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Neuroscience

कृंतक neuroblasts की nucleofection Neuroblast प्रवास का अध्ययन करने के लिए doi: 10.3791/50989 Published: November 12, 2013
* These authors contributed equally

Summary

Neuroblast प्रवास प्रसवोत्तर neurogenesis में एक महत्वपूर्ण कदम है. प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित डीएनए / छोटे बाल के लिये कांटा शाही सेना (shRNA) nucleofection और कृंतक प्रसव के बाद विजय - स्तम्भ प्रवासी धारा से अलग neuroblasts के साथ एक 3 डी प्रवास परख रोजगार से Neuroblast प्रवास के उम्मीदवार नियामकों की भूमिका की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

पार्श्व निलय की पार्श्व दीवार में स्थित subventricular क्षेत्र (SVZ) वयस्क neurogenesis में एक मौलिक भूमिका निभाता है. मस्तिष्क के इस प्रतिबंधित क्षेत्र में, तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को पैदा करना और लगातार घ्राण बल्ब (ओ) तक पहुँचने के लिए विजय - स्तम्भ प्रवासी धारा (आरएमएस) के साथ जंजीरों में tangentially विस्थापित कि neuroblasts उत्पन्न करते हैं. एक बार ओबी में, neuroblasts रेडियल प्रवास करने के लिए स्विच और फिर पहले से मौजूद neuronal नेटवर्क में शामिल करने में सक्षम परिपक्व न्यूरॉन्स में अंतर. उचित Neuroblast प्रवास नवजात न्यूरॉन्स की सही कार्यात्मक परिपक्वता सुनिश्चित करने, neurogenesis में एक बुनियादी कदम है. उनकी गतिशीलता अंतर्निहित intracellular तंत्र की जांच, मस्तिष्क में घायल क्षेत्रों को लक्षित करने के SVZ व्युत्पन्न neuroblasts की क्षमता को देखते हुए neurogenesis की समझ में वृद्धि होगी ही नहीं बल्कि neuroregenerative रणनीतियों के विकास को बढ़ावा देने सकता है.

इस पांडुलिपि एक विस्तृत वर्णन किया गया हैप्राथमिक कृंतक की अभिकर्मक के लिए प्रोटोकॉल प्रसव के बाद neuroblasts और vivo में मनाया प्रवास के अपने मोड recapitulating एक 3 डी में इन विट्रो प्रवास परख का उपयोग उनके गतिशीलता का विश्लेषण RMS. दोनों चूहा और माउस neuroblasts प्लास्मिड डीएनए, छोटे बाल के लिये कांटा (एसएच) शाही सेना या शाही सेना कम oligos ब्याज की जीन को लक्षित (एसआई) हस्तक्षेप के साथ या तो nucleofection के माध्यम से जल्दी से और कुशलता से ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता. प्रवास का विश्लेषण करने के लिए, nucleofected कोशिकाओं 'फांसी बूँदें' में reaggregated और बाद में एक तीन आयामी मैट्रिक्स में एम्बेडेड रहे हैं. Nucleofection प्रतिशत से काफी neuroblasts के प्रवास ख़राब नहीं करता है. Nucleofected और reaggregated neuroblasts के औषधीय उपचार भी Neuroblast प्रवास में शामिल रास्ते संकेतन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है.

Introduction

नए न्यूरॉन्स (न्यूरोजेनेसिस) की प्रसव के बाद स्तनधारी मस्तिष्क, पीढ़ी में जीवन भर होता है और दो ​​तंत्रिकाजन्य आलों तक ही सीमित है: पार्श्व ventricles के subventricular क्षेत्र (SVZ) और हिप्पोकैम्पस 1 की दांतेदार गाइरस के subgranular क्षेत्र. हाल ही में कई अध्ययनों से सीखने और स्मृति कार्यों 2,3 सुविधाजनक बनाने में वयस्क neurogenesis की महत्वपूर्ण भूमिका से पता चला है. इसके अलावा, मस्तिष्क की चोट 4-7 निम्नलिखित तंत्रिका progenitors के प्रसार और भर्ती के सबूत तंत्रिका मरम्मत में neurogenesis के औषधीय सक्रियण की संभावना को जन्म देती है.

प्रसव के बाद न्यूरोजेनेसिस सख्ती से तंत्रिका पूर्वज प्रसार, प्रवास, भेदभाव, अस्तित्व, और नए पैदा हुए न्यूरॉन्स 8 के अंतिम synaptic एकीकरण में शामिल हैं जो अपने सभी चरणों में नियंत्रित किया जाता है. SVZ में स्टेम सेल से प्राप्त तंत्रिका progenitors (neuroblasts) विजय - स्तम्भ प्रवासी के माध्यम से एक महान दूरी पर विस्थापितवे कार्यात्मक न्यूरॉन्स 9 में परिपक्व जहां घ्राण बल्ब (ओ) की ओर धारा (आरएमएस). प्रवासी neuroblasts एक एकल अग्रणी प्रक्रिया का विस्तार एक लम्बी सेल शरीर के साथ, मुख्य रूप से एकध्रुवीय हैं. इन कोशिकाओं को एक दूसरे पर 10 स्लाइडिंग, एक सामूहिक तरीके से जंजीरों में चलते हैं. प्रवासन कार्यात्मक न्यूरॉन्स 11 में SVZ व्युत्पन्न progenitors के बाद परिपक्वता के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है और सहित कई कारकों और मार्गदर्शन के अणुओं द्वारा नियंत्रित किया जाता है: polysialylated तंत्रिका कोशिका आसंजन अणु (पीएसए NCAM) 12, Ephrins 13, 14 integrins, slits 15, विकास 16 कारकों और 17 न्यूरोट्रांसमीटर, हालांकि इस प्रक्रिया अंतर्निहित आणविक तंत्र पूरी तरह से समझ नहीं रहे हैं. Neuroblast प्रवास को विनियमित intracellular संकेत दे रास्ते की जांच कर वयस्क neurogenesis की एक बेहतर समझ प्रदान करेगा न केवल, लेकिन यह भी नए चिकित्सकीय के विकास के लिए योगदान देगामस्तिष्क की मरम्मत को बढ़ावा देने के दृष्टिकोण.

इस पांडुलिपि nucleofection और एक 3 डी प्रवास परख का उपयोग इन विट्रो में Neuroblast प्रवास के उम्मीदवार नियामकों की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. Nucleofection electroporation के एक उन्नत विधि पर आधारित एक सेल अभिकर्मक तकनीक है. सेल प्रकार विशिष्ट बिजली के वर्तमान और nucleofection समाधान की अनुमति सीधे सेल नाभिक और धीरे से विभाजित या mitotically भ्रूण और स्तनधारी न्यूरॉन्स 18 की तरह निष्क्रिय कोशिकाओं का परमिट अभिकर्मक में इस तरह के डीएनए और shRNA वैक्टर और siRNA oligonucleotides के रूप में polyanionic अणुओं का हस्तांतरण. इस विधि, तेजी से प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत आसान और प्राथमिक neuroblasts और न्यूरॉन्स 19-21 सहित सेल प्रकार की एक विस्तृत रेंज का अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अभिकर्मक में परिणाम है.

आरएमएस ऊतक की हदबंदी सफलतापूर्वक डीएनए / SHR साथ nucleofected किया जा सकता है जो प्रवासी neuroblasts के अलगाव की अनुमति देता हैएनए वैक्टर या siRNA oligos ब्याज की जीन को लक्षित. Nucleofection के बाद, neuroblasts बूँदें फांसी में reaggregated कर रहे हैं और बाद में एक तीन आयामी Matrigel मैट्रिक्स में एम्बेडेड. ये स्थितियां इस प्रकार Neuroblast प्रवास में शामिल संकेत दे रास्ते की जांच करने के लिए और इन कोशिकाओं की गतिशीलता पर औषधीय उपचार के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक शानदार मॉडल प्रणाली प्रदान करने, neuroblasts vivo में मनाया प्रवास मोड recapitulating सेल समुच्चय से बाहर पलायन करने की अनुमति.

Protocol

यह प्रक्रिया ब्रिटेन के गृह मंत्रालय विनियम (पशु वैज्ञानिक प्रक्रिया अधिनियम, 1986) के अनुसार है. वैज्ञानिकों की स्थापना की और उनके संस्थागत और राष्ट्रीय पशु नियामक संगठनों द्वारा अनुमोदित दिशा निर्देशों का पालन करना चाहिए.

1. विच्छेदन और चूहा आरएमएस neuroblasts की हदबंदी

  1. आरएमएस विच्छेदन और पृथक्करण के लिए आवश्यक समाधान तैयार:

विच्छेदन मध्यम (100 मिलीलीटर)
हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) - 98.5 मिलीलीटर
5 एम HEPES पीएच 7.4-0.5 मिलीलीटर
पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (10,000 इकाइयों / एमएल और 10,000 ग्राम / एमएल) - 1 मिलीलीटर

हदबंदी माध्यम (2 मिलीलीटर)
HBSS - 1.760 मिलीग्राम
10x Trypsin (2.5%) - 200 μl
DNAse1 (1 मिलीग्राम / एमएल) - 40 μl

Dulbecco ईगल मध्यम (DMEM) + 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) (40 एमएल) संशोधित
DMEM -36 मिलीलीटर
एफसीएस - 4 मिलीलीटर

पूरा मध्यम (12 एमएल)

Neurobasal मध्यम - 11.46 मिलीलीटर
B27 पूरक - 250 μl
एल Glutamine (200 मिमी) - 125 μl
ग्लूकोज (45%) - 165 μl

2. DMEM + 10% FCS और पूरा मध्यम फिल्टर बाँझ और एक 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में उन्हें preequilibrate.

  1. विच्छेदन
    1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से एक P6-P7 चूहा कूड़े (लगभग 12 पिल्ले) बलिदान और कैंची से सिर काटना.
    2. एक स्केलपेल ब्लेड के साथ सेरिबैलम को नाक से मध्य बाण के समान सीवन के साथ त्वचा में एक अग्रपश्चस्थ चीरा. त्वचा छील और खोपड़ी के साथ एक ही चीरा दोहराएँ.
    3. धीरे संदंश के साथ कपाल फ्लैप को हटाने और ध्यान से घ्राण बल्ब शामिल करने के ख्याल रख रही है, एक रंग के साथ मस्तिष्क को हटा दें.
    4. मस्तिष्क के सबसे दुम तीसरी कट और यह त्यागें.
    5. वें जल्दएक ऊतक हेलिकॉप्टर का उपयोग 1.4 मिमी मोटी राज्याभिषेक स्लाइस में ई मस्तिष्क के ऊतकों.
    6. ठंड विच्छेदन मध्यम युक्त व्यंजन में स्लाइस रखें और ध्यान से एक सुई का उपयोग कर उन्हें अलग.
    7. आरएमएस एक त्रिकोणीय ओब वर्गों के केंद्र में और अधिक दुम मस्तिष्क स्लाइसें में एक छोटा सा, परिपत्र क्षेत्र के रूप में पारदर्शी क्षेत्र के रूप में प्रकट होता है. आसपास के ऊतकों सहित बचने के ख्याल रख रही है, एक microsurgical चाकू के साथ प्रत्येक टुकड़ा के बाहर आरएमएस काटें. P7 चूहे पिल्ले में, आमतौर पर (ओ सहित) ~ 8 सबसे व्याख्यान चबूतरे वाला स्लाइस आरएमएस होते हैं.
    8. एक प्लास्टिक पाश्चर विंदुक के साथ आरएमएस टुकड़े ले लीजिए और बर्फ पर ठंड विच्छेदन मध्यम युक्त एक छोटा सा पकवान में उन्हें जगह है.
    9. विच्छेदन के पूरा होने पर, एक प्लास्टिक विंदुक के साथ एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में आरएमएस टुकड़े हस्तांतरण. ट्यूब के नीचे बसा टुकड़े छोड़ दें.
  2. हदबंदी
    1. हदबंदी मध्यम 2 मिलीलीटर के साथ विच्छेदन के माध्यम से बदलें.
    2. धीरे पी द्वारा आरएमएस टुकड़े Triturateऔर के बारे में 10x एक P1000 विंदुक का उपयोग कर नीचे टुकड़ा निलंबन ipetting.
    3. 2 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ऊतक टुकड़े के साथ ट्यूब छोड़ दें.
    4. फिर 10x समाधान पिपेट और टुकड़े (निलंबन बादल बन जाना चाहिए) अलग है कि यह सुनिश्चित करें.
    5. Prewarmed DMEM + 10% FCS के 5 मिलीलीटर जोड़कर trypsin निष्क्रिय.
    6. 5 मिनट के लिए 433 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र.
    7. इस बीच विभाज्य में Eppendorf ट्यूबों में siRNA / डीएनए के लिए आवश्यक राशि (आमतौर पर 3-5 ग्राम डीएनए / shRNA या nucleofection प्रति 5-9 ग्राम siRNA oligo, हालांकि डीएनए / siRNA की राशि अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती).
    8. अतिरिक्त मध्यम निकालें और prewarmed DMEM + 10% FCS के 5 मिलीलीटर में कोमल pipetting द्वारा सेल गोली resuspend.
    9. एक कोशिका गिनती प्रदर्शन करना. चूहे पिल्ला मस्तिष्क प्रति ~ 1 x 10 6 कोशिकाओं की अपेक्षा करें. जबकि 2.5 x 10 6 कोशिकाओं की एक न्यूनतम, प्रत्येक nucleofection के लिए आवश्यक हैंइष्टतम परिणाम nucleofection प्रति 3-4 x 10 6 कोशिकाओं का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं.
    10. 5 मिनट के लिए 433 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र. जितना संभव हो उतना मध्यम हटाने के लिए सुनिश्चित करें.

2. Nucleofection

  1. पहले कमरे के तापमान पर incubated न्यूरॉन nucleofection समाधान (चूहे की कोशिकाओं का उपयोग अगर या माउस) तुरंत चूहे में सेल गोली resuspend. Nucleofection प्रति 100 μl का उपयोग करें:. आमतौर पर 12 पिल्ले की एक चूहा कूड़े 4 nucleofections करने के लिए पर्याप्त है और एक माउस कूड़े (12 पिल्ले) 2 nucleofections करने के लिए पर्याप्त है.
  2. SiRNA / डीएनए युक्त प्रत्येक Eppendorf ट्यूब सेल निलंबन के 100 μl स्थानांतरण और एक P200 विंदुक के साथ pipetting द्वारा धीरे 2-3X मिश्रण.
  3. बुलबुले से बचने के ख्याल रख रही है, nucleofectioncuvette की तह तक नमूना (cell-DNA/siRNA निलंबन) जोड़ें.
  4. Nucleofect कार्यक्रम जी 013 (चूहे की कोशिकाओं के लिए) का उपयोग कर या O-005 (के लिएमाउस कोशिकाओं). एक nucleofection लगभग 5 सेकंड लेता है.
  5. जल्दी nucleofected नमूना करने prewarmed DMEM + 10% FCS के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
  6. दोहराएँ 2.4 और अन्य सभी नमूनों के लिए 2.5 दोहराएँ. नोट: इष्टतम परिणामों के लिए, पूरे nucleofection प्रक्रिया 5 मिनट से अधिक समय नहीं पिछले चाहिए.
  7. Nucleofection किट द्वारा प्रदान की प्लास्टिक पिपेट का उपयोग prewarmed DMEM + 10% FCS के 5 मिलीलीटर युक्त एक 15 मिलीलीटर ट्यूब को प्रत्येक नमूना हस्तांतरण. ट्यूब के लिए किसी भी सेलुलर मलबे को स्थानांतरित करने से बचें.
  8. 5 मिनट के लिए 433 XG पर अपकेंद्रित्र नमूने.
  9. ध्यान से सभी अतिरिक्त मध्यम निकालें और एक P20 पिपेट का उपयोग prewarmed DMEM + 10% FCS का 25-30 μl में गोली resuspend. मध्यम के 30 से अधिक μl का उपयोग न करें.
  10. एक P35 डिश ढक्कन के भीतर की ओर पर एक बूंद के रूप में निलंबन पिपेट.
  11. (1 आंकड़ा भी देखें) पूरा मध्यम 2 मिलीलीटर युक्त P35 पकवान पर ढक्कन उलटें.
  12. पर के लिए (37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2) इनक्यूबेटर में छोड़ दो7 घंटा के लिए कम से कम 5 घंटा और. अब ऊष्मायन समय सेल समूहों के बेहतर reaggregation अनुमति देता है.
  13. एक कट टिप के साथ एक P1000 पिपेट का उपयोग पकवान में पूरा मध्यम में ढक्कन से लटका बूँदें स्थानांतरण.
  14. डीएनए nucleofections और siRNA / shRNA nucleofections के लिए 48 घंटे के लिए 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 सेते हैं.

3. एम्बेड

  1. पूरा मध्यम (25 मिलीलीटर) को तैयार है और कुछ घंटों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 में यह preequilibrate.
  2. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के जमे हुए aliquots के बाहर ले जाओ और ठंडे कमरे में बर्फ पर पिघलना.
  3. प्रत्येक आठ 13 मिमी बाँझ coverlips युक्त एक 6 सेमी पकवान तैयार nucleofection लिए.
  4. चिपटना फिल्म के साथ कवर एक आइस बॉक्स पर बर्तन रखें. एम्बेड प्रक्रिया के दौरान मैट्रिक्स solidification को रोकने के लिए शांत coverslips रखने के लिए महत्वपूर्ण है.
  5. नमी बनाए रखने के लिए, एक 15 सेमी पकवान अंदर नम ऊतक का एक पट्टी जगह है कि wबीमार एम्बेडेड neuroblasts युक्त तीन 6 सेमी व्यंजन को पकड़ करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
  6. एक 01:03 अनुपात में thawed मैट्रिक्स को पूरा मध्यम जोड़ें. उदाहरण के लिए, pipetting द्वारा मैट्रिक्स के 120 μl के साथ पूरा मध्यम के 40 μl मिश्रण. मैट्रिक्स की यह राशि आठ से 12 मिमी coverslips पर समुच्चय एम्बेड करने के लिए पर्याप्त है.
  7. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र में करने reaggregated सेल समूहों स्थानांतरण 5 मिनट के लिए 433 XG.
  8. अतिरिक्त मध्यम निकालें और पूरा मध्यम के 10 μl में गोली resuspend.
  9. प्रत्येक बाँझ coverslip पर सेल कुल निलंबन के 2 μl प्लेस और मैट्रिक्स / पूरा मध्यम मिश्रण के 18 μl जोड़ें. पूरे coverslip से अधिक मैट्रिक्स प्रसार करने के लिए पिपेट टिप का उपयोग करें.
  10. इसके तत्काल बाद 15 सेमी पकवान में coverslips युक्त 6 सेमी पकवान जगह और 15-20 मिनट के लिए (37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2) इनक्यूबेटर में छोड़ दें. मैट्रिक्स जम गया है, धीरे पुश करने के लिए प्रत्येक 6 सेमी पकवान ख्याल रखने के लिए 5 एमएल पूरा मध्यम जोड़नेएक विंदुक टिप के साथ किसी भी चल coverslip नीचे.
  11. Neuroblasts सेल समुच्चय से बाहर पलायन करने देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 में 24 घंटे के लिए सेते हैं.

4. 3 डी प्रवासन परख

  1. Immunostaining के लिए आवश्यक समाधान तैयार करें.
    1. ब्लॉक समाधान तैयार:
      बकरी ब्लॉक समाधान (50 मिलीलीटर)
      फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) - 5 मिलीलीटर
      बकरी सीरम - 7.5 मिलीलीटर
      10% ट्राइटन X-100 - 1.5 मिलीलीटर
      बीएसए - 50 मिलीग्राम
      एच 2 ओ - 36 मिलीलीटर
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर फ़िल्टर और दुकान
    3. फिक्सिंग समाधान तैयार:
      (100 मिलीलीटर) समाधान फिक्सिंग
      Paraformaldehyde (पीएफए) - 4 जी चेतावनी: हमेशा एक डाकू के तहत पीएफए ​​संभाल
      सुक्रोज - 20 ग्राम (वैकल्पिक)
      पीबीएस 100 मिलीलीटर
    4. एक गर्म थाली पर और लगातार सरगर्मी के तहत 80 मिलीलीटर में पीएफए ​​भंग पीबीएस 65 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा
    5. पीएफए ​​भंग कर दिया है, सुक्रोज के 20 ग्राम जोड़ें.
    6. पीएच को समायोजित करें7.4 (आमतौर पर समाधान के 100 मिलीलीटर प्रति ~ 60 μl 1 एम NaOH जोड़कर).
    7. पीबीएस के साथ 100 मिलीलीटर की कुल मात्रा को लाओ.
  2. Immunostaining
    1. 24 अच्छी तरह से थाली में coverslips रखें.
    2. पीबीएस 2x साथ coverslips कुल्ला.
    3. कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए फिक्सिंग समाधान के साथ आरएमएस Neuroblast समुच्चय को ठीक करें.
    4. पीबीएस 3X के साथ coverslips (- एक कमाल मंच पर 5 मिनट / धोने) कुल्ला.
    5. बकरी ब्लॉक समाधान के साथ 30-60 मिनट के लिए ब्लॉक.
    6. बकरी ब्लॉक समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी पतला और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते (यदि वांछित, फ्लोरोसेंट phalloidin (1:400) और Hoechst डाई (1:10,000) भी filamentous actin और नाभिक कल्पना करने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के लिए जोड़ा जा सकता है).
    7. पीबीएस 3x (5 मिनट / धोने) के साथ coverslips कुल्ला.
    8. बकरी ब्लॉक समाधान में माध्यमिक एंटीबॉडी पतला और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए सेते हैं.
    9. Coversli कुल्लापीबीएस 3X के साथ पी एस (5 मिनट / धोने)
    10. माउंट फ्लोरोसेंट बढ़ते मध्यम के साथ coverslips और कमरे के तापमान पर रातोंरात सूखे के लिए छोड़ दें.
  3. प्रवासन विश्लेषण
    1. एक 10x उद्देश्य का उपयोग एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ तय आरएमएस Neuroblast समुच्चय की छवियों पर कब्जा. एक नमूना छवि में एक पैमाने बार शामिल हैं.
    2. , मात्रा का ठहराव के लिए पैमाने की स्थापना ImageJ उपकरण पट्टी पर 'सीधी रेखा' उपकरण का चयन करके छवि में पैमाने पर पट्टी मापने के लिए.
    3. 'विश्लेषण' विकल्प चुनें और 'सेट पैमाने' पर क्लिक करें.
    4. पैमाने विंडो में 'ज्ञात दूरी' की स्थापना की और सभी मापन के लिए एक ही सेटिंग रखने के लिए 'वैश्विक' बॉक्स टिकटिक.
    5. पूरे कुल (3B चित्रा) के आसपास 6 अलग क्षेत्रों में दूर चले गए Neuroblast को कुल के किनारे से दूरी को मापने के लिए ImageJ उपकरण पट्टी पर 'खंडों लाइन' उपकरण का उपयोग करें. केवल पृथक एजी पर विचारविश्लेषण के लिए gregates.
    6. प्रत्येक कुल प्राप्त के लिए 6 मूल्यों से एक औसत प्रवास दूरी की गणना.
    7. तीन स्वतंत्र प्रयोगों की एक न्यूनतम से हर स्वतंत्र प्रयोग और पूल के परिणाम में हर हालत के लिए 10-20 समुच्चय उपाय. हमेशा एक nucleofection नियंत्रण (उदाहरण. GFP या एक नियंत्रण एसएच / siRNA) शामिल हैं.

Representative Results

Neuroblasts सफलतापूर्वक dissected आरएमएस ऊतक (चित्रा 1 ए) से अलग किया और एक तीन आयामी मैट्रिक्स में एम्बेडेड जा सकता है. चूहा या माउस प्रसव के बाद आरएमएस से या तो अलग कक्षों ऐसे doublecortin (DCX), βIII ट्यूबिलिन या पीएसए NCAM (आंकड़े 1 बी सी) के रूप में प्रवासी Neuroblast मार्करों, के लिए immunopositive हैं.

अलग neuroblasts कुशलता से डीएनए के साथ nucleofected जा सकता है (उदाहरण के लिए. एक GFP एन्कोडिंग प्लाज्मिड, चित्रा 2) पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है, जो प्रोटीन कमी को प्राप्त करने या shRNA plasmids (चित्रा 4), चित्रा (4 बी) या immunofluorescence () नहीं दिखाया .

GFP एन्कोडिंग plasmids के साथ nucleofected प्रकोष्ठों reaggregated Neuroblast समूहों (चित्रा 3) बाहर त्रिज्यात विस्थापित. (3B चित्रा) को एम्बेड रिश्तेदार माइग्रेट दूरी 24 घंटे बाद की मात्रा GFP-मंज़ूर बीच प्रवास में कोई अंतर से पता चलता है nucleofection से प्रति प्रवास को बाधित नहीं करता है यह दर्शाता है कि कोशिकाओं और GFP नकारात्मक, nonnucleofected कोशिकाओं (चित्रा -3 सी) ive. सीधे आरएमएस explants (नहीं दिखाया डेटा) से बाहर पलायन nucleofected neuroblasts और neuroblasts के बीच माइग्रेशन की हद में कोई महत्वपूर्ण अंतर भी है.

चित्रा 1
चित्रा 1. आरएमएस neuroblasts के विच्छेदन. आरएमएस Neuroblast विच्छेदन की (ए) योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. विस्तृत विवरण के लिए पाठ देखें. (बी) पृथक चूहा आरएमएस कोशिकाओं प्रवासी Neuroblast निर्माताओं DCX और βlll ट्यूबिलिन के लिए immunopositive हैं. माउस आरएमएस explants के बाहर पलायन बार, 20 माइक्रोन. (सी) कक्ष प्रवासी Neuroblast DCX और पीएसए NCAM मार्करों व्यक्त. बार, 20 माइक्रोन.0989/50989fig1highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. माउस Neuroblast nucleofection. Dissociated माउस आरएमएस neuroblasts, Pmax-GFP के साथ nucleofected reaggregated, एक तीन आयामी मैट्रिक्स में एम्बेडेड और 6 घंटे के लिए विस्थापित करने की अनुमति दी गई. एक reaggregated सेल क्लस्टर से बाहर पलायन neuroblasts (ऊपर, चरण विपरीत चित्रों) उच्च अभिकर्मक दक्षता (नीचे, GFP चैनल चित्र) दिखा. सही स्तंभ पैनल बाएँ स्तंभ पैनल में डाला insets को इसी उच्च बढ़ाई तस्वीरें दिखा. बार्स, 20 माइक्रोन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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चित्रा 3. 3 डी प्रवासन परख. (ए) चूहा neuroblasts Pmax-GFP (GFP) या pCAG-IRES-EGFP reaggregated 22 (ईवी), मैट्रिक्स में एम्बेडेड और 24 घंटे के लिए विस्थापित करने के लिए छोड़ दिया साथ nucleofected गया. कोशिकाओं तो तय और GFP (हरा) और βIII ट्यूबिलिन (लाल) के लिए immunostained गया. बार, 50 माइक्रोन. (बी) ImageJ का उपयोग प्रवास दूरी मापने. reaggregated सेल क्लस्टर 6 बराबर सेक्टरों में बांटा गया है. क्लस्टर (बिंदीदार रेखा) और दूर चले गए सेल के किनारे के बीच की दूरी प्रत्येक क्षेत्र के लिए मापा जाता है. सापेक्ष दूरी (सी) मात्रा nucleofected कोशिकाओं से माइग्रेट (GFP पॉजिटिव) और नियंत्रण, nonnucleofected कोशिकाओं (GFP नकारात्मक) . बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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चित्रा 4. ShRNA nucleofection के बाद Neuroblast प्रवास निगरानी. (ए) चूहा neuroblasts (भी EGFP 23 व्यक्त करता है जो पीसीए-B-EGFPm5 रवशामक 3) एक नियंत्रण shRNA वेक्टर या एक shRNA fascin को लक्षित, एक actin-bundling प्रोटीन 24 से युक्त एक ही वेक्टर साथ nucleofected गया. सेल, 48 घंटा से अधिक reaggregated मैट्रिक्स में एम्बेडेड और 24 घंटे के लिए विस्थापित करने के लिए छोड़ दिया गया. समुच्चय फिर तय की और GFP (हरा) और βIII ट्यूबिलिन (लाल) के लिए immunostained गया. बार, 50 माइक्रोन. (बी) प्रभावी fascin कमी पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा shRNA nucleofection के बाद 50 घंटे से पता लगाया जा सकता है. Actin एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में यहाँ दिखाया गया है (सी) fascin कमी काफी Neuroblast प्रवास impairs दिखा रहा है कि रिश्तेदार प्रवास दूरी के मात्रात्मक विश्लेषण. (± SEM मतलब है, ** पी <0.01, n = 3 स्वतंत्र प्रयोगों).

Discussion

ओबी में अंतिम स्थान पर आरएमएस साथ neuroblasts के प्रवास प्रसवोत्तर neurogenesis में एक बुनियादी कदम है. हालांकि, इस जटिल प्रक्रिया को नियंत्रित करने के आणविक तंत्र अब तक पूरी तरह समझा जा रहा से कर रहे हैं.

यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रिया विट्रो में Neuroblast प्रवास के अध्ययन की अनुमति देता है. हम जल्दी प्रसव के बाद माउस या चूहा 25 से आरएमएस neuroblasts अलग करने के लिए एक पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल ढाल लिया है. यह एक न्यूनतम करने के लिए विच्छेदन और nucleofection के बीच समय अंतराल रखने के लिए महत्वपूर्ण है के बाद से इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए यह, विच्छेदन कदम मास्टर करने के लिए महत्वपूर्ण है. Nucleofection के बाद, neuroblasts, reaggregated किया जा सकता है एक तीन आयामी मैट्रिक्स में एम्बेडेड और एक 24 घंटे की अवधि में विस्थापित करने के लिए छोड़ दिया है. वैकल्पिक रूप से, माइग्रेशन (जैसे immunofluorescence या पश्चिमी धब्बा विश्लेषण) के अलावा अन्य प्रयोजनों के लिए, कोशिकाओं तुरंत polyornithine/laminin- पर nucleofection के बाद चढ़ाया जा सकता हैवे 4-5 दिनों तक जीवित रहते हैं जहां लेपित coverslips,. माउस और चूहा neuroblasts एक समान हद तक Matrigel में विस्थापित, लेकिन चूहे की कोशिकाओं चूहे की कोशिकाओं से जंजीरों में माइग्रेट करने के लिए एक मजबूत प्रवृत्ति दिखाई देते हैं.

अध्ययन का उद्देश्य पर निर्भर करता है, neuroblasts फ्लोरोसेंट प्रोटीन या ब्याज के जंगली प्रकार / उत्परिवर्ती प्रोटीन एन्कोडिंग अलग plasmids के साथ nucleofected किया जा सकता है. (सीएमवी बढ़ाने और β ग्लोबिन पाली एक पूंछ के साथ β-actin के प्रमोटर) एक सीएजी प्रमोटर के साथ इष्टतम प्रोटीन अभिव्यक्ति plasmids के लिए 26 अत्यधिक की सिफारिश कर रहे हैं. इसके अलावा, siRNA oligos या shRNA plasmids ब्याज का लक्ष्य पछाड़ना के nucleofected किया जा सकता है. प्रभावी प्रोटीन कमी immunofluorescence द्वारा या वेस्टर्न ब्लॉट (आमतौर पर मानक lysis बफर के 50 μl के साथ 1 चूहे पिल्ला से एम्बेडेड समुच्चय lysing) द्वारा देखे जा सकते हैं.

Nucleofection, प्राथमिक neuroblasts transfect करने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल विधि है छठे के लिए एक आसान और तेजी से विकल्प प्रदान करता हैRAL वेक्टर की मध्यस्थता अभिकर्मक, और उच्च (~ 70-80%) अभिकर्मक दक्षता हासिल कर सकते हैं. यह काफी सेल व्यवहार्यता कम कर देता है एक लंबे समय के लिए nucleofection समाधान में neuroblasts छोड़ने के बाद से, nucleofection प्रक्रिया के दौरान तेजी से काम करने के लिए महत्वपूर्ण है.

आरएमएस विच्छेदन से औसत सेल उपज P7 चूहों की तुलना में (~ 5 x 10 5 कोशिकाओं / मस्तिष्क) P7 चूहों के लिए अपेक्षाकृत कम है (~ 1 x 10 6 कोशिकाओं / मस्तिष्क) और nucleofection के अनुसार कम से कम 3 x 10 6 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है 50% दक्षता ~ साथ अभिकर्मक प्राप्त करने के लिए. इसके अलावा, चूहे neuroblasts माउस neuroblasts की तुलना में nucleofection को बेहतर विरोध करने के लिए दिखाई देते हैं. इसलिए, जल्दी प्रसव के बाद (P6-P7) चूहे पिल्ले भी चूहा और माउस आरएमएस के संगठन उल्लेखनीय सिमी हैं, विचार है कि एक सुविधाजनक Neuroblast स्रोत का प्रतिनिधित्व हो सकताLAR 27 और कहा कि इन विट्रो में चूहा और माउस Neuroblast प्रवास की हद तक भी तुलनीय है. यह सेल आकारिकी और माइग्रेशन (हमारे अप्रकाशित टिप्पणियों) पर असामान्य प्रभाव से बचने के लिए 48 घंटे से अधिक समय के लिए निलंबन में nucleofected neuroblasts के reaggregated समूहों रखने के लिए उचित नहीं है.

यहाँ वर्णित 3D परख मैट्रिक्स (जैसे. 24 घंटे) में एम्बेड करने के बाद एक निश्चित समय बिंदु पर Neuroblast प्रवास यों इस्तेमाल किया जा सकता है. समुच्चय के आकार और प्रवास दूरी (हमारे अप्रकाशित टिप्पणियों) के बीच कोई महत्वपूर्ण संबंध के बाद से वहाँ विभिन्न आकार के समुच्चय, विश्लेषण में इस्तेमाल किया जा सकता है. कल्पना और आगे Neuroblast प्रवास की गतिशीलता की जांच, समय चूक इमेजिंग का इस्तेमाल किया जा सकता है. यह neuroblasts की गति काफी लंबे समय के अंक में (हमारे अप्रकाशित टिप्पणियों) में कमी करने के लिए प्रकट होता है के बाद से, एम्बेड करने के बाद एक 24 घंटे के अंतराल के भीतर माइग्रेशन विश्लेषण से बाहर ले जाने की सिफारिश की है. </ P>

इस प्रोटोकॉल के लिए कुछ सीमाएं हैं. वायरल वैक्टर के साथ संक्रमण वयस्क neuroblasts 28 के लिए सबसे कुशल अभिकर्मक विधि बनी हुई है, जबकि पहले, nucleofection अब तक, जल्दी प्रसव के बाद कृंतक neuroblasts के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दूसरा, इन विट्रो प्रवास परख पूरी तरह vivo में मनाया आरएमएस की जटिल वास्तुकला पुन: पेश नहीं करता है. दरअसल, neuroblasts वे ऐसे भी उनकी गतिशीलता 9,29 को विनियमित करने के लिए जो योगदान astrocytes और रक्त वाहिकाओं के रूप में अन्य आरएमएस घटकों के साथ बातचीत की कमी यहां वर्णित प्रयोगात्मक सेटअप में, उनके vivo समकक्षों के लिए एक समान तरीके से विस्थापित करने की क्षमता बनाए रखने के लिए हालांकि, 30. यह समस्या तीन आयामी coculture मॉडल प्रणाली के अनुकूलन द्वारा भविष्य में संबोधित किया जा सकता है.

अंत में, एक 3 डी प्रवास परख के साथ nucleofection संयोजन बेहतर अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करता हैNeuroblast प्रवास. इस प्रयोगात्मक प्रक्रिया आगे vivo में प्रसव के बाद electroporation और मस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों के समय चूक इमेजिंग जैसे अन्य तरीकों से मान्य किया जा सकता है, जो Neuroblast प्रवास के उम्मीदवार नियामकों की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए एक, प्रारंभिक तेजी से और अपेक्षाकृत सरल तरीका प्रदान करता है 28,31,32 .

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम पीडी और जीएल के लिए सम्मानित किया वेलकम ट्रस्ट परियोजना अनुदान (089236/Z/09/Z) द्वारा वित्त पोषित किया गया. एसजी एक जैव प्रौद्योगिकी और जैव विज्ञान अनुसंधान परिषद पीएचडी छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित किया गया. हम Neuroblast nucleofection पर मूल्यवान सलाह के लिए shRNA वेक्टर और जेनिफर Shieh की तरह उपहार के लिए Matthieu Vermeren धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen Life Technologies 14175129
HEPES Sigma-Aldrich H3375-25G
Penicillin-Streptomycin Invitrogen Life Technologies 15140-122
2.5% Trypsin-EDTA (10x) Gibco 15090-046 store 200 µl aliquots at -20 °C
DNAse I Vial (D2) Worthington LK003170 ≥1,000 units per vial; store 50 µl aliquots at -20 °C
Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) Gibco 11960-044
Fetal Calf Serum (FCS) Hyclone SH3007902
Neurobasal medium Gibco 21103-049
B27 supplement Invitrogen Life Technologies 17504044
L-Glutamine (200 mM) Invitrogen Life Technologies 25030-081
D-(+)-Glucose solution (45%) Sigma-Aldrich G8769
Matrigel Basement Membrane Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-free, 10 ml, LDEV-Free BD Biosciences 356231 prepare 120 µl aliquots at 4 °C, then store at -80 °C
PFA Sigma-Aldrich 441242
Sucrose BDH 102745C
Goat serum Sigma-Aldrich 69023
Triton X-100 VWR International Ltd. 306324N
BSA Fisher Chemical BPE9701-100
Dako fluorescence mounting medium Dako S3023
Rat neuron nucleofection kit Lonza VPG-1003
Mouse neuron nucleofection kit Lonza VPG-1001
Microsurgical knife Angiotech 7516
McIlwain tissue chopper The Mickle Laboratory Engineering Company
Nucleofector II Lonza

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References

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कृंतक neuroblasts की nucleofection Neuroblast प्रवास का अध्ययन करने के लिए<em&gt; इन विट्रो</em
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Falenta, K., Gajendra, S., Sonego, M., Doherty, P., Lalli, G. Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro. J. Vis. Exp. (81), e50989, doi:10.3791/50989 (2013).More

Falenta, K., Gajendra, S., Sonego, M., Doherty, P., Lalli, G. Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro. J. Vis. Exp. (81), e50989, doi:10.3791/50989 (2013).

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