Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Nucleofection av Rodent neuroblasts å studere neuroblast Migration doi: 10.3791/50989 Published: November 12, 2013
* These authors contributed equally

Summary

Neuroblast migrasjon er et viktig skritt i postnatal neurogenesis. Protokollen er beskrevet her kan brukes til å undersøke hvilken rolle kandidat regulatorer av neuroblast migrasjon ved å bruke DNA / liten hårnål RNA (shRNA) nucleofection og en 3D migrasjon analysen med neuroblasts isolert fra gnager postnatal rostral migrasjonsstrømmen.

Abstract

Subventricular sone (SVZ) ligger i den laterale vegg av sideventriklene spiller en fundamental rolle i voksen neurogenesis. I dette begrensede området av hjernen, nevrale stamceller spre seg og stadig generere neuroblasts som vandrer tangentielt i kjettinger langs rostral migrasjonsstrømmen (RMS) for å nå luktelappen (OB). En gang i OB, neuroblasts bytte til radial migrasjon og deretter skille seg til modne nerveceller i stand til å innlemme i den allerede eksisterende nevronale nettverk. Riktig neuroblast migrasjon er et fundamentalt skritt i neurogenesis, sikrer riktig funksjonelle modning av nyfødte nerveceller. Gitt evne SVZ-avledet neuroblasts å målrette skadede områder i hjernen, gransker intracellulære mekanismene bak deres motilitet ikke bare vil øke forståelsen av neurogenesis, men kan også bidra til utvikling av neuroregenerative strategier.

Dette manuskriptet beskriver en detaljertprotokoll for transfeksjon av primær gnager RMS postnatal neuroblasts og analyse av deres motilitet ved hjelp av en 3D in vitro migrasjon analysen rekapitulere sin modus av migrasjon observert in vivo. Både rotte-og muse neuroblasts kan raskt og effektivt via nucleofection transfektert enten med plasmid-DNA, liten hårnål (sh) RNA eller kort interfererende (si) RNA oligos rettet gener som er av interesse. Å analysere migrasjon, er nucleofected celler reaggregated i 'hengende dråper' og senere innebygd i en tredimensjonal matrise. Nucleofection per se ikke vesentlig svekker migrasjon av neuroblasts. Medikamentell behandling av nucleofected og reaggregated neuroblasts kan også utføres for å studere rollen til signalveier involvert i neuroblast migrasjon.

Introduction

I den postnatal hjernen hos pattedyr, generering av nye nerveceller (neurogenesis) skjer gjennom hele livet, og er begrenset til to nevrogene nisjer: subventricular sone (SVZ) av den laterale ventriklene og subgranular sone av dentate gyrus av hippocampus en. Flere nyere studier har vist den viktige rollen som voksen neurogenesis i å tilrettelegge læring og hukommelse oppgaver 2,3. Videre bevis på spredning og rekruttering av nevrale stamceller følgende hjerneskade 4-7 øker muligheten for farmakologiske aktivering av neurogenesis i nevrale reparasjon.

Postnatal neurogenesis er strengt regulert i alle dens faser, som inkluderer nevrale stamceller spredning, migrasjon, differensiering, overlevelse, og endelig synaptiske integrering av nyfødte nerveceller åtte. Nevrale stamceller (neuroblasts) avledet fra stamceller i SVZ migrere over en stor avstand gjennom rostral vandrendestream (RMS) mot luktelappen (OB) hvor de modnes til funksjonelle nerveceller ni. Trekkende neuroblasts er overveiende unipolar, med en langstrakt cellekroppen strekker en enkelt ledende prosess. Disse cellene beveger seg i kjeder i en kollektiv måte, glir over hverandre 10. Migrasjon er et viktig skritt for den påfølgende modning av SVZ-avledet stamceller inn i funksjonelle nerveceller 11 og styres av flere faktorer og veiledning molekyler inkludert: polysialylated nevrale celleadhesjonsmolekylet (PSA-NCAM) 12, Ephrins 13, inte 14, Slits 15, vekstfaktorer 16 og nevrotransmitterne 17, men de molekylære mekanismene bak denne prosessen ikke er fullt ut forstått. Gransker de intracellulære signalveier som regulerer neuroblast migrasjon vil ikke bare gi en bedre forståelse av voksen neurogenesis, men vil også bidra til utvikling av nye terapeutisketilnærminger for å fremme hjernen reparasjon.

Dette manuskriptet beskriver en detaljert protokoll for å studere rollen til kandidat regulatorer av neuroblast migrasjon in vitro ved hjelp nucleofection og en 3D migrasjon analysen. Nucleofection er en celle transfeksjon teknikk basert på en forbedret fremgangsmåte for elektroporering. Cell-type spesifikke elektrisk strøm og nucleofection løsning tillate overføring av polyanionisk makromolekyler som DNA og shRNA vektorer og siRNA oligonukleotider direkte inn i cellekjernen og tillatelse transfeksjon av sakte å dele eller mitotisk inaktive celler som embryonale og pattedyr nevroner 18. Denne metoden er rask, relativt enkel å utføre og resultater i svært reproduserbare transfeksjon av et bredt spekter av celletyper, inkludert primær neuroblasts og nevroner 19-21.

Dissosiasjon av RMS vev tillater isolering av trekk neuroblasts, noe som kan med hell nucleofected med DNA / SHRNA vektorer eller siRNA oligos målretting gener av interesse. Etter nucleofection, er neuroblasts reaggregated i hengende dråper og senere innebygd i en tredimensjonal Matrigel matrise. Disse betingelsene tillater neuroblasts til å migrere ut av celleaggregater rekapitulere migreringsmodus observert in vivo, og dermed gi en utmerket modellsystem for å undersøke signalveier som er involvert i neuroblast migrering og å vurdere påvirkning av farmakologiske behandlinger på motilitet av disse cellene.

Protocol

Denne fremgangsmåten er i samsvar med de britiske hjemmekontoret Regulations (Animal vitenskapelige prosedyrer Loven, 1986). Forskere skal følge de retningslinjer som er fastsatt og godkjent av deres institusjonelle og nasjonale dyre regulatoriske organisasjoner.

En. Disseksjon og dissosiasjon av Rat RMS neuroblasts

  1. Forbered løsningene som kreves for RMS disseksjon og dissosiasjon:

Disseksjon medium (100 ml)
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) - 98,5 ml
5 M HEPES pH 7,4 - 0,5 mL
Penicillin-Streptomycin (10 000 enheter / ml og 10 000 pg / ml) - 1 ml

Dissosiasjon medium (2 ml)
HBSS - 1,760 ml
10x trypsin (2,5%) - 200 mL
DNAse1 (1 mg / ml) - 40 ul

Dulbecco Modified Eagle 's Medium (DMEM) + 10% kalvefosterserum (FCS) (40 ml)
DMEM -36 ml
FCS - 4 ml

Fullstendig medium (12 ml)

Neurobasal mellom - 11,46 ml
B27 Supplement - 250 mL
L-Glutamin (200 mm) - 125 mL
Glukose (45%) - 165 mL

2. Filter-steriliseres DMEM + 10% FCS, og den komplette medium, og preequilibrate dem i en 37 ° C / 5% CO2-inkubator.

  1. Disseksjon
    1. Ofre en P6-P7 rotte kull (ca 12 unger) ved halshugging og halshogge med saks.
    2. Gjør en anteroposterior snitt i huden langs midten av sagittal suturen fra nesen til lillehjernen med en skalpell blad. Skrelle den og gjenta samme snitt langs skallen.
    3. Fjern forsiktig kranie klaffer med tang og forsiktig fjerne hjernen med en slikkepott, ta vare å inkludere olfactory pærer.
    4. Skjær den mest caudal tredel av hjernen og kast den.
    5. Hakk the hjernevev til 1,4 mm tykke koronale stykker ved hjelp av en vev chopper.
    6. Plasser skiver i retter som inneholder kald disseksjon medium og nøye skille dem ved hjelp av en nål.
    7. RMS-vises som en trekantet, gjennomskinnelig område i sentrum av OB-seksjoner og som et lite, sirkulært område i flere halehjerneskiver. Skjær RMS ut av hver skive med en mikrokirurgisk kniv, ta vare å unngå å inkludere omkringliggende vev. I P7 rotteunger, vanligvis ~ åtte mest rostral skiver (inkludert OB) inneholder RMS.
    8. Samle RMS fragmenter med en plast Pasteur pipette og legg dem i en liten skål med kaldt disseksjon medium på is.
    9. Når disseksjon er fullført, overføres RMS-fragmenter inn i et 15 ml rør med en plastpipette. La fragmenter til å slå seg ned på bunnen av røret.
  2. Dissosiasjon
    1. Bytt disseksjon medium med 2 ml av dissosiasjon medium.
    2. Triturer RMS fragmenter ved forsiktig pipetting fragmentet suspensjon opp og ned om 10x ved hjelp av en P1000 pipette.
    3. La røret med vev fragmenter i et 37 ° C vannbad i 2 min.
    4. Pipetter løsningen igjen 10x og sikre at fragmenter har dissosiert (suspensjon bør bli grumsete).
    5. Inaktivere trypsin ved å tilsette 5 ml av forvarmet DMEM + 10% FCS.
    6. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 433 x g i 5 min.
    7. I mellomtiden aliquot den nødvendige mengde siRNA / DNA i Eppendorf-rør (vanligvis 3-5 ug DNA / shRNA eller 5-9 ug siRNA oligo pr nucleofection, men mengden av DNA / siRNA kan kreve optimalisering).
    8. Fjerne overskytende medium og cellepelleten suspenderes ved forsiktig pipettering i 5 ml forvarmet DMEM + 10% FCS.
    9. Utfør et celletall. Forvent ~ 1 x 10 6 celler per rotteavkom hjernen. Et minimum på 2,5 x 10 6-celler er nødvendig for hver nucleofection, samtidigoptimale resultater oppnås ved hjelp av 3-4 x 10 6 celler per nucleofection.
    10. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 433 x g i 5 min. Sørg for å fjerne så mye medium som mulig.

2. Nucleofection

  1. Umiddelbart cellepelleten suspenderes i rotte (eller mus ved bruk av museceller) neuron nucleofection løsning som tidligere inkubert ved romtemperatur. Bruk 100 ul pr nucleofection Obs. Typisk en rotte kull av unger 12 er tilstrekkelig til å utføre fire nucleofections og en mus kull (12 pups) er tilstrekkelig til å utføre to nucleofections.
  2. Overfør 100 ul cellesuspensjon til hver Eppendorf-rør inneholdende siRNA / DNA og bland forsiktig 2-3x ved pipettering med et P200-pipette.
  3. Tilsett prøven (cell-DNA/siRNA suspensjon) til bunnen av nucleofectioncuvette, idet forsiktighet for å unngå bobler.
  4. Nucleofect ved hjelp av program G-013 (for rotteceller) eller O-005 (formuseceller). En nucleofection tar ca 5 sek.
  5. Raskt legge en ml prewarmed DMEM + 10% FCS til nucleofected prøven.
  6. Gjenta trinn 2,4 og 2,5 for alle andre prøver. Merk: for optimale resultater, bør hele nucleofection prosedyren vare lenger enn 5 min.
  7. Overfør hver prøve i et 15 ml rør inneholdende 5 ml av forvarmet DMEM + 10% FCS ved hjelp av plast-pipette levert av nucleofection kit. Unngå å overføre noen mobilnettet rusk i røret.
  8. Sentrifuger prøvene ved 433 xg i 5 min.
  9. Fjern forsiktig all overflødig medium og resuspender pelleten i 25-30 mL av forvarmet DMEM + 10% FCS ved hjelp av en P20 pipette. Ikke bruk mer enn 30 mL av medium.
  10. Pipetter suspensjonen som en dråpe på den indre side av en p35 fatet lokk.
  11. Snu lokket over p35 skål inneholder 2 ml komplett medium (se også figur 1).
  12. Permisjon i inkubatoren (37 ° C / 5% CO 2) iminst 5 timer og opp til 7 timer. Lengre inkubasjonstid gir bedre reaggregation av celleklynger.
  13. Overfør de hengende dråper fra lokket inn i komplett medium i formen ved hjelp av en P1000 pipette med en cut spiss.
  14. Inkuber ved 37 ° C / 5% CO 2 for 24 timer for DNA nucleofections og 48 timer for siRNA / shRNA nucleofections.

Tre. Embedding

  1. Forbered komplett medium (25 ml) og preequilibrate det ved 37 ° C / 5% CO2 i et par timer.
  2. Ta ut de frosne porsjoner av basalmembran matrise fra -80 ° C fryser og tiner på is i det kalde rommet.
  3. For hver nucleofection forberede en 6 cm tallerken som inneholder opptil åtte 13 mm sterile coverlips.
  4. Plasser retter på en isen boksen dekket med plastfolie. Det er viktig å holde Dekk kult å hindre matrise størkning under embedding prosedyren.
  5. For å opprettholde fuktighet, legg en stripe av fuktig vev inne i en 15 cm rett som will brukes til å holde opp til tre 6 cm retter som inneholder den innebygde neuroblasts.
  6. Legg komplett medium til det tinte matrise i et 01:03-forhold. For eksempel, bland 40 ul av fullstendig medium med 120 mL av matrise ved pipettering. Denne mengden av matrisen er tilstrekkelig for innebygging tilslag på åtte 12 mm Dekk.
  7. Overfør reaggregated celle klynger til en 15 ml tube og sentrifuger ved 433 x g i 5 min.
  8. Fjerne overskytende medium og resuspender pelleten i 10 pl komplett medium.
  9. Plasser to mL av celle samlet suspensjon på hver sterile dekkglass og tilsett 18 mL av matrise / komplett medium blanding. Bruk pipetten til å spre matrisen over hele dekkglass.
  10. Umiddelbart plassere 6 cm skål med Dekk i 15 cm tallerken og la i inkubatoren (37 ° C / 5% CO 2) for 15-20 min. Når matrisen har stivnet, tilsett 5 ml komplett medium til hver 6 cm tallerken ta vare å pressened noen flytende dekkglass med en pipette tips.
  11. Inkuber i 24 timer ved 37 ° C / 5% CO2 for å la neuroblasts migrere ut av celleaggregater.

4. 3D Migration analysen

  1. Forbered løsningene som kreves for farging.
    1. Forbered blokken løsning:
      Geit blokk-løsning (50 ml)
      Fosfatbufret saltvann (PBS) - 5 ml
      Geit serum - 7,5 ml
      10% Triton X-100 til 1,5 ml
      BSA - 50 mg
      H 2 O - 36 ml
    2. Filter og oppbevar ved 4 ° C.
    3. Forbered festeløsning:
      Fikseringsoppløsning (100 ml)
      Paraformaldehyde (PFA) - 4 g FORSIKTIG: alltid håndtere PFA under en hette
      Sukrose - 20 g (valgfritt)
      PBS opp til 100 ml
    4. På en varm plate, og under konstant omrøring oppløse PFA i 80 ml PBS holdt ved 65 ° C.
    5. Når PFA er oppløst, tilsett 20 g sukrose.
    6. Juster pH til7.4 (vanligvis ved tilsetning av ~ 60 pl 1 M NaOH per 100 ml oppløsning).
    7. Ta opp til et totalt volum på 100 ml med PBS.
  2. Immunostaining
    1. Plasser Dekk i en 24-brønns plate.
    2. Skyll Dekk med PBS 2x.
    3. Fest RMS neuroblast tilslag med festeløsning for 45 minutter ved romtemperatur.
    4. Skyll Dekk med PBS 3x (5 min / vask - på en gynge plattform).
    5. Blokkere for 30-60 min med geit blokk løsning.
    6. Fortynn primære antistoffer i geit blokk-løsning og inkuberes over natten ved 4 ° C. (Dersom det er ønskelig, fluorescerende phalloidin (1:400) og Hoechst fargestoff (1:10.000) kan også legges til den primære antistoff løsning å visualisere trådformede aktin og kjerner).
    7. Skyll Dekk med PBS 3x (5 min / vask).
    8. Fortynn sekundære antistoff i geita blokk-løsning og inkuberes i 2 timer ved romtemperatur.
    9. Skyll coverslips med PBS 3x (5 min / vask)
    10. Mount Dekk med fluorescerende montering medium og la tørke over natten i romtemperatur.
  3. Migrasjon Analysis
    1. Ta bilder av anleggs RMS neuroblast tilslag med et fluorescerende mikroskop ved hjelp av en 10X objektiv. Inkluder en skala bar i et eksempelbilde.
    2. Slik setter du opp skalaen for kvantifisering, måle skala bar i bildet ved å velge "Rett linje" verktøy på ImageJ verktøylinjen.
    3. Velg "Analyser" og klikk på 'sett skalaen'.
    4. I skalaen vinduet sette 'kjent distanse "og kryss av' global 'boksen for å holde de samme innstillingene for alle målinger.
    5. Bruk 'Segmentert linjen "verktøy på ImageJ verktøylinjen for å måle avstanden fra kanten av summen til lengst flyttet neuroblast i seks forskjellige sektorer rundt hele tilslag (Figur 3B). Tenk bare isolert aggregates for analyse.
    6. Beregne en gjennomsnitts migrering avstand fra de seks verdiene oppnådd for hver aggregat.
    7. Mål 10-20 aggregater for hver tilstand i hvert uavhengige eksperiment og basseng resultater fra minimum tre uavhengige eksperimenter. Inkluderer alltid en nucleofection kontroll (f.eks. GFP eller en kontroll sh / siRNA).

Representative Results

Neuroblasts kan med hell isolert fra preparat RMS vev (figur 1A), og innleiret i en tre-dimensjonal matrise. Celler isolert fra enten rotte eller mus barsel RMS er immunopositive for trekkende neuroblast markører, for eksempel doublecortin (DCX), SIII tubulin eller PSA-NCAM (Tall 1B-C).

Dissosierte neuroblasts kan effektivt nucleofected med DNA (f.eks. En GFP-kodende plasmid, figur 2) eller shRNA plasmider (figur 4) for å oppnå proteinmangel, som kan vurderes ved western blot analyse (figur 4B) eller immunfluorescens (ikke vist) .

Celler nucleofected med GFP-koding plasmider migrere radialt ut reaggregated neuroblast klynger (figur 3A). Kvantifisering av relativ migrert avstand 24 timers innlegg embedding (Figur 3B) viser ingen forskjell i migrasjon mellom GFP-posit ive celler og GFP-negative, nonnucleofected celler (Figur 3C), noe som indikerer at nucleofection per se ikke forstyrrer migrasjon. Det er heller ingen signifikant forskjell i omfanget av migrasjon mellom nucleofected neuroblasts og neuroblasts direkte migrerer ut av RMS eksplantater (data ikke vist).

Figur 1
Figur 1. Disseksjon av RMS neuroblasts. (A) Skjematisk fremstilling av RMS neuroblast disseksjon. For detaljert beskrivelse henvises til teksten. (B) Isolerte rotte RMS celler er immunopositive for de trekkende neuroblast stakere DCX og βlll tubulin. Bar, 20 mikrometer. (C) Celler migrerer ut av muse RMS eksplantater uttrykke den vandrende neuroblast markører DCX og PSA-NCAM. Bar, 20 mikrometer.0989/50989fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.

Fig. 2
Figur 2. Mus neuroblast nucleofection. Spaltet mus RMS neuroblasts ble nucleofected med pMAX-GFP, reaggregated, innebygd i en tredimensjonal matrise og lov til å migrere for 6 hr. Neuroblasts migrerer ut av en reaggregated celle klynge (topp, bilder fase kontrast) viser høy transfeksjon effektivitet (bunn, GFP kanal bilder). Den høyre kolonnen panelene viser høyere forstørrelse bilder som korresponderer med innfellinger markerte i venstre kolonne paneler. Barer, 20 mikrometer. Klikk her for å se større bilde .

Figur 3 ontent-width = "6in" src = "/ files/ftp_upload/50989/50989fig3.jpg" width = "500px" />
Figur 3. 3D Migration analysen. (A) Rat neuroblasts ble nucleofected med pMAX-GFP (GFP) eller pCAG-IRES-EGFP 22 (EV), reaggregated, forankret i matrise og venstre for å migrere for 24 hr. Celler ble deretter fast og immunostained for GFP (grønt) og SIII tubulin (rød). Bar, 50 mikrometer. (B) Måle migrasjon avstand ved hjelp ImageJ. Den reaggregated celle klyngen er delt inn i 6 like store sektorer. Avstanden mellom kanten av klyngen (prikket linje) og den lengst migrerte celle måles for hver sektor. (C) Kvantifisering av den relative avstanden vandret av nucleofected celler (GFP-positive) og kontroll, nonnucleofected celler (GFP-negative) . Klikk her for å se større bilde .

</ Html"Figur 4" fo: content-width = "6in" src = "/ files/ftp_upload/50989/50989fig4.jpg" width = "500px" />
Figur 4. Overvåking neuroblast migrasjon etter shRNA nucleofection. (A) Rat neuroblasts ble nucleofected med en kontroll shRNA vektor (PCA-b-EGFPm5 Silencer 3, som også uttrykker EGFP 23) eller den samme vektor som inneholder en shRNA målretting fascin, en aktin-bundling protein 24. Celler ble reaggregated enn 48 timer, innebygd i matrise og venstre for å migrere for 24 hr. Aggregater ble deretter fast og immunostained for GFP (grønt) og SIII tubulin (rød). Bar, 50 mikrometer. (B) Effektiv fascin uttømming kan oppdages 50 timer etter shRNA nucleofection av western blot analyse. Aktin er her vist som en lastkontroll (c) Kvantitativ analyse av relative migrering avstand som viser at fascin uttømming grad forringer neuroblast migrasjon. (Gjennomsnitt ± SEM; ** p <0,01, n = 3 uavhengige eksperimenter).

Discussion

Migrasjon av neuroblasts langs RMS til den endelige plasseringen i OB er et fundamentalt skritt i postnatal neurogenesis. Men de molekylære mekanismer som styrer denne komplekse prosessen er langt fra å bli fullt ut forstått.

Den eksperimentelle fremgangsmåte som er beskrevet her gjør det mulig å studere neuroblast migrering in vitro. Vi har tilpasset en tidligere utgitt protokoll for å isolere RMS neuroblasts fra tidlig postnatal mus eller rotte 25. For å oppnå optimale resultater er det viktig å mestre disseksjon trinnet, siden det er viktig å holde tidsintervallet mellom disseksjon og nucleofection til et minimum. Etter nucleofection, kan neuroblasts bli reaggregated, forankret i en tredimensjonal matrise og venstre for å migrere over en 24 timers periode. Alternativt, for andre enn migrasjon (f.eks immunfluorescens eller western blot analyse) formål, celler kan umiddelbart belagt etter nucleofection på polyornithine/laminin-belagt dekkglass, der de overlever opptil 4-5 dager. Mus og rotter neuroblasts migrere i Matrigel i en lignende grad, men museceller ser ut til å ha en sterkere tendens til å migrere i kjeder enn rotteceller.

Avhengig av formålet med studien, kan neuroblasts bli nucleofected med ulike plasmider som koder fluorescerende proteiner eller villtype / mutant proteiner av interesse. For optimal protein ekspresjonsplasmider med CAG promoter (β-aktin promoter med CMV Enhancer og β-globin poly-A hale) 26 er sterkt anbefalt. Videre kan siRNA oligos eller shRNA plasmider bli nucleofected til knockdown mål av interesse. Effektiv protein uttømming kan visualiseres ved immunofluorescens eller ved western blot (vanligvis lysering innvevde tilslag fra en rotteunge med 50 pl standard lysis buffer).

Nucleofection er en relativt enkel metode for å transfektere primære neuroblasts, tilbyr en enklere og raskere alternativ til VIral vektor-formidlet transfeksjon, og kan oppnå høy (~ 70-80%) transfeksjon effektivitet. Det er viktig å arbeide raskt under nucleofection prosedyren, siden forlate neuroblasts i nucleofection løsning i et lengre tidsrom drastisk reduserer cellenes levedyktighet.

Den gjennomsnittlige celle utbytte fra RMS disseksjon er relativt lav for P7 mus (~ 5 x 10 5 celler / hjerne) i forhold til P7 rotter (~ 1 x 10 6 celler / hjerne) og minst 3 x 10 6 celler pr nucleofection kreves for å oppnå transfeksjon med ~ 50% effektivitet. Videre rotte neuroblasts synes å motstå bedre å nucleofection forhold til muse neuroblasts. Derfor kan tidlig postnatal (P6-P7) rotteunger representerer en praktisk neuroblast kilde, også med tanke på at organiseringen av rotter og mus RMS er bemerkelsesverdig simiLar 27 og at graden av rotter og mus neuroblast migrering in vitro er også sammenlignbare. Det er ikke tilrådelig å holde reaggregated klynger av nucleofected neuroblasts i suspensjon i mer enn 48 timer for å unngå unormale effekter på celle morfologi og migrasjon (våre upubliserte observasjoner).

3D-analysen beskrevet her kan brukes til å kvantifisere neuroblast migrasjon på et fast tidspunkt etter innstøping i matrise (f.eks. 24 timer). Aggregater av forskjellige størrelser kan anvendes i analysen, siden det er ingen signifikant korrelasjon mellom størrelsen på aggregatene og migrering avstand (våre upubliserte observasjoner). For å visualisere og videre undersøke dynamikken i neuroblast migrasjon, kan time-lapse bildebehandling brukes. Det anbefales migreringsanalyse til å utføre i løpet av en 24 timers intervall etter innstøping, ettersom hastigheten til neuroblasts ser ut til å bli drastisk redusert ved lengre tidspunkter (våre upubliserte observasjoner). </ P>

Det er noen begrensninger i denne protokollen. Først kan nucleofection så langt brukes for tidlig postnatal gnager neuroblasts, mens infeksjon med virale vektorer er fortsatt den mest effektive transfeksjon metoden for voksne neuroblasts 28. For det andre tillater den in vitro assay migrasjon ikke fullt ut gjenskape kompleks arkitektur av RMS observert in vivo. Faktisk, selv om neuroblasts opprettholde evnen til å migrere på en lignende måte til deres in vivo-motstykker, i det eksperimentelle oppsettet som er beskrevet her de mangler interaksjoner med andre komponenter slik som RMS-astrocytter og blodkar, noe som også bidrar til å regulere deres motilitet 9,29, 30. Dette problemet kan bli løst i fremtiden ved optimalisering av tredimensjonale coculture modellsystemer.

I konklusjonen, kombinerer nucleofection med en 3D migrasjon analysen representerer et verdifullt verktøy for å bedre forstå de molekylære mekanismene bakneuroblast migrasjon. Dette eksperimentelle prosedyren gir en innledende, rask og relativt enkel metode for å vurdere betydningen av kandidat regulatorer av neuroblast migrasjon, som kan bli ytterligere validert av andre tilnærminger som in vivo postnatal elektroporering og time-lapse avbildning av hjernen skive kulturer 28,31,32 .

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av en Wellcome Trust Prosjekt Grant tildelt PD og GL (089236/Z/09/Z). SG ble støttet av en Bioteknologi og Biological Sciences Research Council PhD student. Vi takker Matthieu Vermeren for den type gave shRNA vektor og Jennifer Shieh for verdifulle råd om neuroblast nucleofection.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen Life Technologies 14175129
HEPES Sigma-Aldrich H3375-25G
Penicillin-Streptomycin Invitrogen Life Technologies 15140-122
2.5% Trypsin-EDTA (10x) Gibco 15090-046 store 200 µl aliquots at -20 °C
DNAse I Vial (D2) Worthington LK003170 ≥1,000 units per vial; store 50 µl aliquots at -20 °C
Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) Gibco 11960-044
Fetal Calf Serum (FCS) Hyclone SH3007902
Neurobasal medium Gibco 21103-049
B27 supplement Invitrogen Life Technologies 17504044
L-Glutamine (200 mM) Invitrogen Life Technologies 25030-081
D-(+)-Glucose solution (45%) Sigma-Aldrich G8769
Matrigel Basement Membrane Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-free, 10 ml, LDEV-Free BD Biosciences 356231 prepare 120 µl aliquots at 4 °C, then store at -80 °C
PFA Sigma-Aldrich 441242
Sucrose BDH 102745C
Goat serum Sigma-Aldrich 69023
Triton X-100 VWR International Ltd. 306324N
BSA Fisher Chemical BPE9701-100
Dako fluorescence mounting medium Dako S3023
Rat neuron nucleofection kit Lonza VPG-1003
Mouse neuron nucleofection kit Lonza VPG-1001
Microsurgical knife Angiotech 7516
McIlwain tissue chopper The Mickle Laboratory Engineering Company
Nucleofector II Lonza

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ming, G. L., Song, H. J. Adult Neurogenesis in the Mammalian Brain: Significant Answers and Significant Questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
  2. Alonso, M., et al. Activation of adult-born neurons facilitates learning and and memory. Nat. Neurosci. 15, 897-U127 (2012).
  3. Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction? Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
  4. Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
  5. Jin, K. L., et al. Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13198-13202 (2006).
  6. Kim, Y., Szele, F. G. Activation of subventricular zone stem cells after neuronal injury. Cell Tissue Res. 331, 337-345 (2008).
  7. Massouh, M., Saghatelyan, A. De-routing neuronal precursors in the adult brain to sites of injury: Role of the vasculature. Neuropharmacology. 58, 877-883 (2010).
  8. Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
  9. Lois, C., Alvarez-Buylla, A. Long-Distance Neuronal Migration in the Adult Mammalian Brain. Science. 264, 1145-1148 (1994).
  10. Lois, C., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Chain migration of neuronal precursors. Science. 271, 978-981 (1996).
  11. Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal Neuronal Migration Changes the Fate of Developing Neurons in the Postnatal Olfactory Bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
  12. Battista, D., Rutishauser, U. Removal of Polysialic Acid Triggers Dispersion of Subventricularly Derived Neuroblasts into Surrounding CNS Tissues. J .Neurosci. 30, 3995-4003 (2010).
  13. Conover, J. C., et al. Disruption of Eph/ephrin signaling affects migration and proliferation in the adult subventricular zone. Nat. Neurosci. 3, 1091-1097 (2000).
  14. Mobley, A. K., McCarty, J. H. beta 8 Integrin is Essential for Neuroblast Migration in the Rostral Migratory Stream. Glia. 59, 1579-1587 (2011).
  15. Nguyen-Ba-Charvet, K. T., et al. Multiple roles for slits in the control of cell migration in the rostral migratory stream. J. Neurosci. 24, 1497-1506 (2004).
  16. Garzotto, D., Giacobini, P., Crepaldi, T., Fasolo, A., De Marchis, S. Hepatocyte growth factor regulates migration of olfactory interneuron precursors in the rostral migratory stream through Met-Grb2 coupling. J. Neurosci. 28, 5901-5909 (2008).
  17. Platel, J. C., Stamboulian, S., Nguyen, I., Bordey, A. Neurotransmitter signaling in postnatal neurogenesis: The first leg. Brain Res. Rev. 63, 60-71 (2010).
  18. Dityateva, G., et al. Rapid and efficient electroporation-based gene transfer into primary dissociated neurons. J. Neurosci. Meth. 130, 65-73 (2003).
  19. Shieh, J. C., Schaar, B. T., Srinivasan, K., Brodsky, F. M., McConnell, S. K. Endocytosis Regulates Cell Soma Translocation and the Distribution of Adhesion Proteins in Migrating Neurons. PloS One. 6, (2011).
  20. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons. J. Vis. Exp. e2373 (2011).
  21. Gartner, A., Collin, L., Lalli, G. Nucleofection of primary neurons. Method Enzymol. 406, (06), 374-388 (2006).
  22. Causeret, F., et al. The p21-Activated Kinase Is Required for Neuronal Migration in the Cerebral Cortex. Cereb. Cortex. 19, 861-875 (2009).
  23. Bron, R., Eickholt, B. J., Vermeren, M., Fragale, N., Cohen, J. Functional knockdown of neuropilin-1 in the developing chick nervous system by siRNA hairpins phenocopies genetic ablation in the mouse. Dev. Dynam. 230, 299-308 (2004).
  24. Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).
  25. Ward, M., Rao, Y. Investigations of neuronal migration in the central nervous system. Methods Mol. Biol. 294, 137-156 (2005).
  26. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient Selection for High-Expression Transfectants with a Novel Eukaryotic Vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  27. Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp. Neurol. 487, 407-427 (2005).
  28. Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain. J. Vis. Exp. e4061 (2012).
  29. Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).
  30. Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood Vessels Form a Migratory Scaffold in the Rostral Migratory Stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
  31. Sonego, M., Ya, Z., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain. J. Vis. Exp. in press (2013).
  32. Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A., lique, Neonatal Subventricular Zone Electroporation. J. Vis. Exp. e50197 (2013).
Nucleofection av Rodent neuroblasts å studere neuroblast Migration<em&gt; In vitro</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Falenta, K., Gajendra, S., Sonego, M., Doherty, P., Lalli, G. Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro. J. Vis. Exp. (81), e50989, doi:10.3791/50989 (2013).More

Falenta, K., Gajendra, S., Sonego, M., Doherty, P., Lalli, G. Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro. J. Vis. Exp. (81), e50989, doi:10.3791/50989 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter