucleofected og reaggregated neuroblaster kan også udføres for at undersøge den rolle, signalveje, der er involveret i neuroblast migration.

Introduction

I den postnatale pattedyrhjernen generering af nye neuroner (neurogenese) sker gennem hele livet og er begrænset til to neurogene nicher: den subventrikulære zone (SVZ) af de laterale ventrikler og subgranular zone af gyrus dentatus i hippocampus 1. Adskillige nyere undersøgelser har vist den vigtige rolle, voksen neurogenese lette indlæring og hukommelse opgaver 2,3. Desuden beviser for spredning og rekruttering af neurale stamfædre efter hjerneskade 4-7 nævner muligheden for farmakologisk aktivering af neurogenese i neurale reparation.

Fødselsdepression neurogenese er strengt reguleret i alle dets faser, som omfatter neurale stamfader proliferation, migration, differentiering, overlevelse, og endelig synaptisk integration af nyfødte neuroner 8. Neurale progenitorer (neuroblasts) afledt af stamceller i SVZ migrere over en stor afstand gennem rostral vandrendestrøm (RMS) mod lugtekolben (OB), hvor de modnes i funktionelle neuroner 9. Vandrende neuroblasts er overvejende unipolar, med et aflangt cellen kroppen udvide en enkelt ledende proces. Disse celler bevæger sig i kæder i en kollektiv måde, glider over hinanden 10. Migration er et afgørende skridt for den efterfølgende modning af SVZ-afledte stamfædre i funktionelle neuroner 11 og er kontrolleret af flere faktorer og vejledning molekyler herunder: polysialylated neural celleadhæsionsmolekyle (PSA-NCAM) 12, Ephriner 13, integriner 14, slidser 15, vækstfaktorer 16 og neurotransmittere 17, men de molekylære mekanismer, der ligger denne proces er ikke fuldt forstået. Undersøge de intracellulære signalveje regulerer neuroblast migration vil ikke kun give en bedre forståelse af voksen neurogenese, men vil også bidrage til udviklingen af ​​det nye terapeutisketilgange til at fremme hjernens reparation.

Dette håndskrift beskrives en detaljeret protokol til at undersøge den rolle, kandidat regulatorer af neuroblast migration in vitro ved anvendelse nucleofection og en 3D migration assay. Nucleofection er en celle transfektion teknik baseret på en forbedret fremgangsmåde til elektroporation. Celletypespecifik af elektrisk strøm og nucleofection løsning tillader overførsel af polyanioniske makromolekyler, såsom DNA-og shRNA vektorer og siRNA oligonukleotider direkte ind i cellekernen og tillade transfektion langsomt dividere eller mitotisk inaktive celler som embryonale og pattedyrs neuroner 18. Denne metode er hurtig, forholdsvis let at udføre og resulterer i meget reproducerbar transfektion af en bred vifte af celletyper, herunder primære neuroblasts og neuroner 19-21.

Dissociation RMS væv tillader isolering af vandrende neuroblaster, som med held kan nucleofected med DNA / SHRNA vektorer eller siRNA oligoer målretning gener af interesse. Efter nucleofection er neuroblasts reaggregated i hængende dråber og efterfølgende indlejret i en tre-dimensionel Matrigel matrix. Disse betingelser tillader neuroblasts at migrere ud af cellen aggregater opridset migration tilstanden observeres in vivo, hvilket giver en fremragende model system til at undersøge signalveje involveret i neuroblast migration og at vurdere indflydelsen af farmakologiske behandlinger på motilitet af disse celler.

Protocol

Denne procedure er i overensstemmelse med det britiske indenrigsministerium forordninger (Animal Scientific Procedures Act, 1986). Forskerne bør følge de retningslinjer, der er fastlagt og godkendt af deres institutionelle og nationale organisationer dyr.

1.. Dissektion og Dissociation af Rat RMS neuroblasts

  1. Forbered de løsninger, der er nødvendige for RMS dissektion og dissociation:

Dissektionsmedium (100 ml)
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) - 98,5 ml
5 M HEPES pH 7,4 - 0,5 mL
Penicillin-streptomycin (10.000 enheder / ml og 10.000 ug / ml) - 1 ml

Dissociation medium (2 ml)
HBSS - 1.760 ml
10x trypsin (2,5%) - 200 pi
DNAse1 (1 mg / ml) - 40 pi

Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% føtalt kalveserum (FCS) (40 ml)
DMEM -36 ml
FCS - 4 ml

Komplet medium (12 ml)

Neurobasalt medium - 11,46 ml
B27 Supplement - 250 pi
L-Glutamin (200 mm) - 125 ul
Glucose (45%) - 165 pi

2. Filter-sterilisere DMEM + 10% FCS og det komplette medium og preequilibrate dem i en 37 ° C / 5% CO 2-inkubator.

  1. Dissektion
    1. Ofre en P6-P7 rotte kuld (ca. 12 hvalpe) ved cervikal dislokation og halshugge med en saks.
    2. Lav en anteroposterior snit i huden langs midten sagittale sutur fra næse til lillehjernen med en skalpel. Skræl skindet og gentage den samme snit langs kraniet.
    3. Fjern forsigtigt kranielle flapper med pincet og fjern forsigtigt hjernen med en spatel, der tager sig at omfatte de olfaktoriske pærer.
    4. Skær mest caudale tredjedel af hjernen og kassér den.
    5. Hak the hjernevæv i 1,4 mm tykke koronale udsnit med en vævshakker.
    6. Placer skiver i retter, der indeholder koldt dissektion medium og omhyggeligt adskille dem ved hjælp af en nål.
    7. RMS vises som en trekantet, gennemskinneligt område i centrum af OB-sektioner, og som en lille, cirkulært område på flere kaudale hjernesnit. Skær RMS ud af hver skive med en microsurgical kniv, idet man undgår, herunder omgivende væv. I P7 rotteunger, som regel de ~ 8 mest rostralt skiver (herunder OB) indeholder de RMS.
    8. Saml RMS fragmenter med en plastik Pasteur pipette og placere dem i en lille skål, der indeholder koldt dissektion medium på is.
    9. Når dissektion er færdig, overføre RMS fragmenter i et 15 ml rør med en plastpipette. Lad fragmenter sig på bunden af ​​røret.
  2. Dissociation
    1. Udskift dissektion medium med 2 ml dissociation medium.
    2. Tritureres RMS fragmenter ved forsigtigt s.ipetting suspension fragmentet op og ned om 10x ved hjælp af en P1000 pipette.
    3. Lad røret med vævsfragmenter i et 37 ° C vandbad i 2 min.
    4. Pipette løsningen igen 10x og sikre, at fragmenter har adskilt (suspensionen bør blive uklar).
    5. Inaktivere trypsinet ved tilsætning af 5 ml forvarmet DMEM + 10% FCS.
    6. Centrifugeres cellesuspensionen ved 433 xg i 5 min.
    7. I mellemtiden alikvot den nødvendige mængde af siRNA / DNA i Eppendorf-rør (normalt 3-5 ug DNA / shRNA eller 5-9 ug siRNA oligo pr nucleofection, men mængden af ​​DNA / siRNA kan kræve optimering).
    8. Fjern overskydende medium og resuspender cellepelleten ved forsigtig pipettering i 5 ml forvarmet DMEM + 10% FCS.
    9. Udfør en celletælling. Forvent ~ 1 x 10 6 celler pr rotteafkommets hjerne. Et minimum på 2,5 x 10 6 celler er nødvendige for hvert nucleofection, mensoptimale resultater opnås ved anvendelse af 3-4 x 10 6 celler pr nucleofection.
    10. Centrifugeres cellesuspensionen ved 433 xg i 5 min. Sørg for at fjerne så meget medie som muligt.

2. Nucleofection

  1. Umiddelbart resuspendere cellepelleten i rotte (eller mus, hvis der anvendes museceller) neuron nucleofection opløsning tidligere inkuberet ved stuetemperatur. Brug 100 ul pr nucleofection Bemærk:. Typisk en rotte kuld på 12 hvalpe er tilstrækkeligt til at udføre 4 nucleofections og en mus kuld (12 hvalpe) er tilstrækkelig til at udføre 2 nucleofections.
  2. Overfør 100 pi af cellesuspensionen til hvert Eppendorf-rør indeholdende siRNA / DNA og blandes forsigtigt 2-3x ved pipettering med en P200 pipette.
  3. Tilsæt prøve (cell-DNA/siRNA suspension) til bunden af ​​nucleofectioncuvette, idet man for at undgå bobler.
  4. Nucleofect bruge program G-013 (til rotteceller) eller O-005 (tilmuseceller). Én nucleofection tager ca 5 sek.
  5. Hurtigt tilføje 1 ml forvarmet DMEM + 10% FCS til nucleofected prøve.
  6. Gentag trin 2.4 og 2.5 for alle andre prøver. Bemærk: For optimale resultater, skal hele nucleofection procedure vare længere end 5 min.
  7. Overfør hver prøve til et 15 ml rør indeholdende 5 ml forvarmet DMEM + 10% FCS ved anvendelse af plastpipette billede af nucleofection kit. Undgå at overføre enhver celleaffald til glasset.
  8. Centrifugér prøver ved 433 xg i 5 min.
  9. Fjern omhyggeligt alt overskydende medie, og pellet resuspenderes i 25-30 pi forvarmet DMEM + 10% FCS ved hjælp af en P20 pipette. Brug ikke mere end 30 pi medium.
  10. Pipettere suspensionen som en dråbe på den indvendige side af en p35-skål låg.
  11. Vend låget over p35-skål indeholdende 2 ml komplet medium (se også figur 1).
  12. Lad i inkubatoren (37 ° C / 5% CO 2) imindst 5 timer og op til 7 timer. Længere inkubationstid giver en bedre reaggregation af celle klynger.
  13. Overfør hængende dråber fra låget i det komplette medium i skålen ved hjælp af en P1000 pipette med et snit spids.
  14. Der inkuberes ved 37 ° C / 5% CO 2 i 24 timer for DNA nucleofections og 48 hr for siRNA / shRNA nucleofections.

3. Embedding

  1. Forbered komplet medium (25 ml) og preequilibrate det ved 37 ° C / 5% CO2 i et par timer.
  2. Tag de frosne alikvoter af basalmembranmatrix fra -80 ° C fryser og tø på is i kølerum.
  3. For hver nucleofection forberede en 6 cm skål, der indeholder op til otte 13 mm sterile coverlips.
  4. Anbring servicet på en is boks dækket med plastfolie. Det er vigtigt at holde dækglas cool at forhindre matrix størkning under indlejring procedure.
  5. For at opretholde fugt, placere en stribe af fugtig væv inde i en 15 cm skål, at wsyg anvendes til at holde op til tre 6 cm skåle med den indbyggede neuroblasts.
  6. Læg komplet medium til den optøede matrix i forholdet 1:3. For eksempel blande 40 pi af komplet medium med 120 pi matrix ved pipettering. Denne mængde af matrix er tilstrækkelig til indlejring aggregater på otte 12 mm dækglas.
  7. Overfør reaggregated celleklynger til et 15 ml rør og centrifugeres ved 433 xg i 5 min.
  8. Fjern overskydende medium og pellet resuspenderes i 10 pi af komplet medium.
  9. Placer 2 pi celleaggregatstørrelse suspensionen på hver sterilt dækglas og tilsæt 18 pi matrix / komplet medium blanding. Brug pipettespidsen sprede matrix over hele dækglasset.
  10. Umiddelbart placere 6 cm skål indeholdende dækglas i 15 cm skål og lad i inkubatoren (37 ° C / 5% CO 2) i 15-20 min. Når matricen er størknet, forsigtigt tilsættes 5 ml komplet medium til hver 6 cm skål og sørg for at skubbened alle flydende dækglas med en pipettespids.
  11. Der inkuberes i 24 timer ved 37 ° C / 5% CO2 for at lade neuroblaster migrerer ud af celleaggregater.

4.. 3D Migration Assay

  1. Forbered de løsninger, der kræves for immunfarvning.
    1. Forbered blok løsning:
      Goat blokopløsning (50 ml)
      Phosphatbufret saltvand (PBS) - 5 ml
      Gedeserum - 7,5 ml
      10% Triton X-100 til 1,5 ml
      BSA - 50 mg
      H2O - 36 ml
    2. Filter og opbevares ved 4 ° C.
    3. Forbered fastsættelse løsning:
      Fastsættelse opløsning (100 ml)
      Paraformaldehyd (PFA) - 4 g ADVARSEL: altid håndtere PFA under en emhætte
      Saccharose - 20 g (valgfrit)
      PBS op til 100 ml
    4. På en varm plade og under konstant omrøring opløse PFA i 80 ml PBS holdes ved 65 ° C.
    5. Når PFA er opløst, tilsættes 20 g saccharose.
    6. PH justeres til7.4 (normalt ved at tilføje ~ 60 pi 1 M NaOH pr 100 ml opløsning).
    7. Bring op til et samlet volumen på 100 ml med PBS.
  2. Immunfarvning
    1. Placer dækglas i en 24-brønds plade.
    2. Skyl dækglas med PBS 2x.
    3. Fastgør RMS neuroblast aggregater med fastsættelse løsning i 45 minutter ved stuetemperatur.
    4. Skyl dækglas med PBS 3x (5 min / vask - på en gyngende platform).
    5. Bloker for 30-60 min med ged blokopløsning.
    6. Fortyndet primære antistoffer hos geder blokopløsning og inkuberes natten over ved 4 ° C. (Hvis det ønskes, fluorescerende phalloidin (1:400) og Hoechst-farvestof (1:10.000) kan også tilføjes til det primære antistof løsning til at visualisere filamentøs actin og kerner).
    7. Skyl dækglas med PBS 3x (5 min / vask).
    8. Fortyndet sekundære antistoffer hos geder blokopløsning og inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur.
    9. Skyl coverslips med PBS 3x (5 min / vask)
    10. Mount dækglas med fluorescerende montering medium og lad det tørre natten over ved stuetemperatur.
  3. Migration Analyse
    1. Tag billeder af faste RMS neuroblast aggregater med et fluorescerende mikroskop ved hjælp af en 10X målsætning. Medtag en skala bar i en prøve billede.
    2. For at opsætte skalaen for kvantificering, måle skalalinjen i billedet ved at vælge "Straight line 'værktøj på ImageJ værktøjslinjen.
    3. Vælg 'Analyze' og klik på 'indstille skalaen.
    4. I skalaen vinduet indstille "kendt afstand" og sætte kryds i 'globale' boksen for at holde de samme indstillinger for alle målinger.
    5. Brug Segmented linjen 'værktøj på ImageJ værktøjslinjen for at måle afstanden fra kanten af aggregat til den længst migreret neuroblast i 6 forskellige sektorer rundt hele aggregat (figur 3B). Overvej kun isoleret aggregates til analyse.
    6. Beregne en gennemsnitlig migration afstand fra de 6 værdier for hvert aggregat.
    7. Mål 10-20 aggregater for hver tilstand i hver uafhængigt forsøg og pool resultater fra mindst tre uafhængige forsøg. Altid omfatte en nucleofection kontrol (f.eks. GFP eller en kontrol sh / siRNA).

Representative Results

Neuroblasts held kan isoleres fra dissekerede RMS væv (fig. 1A) og indlejret i en tredimensional matrix. Celler isoleret fra enten rotte eller mus postnatal RMS er immunopositive for vandrende neuroblast markører, såsom doublecortin (DCX) βIII tubulin eller PSA-NCAM (1B-C).

Dissocierede neuroblaster effektivt kan nucleofected med DNA (f.eks. GFP-kodende plasmid, figur 2) eller shRNA plasmider (fig. 4) for at opnå protein-nedbrydningen, som kan vurderes ved Western blot-analyse (figur 4B) eller immunofluorescens (ikke vist) .

Celler nucleofected med GFP-koder plasmider migrere radialt ud reaggregated neuroblast klynger (figur 3a). Kvantificering af relativ migreret afstand 24 timer efter indlejring (figur 3B) viser ingen forskel i migration mellem GFP-postulere ive celler og GFP-negative, nonnucleofected celler (figur 3C), hvilket indikerer, at nucleofection sig selv ikke forstyrrer migration. Der er heller ingen signifikant forskel i omfanget af migrationen mellem nucleofected neuroblasts og neuroblasts direkte migrerer ud af RMS explanter (data ikke vist).

Figur 1
Figur 1. Dissektion af RMS neuroblasts. (A) Skematisk repræsentation af RMS neuroblast dissektion. For detaljeret beskrivelse henvises til teksten. (B) Isolerede rotte RMS celler er immunopositive for vandrende neuroblast beslutningstagere DCX og βlll tubulin. Bar, 20 um. (C) Celler migrerer ud af mus RMS explanter udtrykke vandrende neuroblast markører DCX og PSA-NCAM. Bar, 20 um.0989/50989fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.

Figur 2
Figur 2. Mus neuroblast nucleofection. Adskilles mus RMS neuroblaster blev nucleofected med Pmax-GFP reaggregated, indlejret i en tredimensional matrix og fik lov til at migrere i 6 timer. Neuroblasts migrerer ud af en reaggregated celle klynge (top, fasekontrast billeder) viser høj transfektionseffektivitet (nederst, GFP channel billeder). Højre kolonne paneler viser højere forstørrelse billeder, der svarer til mellemværker fremhævet i venstre kolonne paneler. Barer, 20 um. Klik her for at se større billede .

Figur 3 NDHOLDET-width = "6tommer" src = "/ files/ftp_upload/50989/50989fig3.jpg" width = "500px" />
Figur 3. 3D Migration assay. (A) Rotte neuroblasts blev nucleofected med Pmax-GFP (GFP) eller pCAG-IRES-EGFP 22 (EV), reaggregated, indlejret i matrix og venstre for at migrere i 24 timer. Cellerne blev derefter fikseret og immunfarvet for GFP (grøn) og βIII tubulin (rød). Bar, 50 mM. (B) måling migration afstand ved hjælp ImageJ. Den reaggregated celle klynge er opdelt i 6 lige store sektorer. Afstanden mellem kanten af klyngen (stiplet linje) og den længst migreret celle måles for hver sektor. (C) Kvantificering af den relative afstand migreret ved nucleofected celler (GFP-positive) og kontrol, nonnucleofected celler (GFP-negative) . Klik her for at se større billede .

</ Html"Figur 4" fo: content-width = "6in" src = "/ files/ftp_upload/50989/50989fig4.jpg" width = "500px" />
Figur 4.. Overvågning neuroblast migration efter shRNA nucleofection. (A) Rotte neuroblaster blev nucleofected med en kontrolgruppe shRNA vektor (PCA-b-EGFPm5 Lyddæmper 3, som udtrykker også EGFP 23) eller den samme vektor indeholdende et shRNA målretning fascin, en actin-bundling protein 24. Celler blev reaggregated løbet 48 timer, indlejret i matrix og venstre for at migrere i 24 timer. Aggregater blev derefter fikseret og immunfarvet for GFP (grøn) og βIII tubulin (rød). Bar, 50 mM. (B) Effektiv fascin udtømning kan påvises 50 timer efter shRNA nucleofection ved western blot-analyse. Actin er vist her som en belastning kontrol (C) Kvantitativ analyse af migration i forhold distance viser, at fascin udtynding i væsentlig grad hæmmer neuroblast migration. (Gennemsnit ± SEM, ** p <0,01, n = 3 uafhængige eksperimenter).

Discussion

Migrationen af ​​neuroblasts langs RMS til den endelige placering i OB er et grundlæggende skridt i postnatal neurogenesis. Men de molekylære mekanismer, der styrer denne komplekse proces er langt fra at være fuldt forstået.

Den eksperimentelle procedure, der er beskrevet her tillader undersøgelse af neuroblast migration in vitro. Vi har tilpasset en tidligere offentliggjort protokol til isolering RMS neuroblasts fra tidlig postnatal mus eller rotte 25. For at opnå optimale resultater er det vigtigt at beherske dissektion trin, da det er afgørende at holde tidsintervallet mellem dissektion og nucleofection til et minimum. Efter nucleofection kan neuroblaster blive reaggregated, indlejret i en tredimensional matrix og efterladt til at migrere over en 24 timers periode. Alternativt til andre formål end migration (fx immunfluorescens eller western blot analyse) formål, celler kan umiddelbart forgyldt efter nucleofection på polyornithine/laminin-overtrukne dækglas, hvor de overlever op til 4-5 dage. Mus og rotter neuroblasts migrere i Matrigel et tilsvarende omfang dog museceller synes at have en stærkere tendens til at migrere i lænker end rotteceller.

Afhængigt af formålet med undersøgelsen kan neuroblaster blive nucleofected med forskellige plasmider, der koder for fluorescerende proteiner eller vildtype / mutant proteiner af interesse. For at opnå optimale protein ekspressionsplasmider med CAG promotor (β-actin-promotoren med CMV-enhanceren og β-globin-poly-A-hale) 26 er stærkt anbefales. Desuden kan siRNA oligoer eller shRNA plasmider nucleofected at Knockdown mål af interesse. Effektiv protein udtømning kan visualiseres ved immunofluorescens eller ved Western blot (normalt lysering indlejrede aggregater fra en rotteunge med 50 pi standard lysis buffer).

Nucleofection er en forholdsvis enkel metode til at transficere primære neuroblaster, giver en lettere og hurtigere alternativ til viral vektor-medieret transfektion, og kan opnå høj (~ 70-80%) transfektionseffektivitet. Det er vigtigt at arbejde hurtigt under nucleofection procedure, da forlader neuroblasts i nucleofection løsning for en længere tid drastisk reducerer cellernes levedygtighed.

Den gennemsnitlige celleudbytte fra RMS dissektion er relativt lav for P7-mus (~ 5 x 10 5 celler / hjerne) i forhold til P7 rotter (~ 1 x 10 6 celler / hjerne) og mindst 3 x 10 6 celler pr nucleofection kræves at opnå transfektion med ~ 50% effektivitet. Desuden rotte neuroblaster synes at modstå bedre at nucleofection forhold til mus neuroblasts. Derfor kan tidlig postnatal (P6-P7) rotteunger repræsentere en bekvem neuroblast kilde, overvejer også at organiseringen af ​​rotter og mus RMS er bemærkelsesværdigt similar 27 og at omfanget af rotter og mus neuroblast migration in vitro er også sammenlignelige. Det er tilrådeligt ikke at holde reaggregated klynger af nucleofected neuroblasts i suspension i længere tid end 48 timer for at undgå unormale virkninger på celle morfologi og migration (vores upublicerede observationer).

3D-assay beskrevet her kan anvendes til at kvantificere neuroblast migration på et fast tidspunkt efter indlejring i matrixen (f.eks. 24. time). Aggregater af forskellige størrelser kan anvendes i analysen, da der ikke er nogen signifikant sammenhæng mellem størrelsen af ​​aggregater og migration afstand (vores upublicerede observationer). At visualisere og yderligere at undersøge dynamikken i neuroblast migration, kan time-lapse billeddannelse anvendes. Det anbefales at udføre analysen migration inden for en 24 timers interval efter indlejring, da hastigheden af ​​neuroblasts synes at drastisk nedsætte ved længere tidspunkter (vores upublicerede observationer) <./ P>

Der er nogle begrænsninger i denne protokol. For det første kan nucleofection hidtil anvendes for tidlige postnatale gnaver neuroblaster, mens infektion med virale vektorer er fortsat den mest effektive metode til transfektion voksne neuroblaster 28. For det andet, har in vitro-migration assay ikke helt gengive den komplekse arkitektur RMS observeret in vivo. Selv om neuroblaster opretholde evnen til at migrere på en lignende måde til deres in vivo modstykker i forsøgsopstillingen beskrives her de mangler interaktioner med andre RMS komponenter såsom astrocytter og blodkar, som også bidrager til at regulere deres motilitet 9,29, 30.. Dette problem kan løses i fremtiden ved optimering af tre-dimensionelle cokultur modelsystemer.

Konklusionen er, at kombinere nucleofection med et 3D-migration assay udgør et værdifuldt redskab til bedre at forstå de molekylære mekanismer, der liggerneuroblast migration. Denne eksperimentelle procedure giver en indledende, hurtig og relativt enkel metode til at evaluere rollen af kandidat regulatorer af neuroblast migration, som yderligere kan valideres af andre metoder som in vivo postnatal elektroporation og time-lapse billeddannelse af hjernen skivekulturer 28,31,32 .

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af en Wellcome Trust Project Grant tildelt PD og GL (089236/Z/09/Z). SG blev understøttet af en bioteknologi og biologiske Sciences Research Council Ph.d. studentship. Vi takker Matthieu Vermeren for den slags gave shRNA vektor og Jennifer Shieh for værdifuld rådgivning om neuroblast nucleofection.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen Life Technologies 14175129
HEPES Sigma-Aldrich H3375-25G
Penicillin-Streptomycin Invitrogen Life Technologies 15140-122
2.5% Trypsin-EDTA (10x) Gibco 15090-046 store 200 µl aliquots at -20 °C
DNAse I Vial (D2) Worthington LK003170 ≥1,000 units per vial; store 50 µl aliquots at -20 °C
Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) Gibco 11960-044
Fetal Calf Serum (FCS) Hyclone SH3007902
Neurobasal medium Gibco 21103-049
B27 supplement Invitrogen Life Technologies 17504044
L-Glutamine (200 mM) Invitrogen Life Technologies 25030-081
D-(+)-Glucose solution (45%) Sigma-Aldrich G8769
Matrigel Basement Membrane Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-free, 10 ml, LDEV-Free BD Biosciences 356231 prepare 120 µl aliquots at 4 °C, then store at -80 °C
PFA Sigma-Aldrich 441242
Sucrose BDH 102745C
Goat serum Sigma-Aldrich 69023
Triton X-100 VWR International Ltd. 306324N
BSA Fisher Chemical BPE9701-100
Dako fluorescence mounting medium Dako S3023
Rat neuron nucleofection kit Lonza VPG-1003
Mouse neuron nucleofection kit Lonza VPG-1001
Microsurgical knife Angiotech 7516
McIlwain tissue chopper The Mickle Laboratory Engineering Company
Nucleofector II Lonza

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ming, G. L., Song, H. J. Adult Neurogenesis in the Mammalian Brain: Significant Answers and Significant Questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
  2. Alonso, M., et al. Activation of adult-born neurons facilitates learning and and memory. Nat. Neurosci. 15, 897-U127 (2012).
  3. Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction? Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
  4. Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
  5. Jin, K. L., et al. Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13198-13202 (2006).
  6. Kim, Y., Szele, F. G. Activation of subventricular zone stem cells after neuronal injury. Cell Tissue Res. 331, 337-345 (2008).
  7. Massouh, M., Saghatelyan, A. De-routing neuronal precursors in the adult brain to sites of injury: Role of the vasculature. Neuropharmacology. 58, 877-883 (2010).
  8. Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
  9. Lois, C., Alvarez-Buylla, A. Long-Distance Neuronal Migration in the Adult Mammalian Brain. Science. 264, 1145-1148 (1994).
  10. Lois, C., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Chain migration of neuronal precursors. Science. 271, 978-981 (1996).
  11. Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal Neuronal Migration Changes the Fate of Developing Neurons in the Postnatal Olfactory Bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
  12. Battista, D., Rutishauser, U. Removal of Polysialic Acid Triggers Dispersion of Subventricularly Derived Neuroblasts into Surrounding CNS Tissues. J .Neurosci. 30, 3995-4003 (2010).
  13. Conover, J. C., et al. Disruption of Eph/ephrin signaling affects migration and proliferation in the adult subventricular zone. Nat. Neurosci. 3, 1091-1097 (2000).
  14. Mobley, A. K., McCarty, J. H. beta 8 Integrin is Essential for Neuroblast Migration in the Rostral Migratory Stream. Glia. 59, 1579-1587 (2011).
  15. Nguyen-Ba-Charvet, K. T., et al. Multiple roles for slits in the control of cell migration in the rostral migratory stream. J. Neurosci. 24, 1497-1506 (2004).
  16. Garzotto, D., Giacobini, P., Crepaldi, T., Fasolo, A., De Marchis, S. Hepatocyte growth factor regulates migration of olfactory interneuron precursors in the rostral migratory stream through Met-Grb2 coupling. J. Neurosci. 28, 5901-5909 (2008).
  17. Platel, J. C., Stamboulian, S., Nguyen, I., Bordey, A. Neurotransmitter signaling in postnatal neurogenesis: The first leg. Brain Res. Rev. 63, 60-71 (2010).
  18. Dityateva, G., et al. Rapid and efficient electroporation-based gene transfer into primary dissociated neurons. J. Neurosci. Meth. 130, 65-73 (2003).
  19. Shieh, J. C., Schaar, B. T., Srinivasan, K., Brodsky, F. M., McConnell, S. K. Endocytosis Regulates Cell Soma Translocation and the Distribution of Adhesion Proteins in Migrating Neurons. PloS One. 6, (2011).
  20. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons. J. Vis. Exp. e2373 (2011).
  21. Gartner, A., Collin, L., Lalli, G. Nucleofection of primary neurons. Method Enzymol. 406, (06), 374-388 (2006).
  22. Causeret, F., et al. The p21-Activated Kinase Is Required for Neuronal Migration in the Cerebral Cortex. Cereb. Cortex. 19, 861-875 (2009).
  23. Bron, R., Eickholt, B. J., Vermeren, M., Fragale, N., Cohen, J. Functional knockdown of neuropilin-1 in the developing chick nervous system by siRNA hairpins phenocopies genetic ablation in the mouse. Dev. Dynam. 230, 299-308 (2004).
  24. Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).
  25. Ward, M., Rao, Y. Investigations of neuronal migration in the central nervous system. Methods Mol. Biol. 294, 137-156 (2005).
  26. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient Selection for High-Expression Transfectants with a Novel Eukaryotic Vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  27. Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp. Neurol. 487, 407-427 (2005).
  28. Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain. J. Vis. Exp. e4061 (2012).
  29. Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).
  30. Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood Vessels Form a Migratory Scaffold in the Rostral Migratory Stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
  31. Sonego, M., Ya, Z., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain. J. Vis. Exp. in press (2013).
  32. Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A., lique, Neonatal Subventricular Zone Electroporation. J. Vis. Exp. e50197 (2013).
Nucleofection gnaver neuroblasts til Studieinformationen neuroblast Migration<em&gt; In vitro</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Falenta, K., Gajendra, S., Sonego, M., Doherty, P., Lalli, G. Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro. J. Vis. Exp. (81), e50989, doi:10.3791/50989 (2013).More

Falenta, K., Gajendra, S., Sonego, M., Doherty, P., Lalli, G. Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro. J. Vis. Exp. (81), e50989, doi:10.3791/50989 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter