Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה חדשה לזיהוי אוכלוסייה של enucleating erythroblasts אורתוכרומטי ידי זרימת הדמיה רבת רפאים cytometry, מתן להדמיה של תהליך אנוקלאציה erythroblast.
Abstract
Erythropoiesis ביונקים מסתיים בתהליך הדרמטי של אנוקלאציה כי תוצאות היווצרות reticulocyte. המנגנון של אנוקלאציה טרם הובהר במלואו. בעיה נפוצה נתקלה כאשר לומדים את הלוקליזציה של חלבונים ומבני מפתח בתוך erythroblasts enucleating ידי מיקרוסקופ היא הקושי לצפות במספר מספק של תאים עוברים אנוקלאציה. פיתחנו פרוטוקול ניתוח חדשני באמצעות הדמיה multiparameter במהירות גבוהה תא בזרימה (Multi-Spectral Imaging cytometry הזרימה), שיטה המשלבת מיקרוסקופיה immunofluorescent עם cytometry זרימה, על מנת לזהות ביעילות מספר משמעותי של אירועי enucleating, המאפשר ל להשיג מדידות וביצוע ניתוחים סטטיסטיים.
אנחנו הראשונים מתארים כאן שתי שיטות מבחנה התרבות בerythropoiesis משמשות כדי לסנכרן erythroblasts העכברי ולהגדיל את ההסתברות ללכידת אנוקלאציה בהזמן דואר של הערכה. לאחר מכן, אנו מתארים בפירוט את ההכתמה של erythroblasts לאחר הקיבוע וpermeabilization כדי ללמוד את הלוקליזציה של חלבונים תאיים או רפסודות שומנים בדם במהלך אנוקלאציה ידי זרימת הדמיה רבת רפאים cytometry. יחד עם גודל ומכתים DNA/Ter119 אשר משמשים כדי לזהות את erythroblasts אורתוכרומטי, אנו מנצלים את הפרמטרים "יחס" של תא בערוץ הבהיר השדה שמסייע בזיהוי של תאים מוארכים ו" centroid דלתא XY Ter119/Draq5 "המאפשר זיהוי של אירועים הסלולר שבמרכז מכתים Ter119 (reticulocyte המתהווה) הוא רחוק אחד מהשני מהמרכז מכתים Draq5 (שיחול גרעין עובר), ובכך מצביע על תא עומד enucleate. קבוצת המשנה של אוכלוסיית erythroblast אורתוכרומטי עם centroid דלתא גבוה ויחס נמוך מועשר בenucleating תאים.
Introduction
בידול מסוף בתוך שושלת erythroid ביונקים מסתיים בתהליך הדרמטי של אנוקלאציה, שדרכו erythroblast אורתוכרומטי מגרש הגרעין שלה, עטוף בממברנה (pyrenocyte) 1, שהניבו reticulocyte 2. המנגנון המדויק של תהליך זה, שהוא גם הגבלת צעד שיעור מוצלח, בקנה מידה גדולה, ייצור כדוריות דם אדומים במבחנה, עדיין לא הובהר במלואו. הלוקליזציה של חלבונים ומבני מפתח בתוך erythroblasts enucleating מסתמכת על השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי ואלקטרוני 3-5. תהליך מייגע זה בדרך כלל תוצאות בזיהוי של מספר מצומצם של אירועי אנוקלאציה ולא תמיד מאפשר ניתוח סטטיסטי משמעותי. הרחבת על שיטה של זיהוי erythroblast תוארה בעבר על ידי McGrath et al. 6, פיתחנו גישה חדשנית של זיהוי ולימוד אירועי אנוקלאציה ידי Multi-Spectral אמאגינג cytometry הזרימה (multiparameter הדמיה במהירות גבוהה תא בזרימה, בשיטה המשלבת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם cytometry זרימה) 7, אשר יכול לספק מספר מספיק של תצפיות כדי להשיג מדידות וביצוע ניתוחים סטטיסטיים.
כאן, אנו מתארים שתי שיטות מבחנה הראשונות בerythropoiesis תרבות משמשות כדי לסנכרן erythroblasts ולהגדיל את ההסתברות ללכידת אנוקלאציה בעת ההערכה. לאחר מכן אנו מתארים בפירוט את ההכתמה של erythroblasts לאחר הקיבוע וpermeabilization כדי ללמוד את הלוקליזציה של חלבונים תאיים או רפסודות שומנים בדם במהלך אנוקלאציה ידי זרימת הדמיה רבת רפאים cytometry.
דגימות מנוהלות על זרימת הדמיה cytometer והתאים שנאספו הם מגודרים כראוי לזהות erythroblasts אורתוכרומטי 6. אז erythroblasts אורתוכרומטי מנותחים המבוסס על היחס שלהם, כפי שהיא נמדדת בהר"י brightfieldגינג, לעומת ערכם לcentroid דלתא פרמטר XY Ter119-DNA, אשר מוגדר כמרחק בין המרכזים של האזורים המוכתמים עבור Ter119 ו-DNA, בהתאמה. האוכלוסייה של תאים עם יחס נמוך וcentroid דלתא הגבוה XY Ter119/DNA היא מועשר בenucleating תאים. באמצעות wild-type (WT) erythroblasts לעומת erythroblasts עם מחיקת MX-Cre בתיווך מותנית של Rac1 על Rac2 - / - או בשילוב Rac2 - / -; Rac3 - / - רקע גנטי ופרוטוקול ניתוח הרומן הזה של זרימת הדמיה רבת רפאים cytometry, אנחנו הוכיחו לאחרונה כי אנוקלאציה דומה cytokinesis סימטרי וכי היווצרות טבעת actomyosin מוסדרת בחלקו על ידי GTPases RAC היא חשובה להתקדמות אנוקלאציה 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. לטווח ארוך במבחנה erythropoiesis התרבות (Ex vivo erythroid בידול תרבות פרוטוקול על ידי Giarratana et al. 8, השתנה והותאם לתאי עכבר)
זה לטווח ארוך 3 שלבים בפרוטוקול erythropoiesis מבחנה. בשלב הראשון (ימים 0-4) 2 x 10 5 תאים / מיליליטר ממוקמים במדיום גידול erythroblast השלים עם גורם תאי גזע (SCF), interleukin-3 (IL-3), ואריתרופויאטין (EPO). בשלב השני (הימים 5-6), תאי resuspended ב2 x 10 5 תאים / מיליליטר ושיתוף תרבותי בתאים חסיד סטרומה (MS5) במדיום גידול erythroblast טרי בתוספת רק ב-EPO. בשלב השלישי (ימים 7-9), תאים בתרבית על שכבה של MS-5 תאים במדיום גידול erythroblast טרי ללא ציטוקינים עד אנוקלאציה (איור 1 א).
כל הפרוטוקולים בבעלי החיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) שלהמרכז הרפואי בית החולים לילדים בסינסינטי.
- קציר של עצמות ובידוד של תאי מח עצם בצפיפות נמוכה
- הוסף 2 מיליליטר IMDM סטרילי המכיל 2% בסרום שור העובר (FBS) בצינור חרוטי 15 מ"ל ולשמור על קרח.
- להרדים עכבר C57/BL6 סוג בר בן 2-6 חודשים (יחד עם או בלי עכבר גנטי ממוקד של עניין) בעקבות פרוטוקול שאושר על מוסד (לדוגמא CO משאיפת 2, ואחריו נקע בצוואר הרחם).
- לבודד את עצמות אגן, עצמות ירך, וtibiae של שני רגליו באמצעות מלקחיים ואזמל, להוסיף אותם לצינור המכיל FBS +2% IMDM ולשמור על קרח.
- הוספת FBS +2% IMDM 1 מיליליטר בשפופרת סטרילית זרימת cytometry ועצמות סומק באמצעות מלקחיים ומזרק טוברקולין עם x 25-G FBS +2% "מחט 5/8. IMDM פלאש דרך העצמות כמה פעמים בעדינות ( על ידי aspirating ~ 500 μl מהשעית התא ושטיפתו שוב דרך העצם), ולאסוף את תאי מח עצם לתוך זרימת cytometrצינור y. פלאשינג יושלם כאשר עצמות מופיעות לבנה.
- סנן תא השעיה באמצעות מערכת מסננת תא 40-מיקרומטר על גבי צינור חרוטי 50 מ"ל. שטוף מסננת תא עם IMDM FBS +2% ושימוש באותו המדיום להתאים נפח סופי של השעיה תא 5 מיליליטר.
- הכן את התאים בצפיפות נמוכה מח עצם (LDBM) על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות: שכבה בזהירות 5 מיליליטר של תאי השעיה על 5 מיליליטר של הפרדת תא שיפוע צפיפות גרם / מיליליטר בצינור 15 מ"ל וספין ב750 XG במשך 1.083 בינוני 25 דקות בטמפרטורת חדר (RT) ללא האצה בלם / נמוך.
- ההעברה supernatant (הכל עד כ סימן 2 מ"ל של צינור 15 מ"ל על מנת לרכוש מעיל באפי) לצינור 15 מיליליטר חדש ולבצע שטיפה יותר אחד עם FBS +2% IMDM ב525 XG במשך 5 דקות ב RT.
- לשאוב supernatant וlyse כל תאים הנותרים דם אדום (RBC) על ידי השעיית גלולה ב 3 מיליליטר חיץ תמוגה RBC למשך 5 דקות ב RT. אם טוהר רב יותר של erythroblasts הואנדרש בשלב האחרון (למשל למחקרים ביוכימיים), לטהר תאי LDBM נוספים בשלב זה לתאי נג לין ידי הפרדה מגנטית.
- Vivo לשעבר פרוטוקול תרבות בידול erythroid החל מLDBM או תאי נג לין (איור 1 א)
- FBS +2% הוסף 7 מיליליטר IMDM, ספין ב525 XG במשך 5 דקות ב RT ו resuspend תאי pelleted ב2 בינוני מיליליטר צמיחת erythroblast (EGM), בהיקף של:
. בינוני StemPro-34, המכיל
ב. 2.6% StemPro-34 תוספת בינונית,
ג. 20% BIT-9500,
ד. 900 סולפט ברזלי מיליליטר / ng,
דואר. 90 חנקה ברזל מיליליטר / ng,
ו. 100 יחידות / פניצילין / סטרפטומיצין מיליליטר, L-גלוטמין 2 מ"מ
גרם. 10 -6 הידרוקורטיזון M
שעות. והוסיף טרי ציטוקינים:
i) 100 ng / ml SCF,
ii) 5 ng / ml IL-3, ו
iii) 3 IU / ml Epo. - ספירת התאים באמצעות מונה תא אוטומטי או באופן ידני במיקרוסקופ באמצעות אמרהocytometer.
- צלחת בצלחת תרבית תאי 6 גם בריכוז של 5 x 10 5 תאים / גם לנפח סופי של 2.5 מיליליטר בEGM (2 x 10 5 תאים / מיליליטר LDBM) ו לדגור על 37 ° C (זה נחשב כמו יום # 0 של תרבות).
- שנה בינונית על ידי aspirating 1.5 מיליליטר של supernatant, מסתובב ב525 XG במשך 5 דקות ב RT, resuspending ב1.5 מיליליטר של מדיום טרי המכיל את כל 3 ציטוקינים והוספה חזרה לבארות בכל יום בימים # 2, 3, 4, כדי לייעל את שלב שגשוג. ביום 3, להסיר את כל התאים, לספור והתפצל למספר מתאים של בארות כדי לקיים ריכוזי תא היטב של ~ 2 x 10 5 תאים / מיליליטר. לשמור על התרבות ב37 ° C / 5% CO 2.
- ביום 4, תאי MS5 הצלחת (קו תאי סטרומה עכברי) לבארות של צלחת 6 היטב תרבית התאים חדשה. מדיום תרבית תאי MS5 הוא α-ממ מכיל FBS 20%, 100 יחידות / פניצילין / סטרפטומיצין מיליליטר, ו -2 L-גלוטמין מ"מ.
- ביום 5, לספור מספרתאים (כיום מועשר באופן משמעותי בerythroblasts) בבאר כל צלחת התרבות המקורית באמצעות מונה תא אוטומטי או באופן ידני במיקרוסקופ באמצעות hemocytometer.
- הרם את כל התאים מכל טוב ולהעביר לצינורות חרוטי 15 מ"ל, ספין למטה ב525 XG במשך 5 דקות ב RT, לשאוב supernatant ו לפזר פתיתים עם EGM טריות המכילה רק EPO (3 IU / ml) לריכוז של 2 x 10 5 תאים / מיליליטר.
- לשאוב supernatant מהבארות שבו MS-5 תאים היו מצופים ביום הקודם (ממוקד לconfluency 70-80% בזמן של התרבות המשותפת) ולהוסיף תאי erythroid בבארות אלה בEGM מכילה רק EPO (אם כי לא המדיום שלהם בחירה, MS-5 תאים לשרוד גם בEGM במשך כמה ימים).
- שנה בינונית הוספת EPO הטרי ביום # 6.
- שנה בינונית ביום # 7, תוך שימוש בEGM ללא ציטוקינים הוסיפו. בימים 7 עד 9, דגימות מבחן לאנוקלאציה עם cytometry זרימה לאחר צביעה עם אנטי Ter119 וSyto-16 יומית ו-proceed למכתים את הדגימות לMulti-Spectral Imaging cytometry הזרימה (כמפורט בסעיף 3).
הערה:. לפני ציפוי וביום 2, 4, 6, ו -7 של תרבות, לפקח על תאים בתרבית להעשרת erythroblast והבחנה עם cytometry זרימה על ידי הערכת סמני משטח CD44 וTer119 לעומת הגודל (FSC) 9 לחלופין CD71, Ter119, וFSC יכול לשמש גם 10, 11.
- FBS +2% הוסף 7 מיליליטר IMDM, ספין ב525 XG במשך 5 דקות ב RT ו resuspend תאי pelleted ב2 בינוני מיליליטר צמיחת erythroblast (EGM), בהיקף של:
2. Enucleation Assay המהיר, על פי הפרוטוקול שתואר על ידי יושידה et al. 12 עם שינויים (איור 1)
- אינדוקציה erythropoiesis מתח וstroma הכנת תא לתרבות erythropoiesis במבחנה
- הרדימי עכבר ישן 2-6 חודש סוג בר C57/BL6 להנחיות IACUC (לדוגמא עם פתרון isoflurane). ודא שהעכבר כבר מורדם כראוי על ידי בדיקה על היעדרות של תגובות רפלקסיביות לקמצוץ האחורי-כפה עדין ועבורנשימתו הסדירה במהלך ההליך. השתמש במשחת עיני וטרינר על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
- לגרום erythropoiesis מתח באמצעות זנב מדמם לנפח סופי של μl 500. שימוש במזרק אינסולין, להזריק נפח שווה של מלח רגיל intraperitoneally כדי להבטיח החייאת נוזלים של החיה (להחזיק בעלי חיים בעמדת Trendelenburg לפני הזרקה ולהזריק בבטן התחתונה, כדי שלא לגרום נזק לאיברים פנימיים).
- אל תשאיר את העכבר ללא השגחה עד שהוא שב לשליטה מוטורית כפי שצוין על ידי בעלי החיים מתחילים לנוע בכלוב ולהיות מסוגל לעמוד וללכת בלי ליפול. עכבר phlebotomized ממוקם בכלוב בלי עכברים אחרים.
- אחרי 2 ימים, צלחת MS-5 תאים בבארות של צלחת תרבית תאי 24 גם. דגירה MS-5 תאים ב37 ° C / 5% CO 2 במדיום סלולרי MS5 (-ממ מכיל FBS 20%, 100 יחידות / פניצילין / סטרפטומיצין מיליליטר, ו 2 מ"מ L-גלוטמין) במטרה להיות 70-80 % I מחוברותבארות צלחת n לאחר 48 שעה.
- קציר של טחול ועיבוד של splenocytes
- ארבעה ימים (96 hr) אחרי גיוס erythropoiesis המתח, להרדים דימם בעבר עכבר באמצעות פרוטוקול שאושר IACUC (למשל משאיפת CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם).
- טחול קציר ולשים אותו בצינור חרוטי 15 מיליליטר המכיל 2% FBS IMDM ולשמור על קרח.
- חזרה במעבדה, במכסת המנוע בתרבית רקמה בתנאים סטריליים, להפוך צינור המכיל טחול במסננת תא 40-מיקרומטר נקבע על גבי צינור 50 מ"ל. קראש טחול באמצעות הבוכנה של מזרק פלסטיק 5 מ"ל.
- שטוף מסננת תא עם FBS +2% IMDM ובאמצעות אותו המדיום, להתאים את הנפח הסופי של השעיה תא 5 מיליליטר.
- שכבה בזהירות את ההשעיה splenocyte 5 מיליליטר ב -5 בהפרדת תא מיליליטר צפיפות שיפוע בינוני 1.083 גר '/ מיליליטר בצינור 15 מ"ל וספין ב750 XG במשך 25 דקות ב RT ללא האצת בלם / נמוך.
- להעבירsupernatant (פתרון למטה על סימן 2 מ"ל של הצינור 15 מ"ל על מנת לרכוש מעיל באפי) לצינור 15 מיליליטר חדש ולבצע שטיפה נוספת עם FBS +2% IMDM ב525 XG במשך 5 דקות ב RT .
- לשאוב supernatant ותאי דם אדומים lyse ידי השעיית גלולה ב 3 מיליליטר חיץ תמוגה RBC למשך 5 דקות ב RT.
- הוסף 7 IMDM מיליליטר FBS +2% לשטוף תאים ולדלל ולנטרל את מאגר תמוגה RBC וספין ב525 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- לשאוב supernatant ו להשעות תאי טבליות ב2 מיליליטר של מדיום גידול erythroblast (EGM).
- תרבות של splenocytes המבודד בצפיפות נמוכה, מועשר בerythroblasts, על פלסטיק (השלב הראשון של תרבות erythropoiesis מהירה במבחנה)
- ספירת תאים על דלפק תא אוטומטי או באופן ידני על ידי hemocytometer. מספר רגיל של תאים מבודדים לטחול בשלב זה הוא ~ 15 x 10 6.
- להשעות את התאים נוספים בEGM המכילים ציטוקינים (בfריכוזי inal): SCF 50 מיליליטר ng /, IL-3 5 ng / ml, וEpo 2 U / ml.
- פלייט 1-5 x 10 6 תאים בנפח סופי של 1 מיליליטר / היטב (אותו מספר של תאים לכל גם בהתאם למספר כולל של תאים) של צלחת תרבית תאי 24 היטב דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס / CO 2 של 5%.
- תרבות של erythroblasts על תאי MS5 (שלב שני של תרבות erythropoiesis מהירה במבחנה
- לשאוב supernatant מהפלסטיק היטב ולהרים את התאים (מועשרים בerythroblasts) על ידי הוספת 2 מיליליטר של קר 10 mM EDTA ב PBS במשך 5 דקות, על קרח היטב כל אחד.
- שים תאים בצינורות טריים, לשטוף פעם בEGM (ללא ציטוקינים) ו resuspend באותו הדבר.
- צלחת 5 x x 10 5 -1 10 6 תאים בנפח 1-2 מיליליטר לכל MS5 גם צלחת 24 גם מצופה תא. אם מעכבים תרופתיים נמצאים בשימוש בניסוי, להוסיף אותם בריכוזים מתאימים עכשיו.
- דגירה במשך 6 עד 8 שעות (זמן מונחה על ידיתצפית מיקרוסקופית של כ 30% אנוקלאציה -40% במדגם WT שלא טופל). המחייבים של erythroblasts ל-MS-5 תאים מאיץ אנוקלאציה.
- הרם תאים מכל גם על ידי הוספת 2 מיליליטר של PBS הקר + 10 mM EDTA, למשך 5 דקות, על קרח. יחד עם erythroblasts, MS-5 תאים יהיו גם נאספו, אך מאוחר יותר ניתן לשלול אלה בקלות במהלך ניתוח תזרים cytometric כTer119 היי FSC - תאים.
- בשלב זה, ניתן לתקן תאים ומוכתמים לניתוח על ידי Multi-Spectral Imaging cytometry הזרימה.
3. הכתמה של Erythroblasts ללוקליזציה של חלבונים תאיים או רפסודות שומנים בדם במהלך Enucleation ידי Multi-רפאים הדמיה תזרים cytometry
- שטפו תאי PBS, ספין 525 XG במשך 5 דקות ב RT ולשאוב supernatant.
- תקן את התאים על ידי resuspending כדורי תא ב500 μl של פורמלדהיד .3.7% ב-PBS במשך 15 דקות (זמן קיבוע עשוי להשתנות תלוי באנטידור שחקר) וpipetting בעדינות.
- העברה לצינורות צנטריפוגה פלסטיק 1.5 מ"ל ו דגירה של 15 דקות ב RT.
- ספין על XG microcentrifuge ספסל 2,000 ל20 שניות, לשאוב supernatant ולבצע שטיפה אחת על ידי הוספת 500 μl PBS על צינור אחד וpipetting בעדינות.
- ספין על XG 2,000 microcentrifuge ספסל עבור 20 שניות, לשאוב supernatant ולשמור על צינורות על קרח לפחות 15 דקות. Permeablization צעדים 3.6-3.9 צריכים להיעשות במהירות וביעילות, ובעקבות ספינינג / שאיפה ב RT, צריכים מייד לשים כדורי תא אחורי על קרח, על מנת שתאים כדי לשמור על היושרה שלהם טובים יותר.
- קח את פתרונות אצטון מ מקפיא -20 מעלות צלזיוס ולשים על קרח. Permeabilize תאים על ידי resuspending כדורי תא הראשון ב500 אצטון μl קר כקרח 50% (1:1 עם DH 2 O) וpipetting בעדינות.
- ספין על ספסל microcentrifuge 2,000 XG לכדורי 20 שניות, לשאוב supernatant ותא גלול ב500 μl60; אצטון 100% קרים כקרח על ידי pipetting בעדינות.
- ספין על ספסל microcentrifuge 2,000 XG לכדורי 20 שניות, לשאוב supernatant ותא גלול פעם נוסף ב500 אצטון 50% קרים כקרח μl ידי pipetting בעדינות.
- ספין על ספסל microcentrifuge 2,000 XG במשך 20 שניות, לשאוב supernatant ולשטוף את תאי פעם אחת בחיץ FACS הקר (BSA + 0.5% PBS) על ידי pipetting בעדינות.
- הכן קוקטייל תיוג עם נוגדנים או סמנים למולקולות של עניין: 0.1 U/100 μl AF488-phalloidin לצביעת F-אקטין ו1 μl/100 μl Ter119-PECy7 למכתים תא erythroid. מכתים אלטרנטיבי או נוסף יכול להיעשות גם באמצעות AF-488-אנטי β-טובולין נוגדן (1:50), למקטע רעלן הכולרה B AF-594 מצומדות לתייג רפסודות שומנים בדם (1:200), אנטי pMRLC (Ser19) נוגדן ראשוני לשרשרת שרירן פוספורילציה אור הרגולציה (1:50), ואחריו נוגדנים נגד ארנב AF-488 מצומדות משניים (1:400), ואנטי γ-tubuנוגדן לין ארנב העיקרי (1:100) ואחריו נוגדנים נגד ארנב AF-555 מצומדות המשניים (1:300).
- בעקבות שאיפת supernatant, resuspend כדורי תא בקוקטייל הסמן, פיפטה 100 μl עדינות דגירה במשך 30 דקות ב RT.
- הכן את חיץ FACS מכיל 2.5 מיקרומטר של Draq5 הכתם הגרעיני.
- שטוף תאים בחיץ FACS, ספין למטה על microcentrifuge ספסל 2,000 XG במשך 20 שניות, לשאוב supernatant ו resuspend ב 60 חיץ FACS μl מכיל Draq5.
- דגימות לרוץ על ההדמיה לזרום cytometer לאסוף לפחות 10,000 אירועים לכל ניסוי, לפצות את קבצי הנתונים הגולמיים כ13 שפורסמו בעבר, ולנתח את התוצאות כפי שמוצגות באיור 2, תוך שימוש בתוכנה לניתוח ספציפי להדמית cytometer זרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ראשית, תאים מנותחים על בסיס יחס הממדים Brightfield (היחס בין אורכם הקטינים לעומת הציר המרכזי שלהם) ופינת Brightfield (מעיד על הגודל שלהם). אירועים עם ערך פינת Brightfield נמוך מ20 וגבוהים יותר מאשר 200 הם בעיקר אגרגטים פסולת ותאים, בהתאמה, והם נכללים בניתוח (איור 2 א). תאים בודדים (שער "R1") הם לאחר מכן נותח על בסיס ערכם לפרמטר צבע RMS, דבר שמצביע על חדות של תמונה. השער "R2" נוצר תאים המכילים ערך עם Gradient RMS יותר מ אחוזון ה 50 כדי לבחור את התמונות שצולמו גם בפוקוס (איור 2). לאחר מכן תאים מגודרות המבוסס על הגודל שלהם כפי שנמדדו לפי אזור Brightfield, והחיוביות שלהם לTer119 סמן erythroid כפי שהיא נמדדת על ידי פרמטר כתם-Mean פיקסל Ter119 הניאון (שער "Ter119 חיובי", איור 2 ג). תאים נמוכים מאוד או גבוהים מאוד על Ter119, הם או שאינם erythroids או אגרגטים תא שנותרו, בהתאמה, והם נכללים בניתוח. בשלב הבא, תאים שנבחרו מבוסס על עוצמת יחס הממדים Draq5 (היחס של הקטין לעומת עוצמת הציר המרכזית של הגרעין שלהם) ואת העוצמה של Draq5 (איור 2 ד). Draq5 תאים שליליים (תאים בעיקר enucleated, כגון reticulocytes וRBCs), ותאים עם יחס ממדים Draq5 נמוכים (בעיקר כפילויות) אינם נכללים בניתוח. Draq5 תאים חיוביים ("ה-DNA חיובי" שער, בעיקר erythroblasts בשלב זה) ולאחר מכן ניתחו מבוסס על פינת Ter119, אשר מציינת את גודלו של התא, וTer119 הממוצע Pixel / האזור שלהם (צפיפות ביטוי Ter119), אשר מציין את בהירות של מכתים Ter119. erythroblasts אורתוכרומטי (שער "OrthoE") מוכר כתאים קטנים, Ter119 היי (2E איור). לבסוף, subpopulation של orthochroMatic erythroblasts מועשר בenucleating תאים מאופיין ביחס נמוך Brightfield היבט, אשר הוא מדידה של התארכות תא, המחושבת על ידי היחס בין ציר ציר קטין / עיקרי של תמונת התא בערוץ Brightfield M01, ועל ידי גבוה דלתא centroid XY Ter119 / Draq5, אשר מוגדר על ידי המרחק בין המרכז של Ter119 +-reticulocyte התחלי ומרכז Draq5 + הגרעין ("תאי enucleating" שער באיור 2F).
יחד עם נוגדנים נגד Ter119 וDraq5 DNA-הכתם, התאים יש גם מוכתמים עבור אקטין פילמנטיות (F-אקטין) עם phalloidin ניאון כדי להעריך את הלוקליזציה של ה-F-אקטין במהלך אנוקלאציה erythroblast 7. ראוי לציין, התקדמות של אנוקלאציה ניתן דמיינו בתאים הקבועים, כמו תאים עם יחס הפחתה (כלומר מוארך יותר ויותר) וcentroid דלתא הגדלת XY Ter119/Draq5 הם נצפו (איוריור 3). ה-F-אקטין הוא ציין להתרכז בתלם המחשוף במהלך אנוקלאציה ואחר כך מתפוגג ברגע שהגרעין נמתח. יתר על כן, שיתוף לוקליזציה של אקטין ומיוזין בתלם המחשוף בין reticulocyte והגרעין התחלי ניתן להדגים על ידי זרימת הדמיה רבת רפאים cytometry לאחר שיתוף הצביעה erythroblasts WT לpMRLC (שרשרת אור הרגולציה שרירן פוספורילציה) ו-F-אקטין 7.
חלבונים ומבנים בעלי עניין אחרים יכולים גם להיות מוכתמים עם נוגדנים מתאימים או סמני ניאון כדי לאפשר מחקרי הדמיה של תפקידם במהלך אנוקלאציה. היווצרות microtubule מקוטבת גלויה בerythroblasts אורתוכרומטי WT לפני אנוקלאציה אך לא בerythroblasts טופל (איור 4 א) קולכיצין. עיכוב של פילמור טובולין ידי קולכיצין מפחית קיטוב תא, כפי שהוכח על ידי מדידת centroid דלתא פרמטר XY BF/Draq5 בין CENter של גוף התא ראה בערוץ Brightfield והמרכז מכתים הגרעיני שהושג עם Draq5 (איור 4).
ניצול WT או RAC-לקוי (לאחר מניפולציה גנטית או תרופתי) erythroblasts בזרימת הדמיה רבת רפאים cytometry בדיקות הדמיה אפשרו הממחישות את תפקידו של GTPases Rac באנוקלאציה. GTPases RAC להסדיר לפחות בחלק היווצרות טבעת actomyosin כמו גם נקודת המפגש של רפסודות שומנים בדם בתלם בין reticulocyte וpyrenocyte 7 המבצבצות.
איור 1. הפגנה סכמטי של erythropoiesis בפרוטוקולי מבחנה המשמשים על מנת לייצר erythroblasts enucleating ללימודים. א לטווח ארוך בתרבות erythropoiesis מבחנה initiatאד מLDBM או לין -.. תאי assay אנוקלאציה מהירה ב 'ביוזמת splenocytes מועשר בerythroblasts אחרי גיוס erythropoiesis מתח in vivo על ידי phlebotomy אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. ניתוח של נתונים תוך שימוש בתוכנה לניתוח ספציפי לזרימת ההדמיה cytometer. Gating רצופים של האוכלוסיות של העניין מוצג בAF פנלים. המספר בסוגריים מציין את אחוז המשוער של אוכלוסיית ההורה המתאימה, בניסוי הזה. Gating הראשוני א 'של אוכלוסיית R1 מסיר אגרגטים תאופסולת תאית. B. שער R2 מתוך R1 כולל את התאים שכבר צילמו בצורה ברורה, לא כולל את תאי פוקוס. תאי ג Ter119 חיוביים (מתוך R2) נבחרו, למעט תאים שהם או שליליים לTer119 או גם באינטנסיביות מוכתמת בגלל נוכחותם במצרפים. תאי ד DNA חיוביים (מתוך תאי Ter119 החיוביים) נבחרו, לאחר קשירת קשר לעצמת יחס ממדים לעומת עוצמת הכתם הגרעיני (כאן Draq5 לקרוא בערוץ 5). א תאי ה-DNA וTer119 החיובי הם מגודרים לתוך basophilic, polychromatophilic וerythroblasts אורתוכרומטי המבוססים על המיקום שלהם בTer119 הממוצע פיקסל לעומת איזור Ter119 (כאן קורא בערוץ 3), כפי שהראו בעבר על ידי מק 'גראת ואח' 5. פ תאי enucleating הם תאים אלה מתוך erythroblasts אורתוכרומטי, שבו יש יחס ממדים נמוך (מדידה של elongat התאיון בbrightfield ערוץ (BF)) וגבוה דלתא centroid XY Ter119/Draq5 (מרחק בין המרכז של יצירת Ter119 +-reticulocyte ומרכז של גרעין). מחקר זה פורסם במקור בדם: Konstantinidis DG, Pushkaran S, et al איתות ודרישות cytoskeletal באנוקלאציה erythroblast דם... 2012;. 119 (25) :6118-6127 על ידי האגודה האמריקנית להמטולוגיה אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. נציג תמונות של enucleating erythroblasts עם הדרגת הגדלת erythroblasts דלתא centroid XY Ter119/Draq5. WT עכבר אורתוכרומטי, מוכתם בTer119-PECy7, phalloidin-AF488, ו-Draq5, הם מגודרים לcentroid יחס ממדים והדלתא שלהם XY Ter119/Draq5. תאים מוצגים קבועות בשלבים שונים, רצופים של אנוקלאציה, עם התקדמות שמתאימה להפחתת יחס גובה והגדלת centroid דלתא XY Ter119/Draq5 (ירוק צולבת בתוך השער הצהוב מראה את המיקום של התא צילם בצד הימין). בתמונות תא מלמעלה עד למטה, ה-F-אקטין יכול להיות שנצפה במהלך אנוקלאציה להתרכז בתלם המחשוף ואחר כך מתפוגגת ברגע שהגרעין נמתח (כפי שמוצג בתא # 4782 בתמונה התחתונה). אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. כינונה של אסיפת microtubule חד קוטבי וקיטוב של orthochromaerythroblasts טיק מקדים אנוקלאציה. היווצרות microtubule א המקוטבת גלויה בerythroblasts WT שליטה (מוכתם אנטי ב-טובולין-AlexaFluor-488 וDraq5 הגרעיני הכתם), ואילו ב-טובולין מוכתם באריכות בerythroblasts הודגרו עם קולכיצין (5 מיקרומטר) במשך 6 שעות במבחנת assay אנוקלאציה המהיר. cytometry זרימת ההדמיה Multi-ספקטרלי B. יכול להציע הערכה כמותית של קיטוב תא על ידי ניתוח ההתפלגות של פרמטר דלתא centroid XY BF/Draq5, המודד את המרחק בין המרכז של גוף התא כפי שניתן לראות בשדה בהיר והמרכז מכתים הגרעיני שהושג עם Draq5 (ייצוג סכמטי בהבלעה). ערכי הדלתא centroid BF/Draq5 של erythroblasts אורתוכרומטי WT שטופלה בקולכיצין הם סטטיסטיים שונים באופן משמעותי מהשליטה ערכי הדלתא centroid BF/Draq5 (p <0.001). מחקר זה פורסם במקור בBlooד:.. Konstantinidis DG, Pushkaran S, et al איתות ודרישות cytoskeletal באנוקלאציה erythroblast דם. 2012;. 119 (25) :6118-6127 על ידי האגודה האמריקנית להמטולוגיה אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בשנים האחרונות המחקר של אנוקלאציה erythroblast צבר תאוצה גוברת שכן הוא הצעד במבחנת תרבויות erythropoiesis שהוא קשה ביותר להתרבות ביעילות על מנת להשיג ייצור של תאי דם אדומים לשעבר vivo מוצלח, בקנה מידה גדולה. עד לאחרונה, המחקר של אנוקלאציה erythroblast מנוצל מיקרוסקופיה בעיקר הקרינה וזרימת cytometry שיטות. שיטות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אם כי מועיל בזיהוי מולקולות משתתפות, דורשות ימים של התבוננות מיקרוסקופית כדי לזהות מספר קטן של erythroblasts אורתוכרומטי עובר אנוקלאציה בתוך מאות תאים קבועים בנקודה מסוימת בזמן. Cytometry זרימת שיטות, לעומת זאת, הם מאוד מועילים בהערכת שיעור אנוקלאציה בתרבות, כמו גם את ההשפעות של מניפולציה תרופתיות או גנטית של מולקולות מסוימות בתהליך זה, אך אינו מספק כל נתונים על intracellulלוקליזציה ar של מולקולות אלה.
זרימת הדמיה רבת רפאים cytometry משלבת את היתרונות של זרימת cytometry ומיקרוסקופיה immunofluorescence שכן הוא מאפשר רכישה מהירה של שני התזרים cytometric ונתונים מורפולוגיים בכמה אלפי תאים. זהו יתרון משמעותי לעומת תזרים קלאסי cytometry במחקרי erythropoiesis, שכן בשלבים השונים של התמיינות erythroblast (proerythroblasts, basophilic, polychromatophilic, ואורתוכרומטי) הוגדרו באמצעות קריטריונים מורפולוגיים 6. עם זאת, cytometry זרימת הדמיה רב רפאים הוא אופטימלי להדמיה של מבנים תאיים ולא השוואות quantitation יחסי במספרי אוכלוסייה. להשוואות כאלה, זרימת cytometry השגרתי שאינו דורש את צעד permeabilization ההכרחי לimmunofluorescence של מבנים תאיים מתפקד טוב יותר. לדוגמא אחוז היחסי של BasoE: polye: OrthoE באיור 2E
ניתן לעבד את נתוני ההדמיה בשיתוף עם cytometry זרימת נתונים באמצעות התוכנה לניתוח ספציפית לזרימת ההדמיה cytometer, המאפשר את איסוף התאים בעלי מאפיינים מורפולוגיים מסוימים בתוך שערים. יכולים להיות מזוהים כמאה תאים enucleating בתוך אוכלוסייה של 10,000 erythroblasts עם שיטת הניתוח שתוארה לעיל באופן מהיר ויעיל 7, המאפשרים תצפיות משמעותיות יותר והערכה סטטיסטית.
יתר על כן, עיבוד תמונה הוא הקל עם התוכנה לניתוח ספציפית לזרימת ההדמיה cytometer המאפשר ניתוח כמותי של מאפיינים כגון דלתא centroid XY ללמוד למשל את המיקום היחסי של הגרעין לציטופלסמה שיכול לשמש כמדד לקיטוב.
שלבים קריטיים בפרוטוקול ופתרון הבעיות
זה ידוע היטב כי גם pipetting העדין יכול לגרום להפרדת reticulocyte וpyrenocyte 12. זה יש הפוטנציאל להגביל את מספר אירועי אנוקלאציה צילמו בחומרה. כתוצאה מכך, יש להקפיד, במיוחד בעת הרמת erythroblasts חייב תאי MS5 בתרבות.
קיבוע עם פתרון פורמלדהיד יכול לגרום לשינויים באזורים תאיים של סמני פני השטח וכתוצאה מכך ירידה בנוגדן ספציפי מחייב ו / או נוגדן שאינו ספציפי מוגבר מחייב. יתרון של זרימת ההדמיה cytometer הוא שמכתים פני השטח הוא דמיינו ובכך ניתן להעריך את איכותו. מקווקו, במקום מדים, מכתים עבור סמני פני השטח שופעים כמו Ter119 מציין overfixation וצריך לטפל באמצעות שילוב של formalde הנמוךריכוז הייד ומשך זמן קצר יותר של קיבעון.
בעקבות קיבעון, שמירה על תאים על קרח לפחות 15 דקות היא חיונית על מנת למנוע שבירת תא עודפת בתהליך permeabilization בשל הבדלי טמפרטורה. למרות permeabilization אצטון שומר erythroids מאוחר השביר יותר טוב מpermeabilization תיווך חומרי ניקוי, השלב שבו נדרש אצטון 100% יגרום מורגש, אבל לא מזיק, אובדן של תאים. בסוף, לאחר לשטוף עם חיץ FACS קר, תאים מותר בטמפרטורת חדר למשך שלבי הדגירה נוגדן.
זרימת ההדמיה cytometer יש שיעור קבוצה של זרימה (תאים / sec) בהתאם לעדשה בשימוש (שיעור הוא ירד עם העלייה בהגדלה). בעקבות לשטוף סופי לפני המדידה, מומלץ שכדורי תא הם resuspended בנפח קטן (50-60 μl), על מנת להאיץ את העיבוד של המדגם. למספר גדול של דגימות שמחדשמקהלת משך זמן ארוך של ריצה (מעל 30 דק '), דגימות צריכה להיות כל הזמן על קרח.
Assay אנוקלאציה לטווח הארוך מציע את היתרון של ייצור תאי erythroid הרחבות על מנת לייצר מספיק תאים שיכולים להיות שנאספו בשלב אנוקלאציה להערכת יוכימיים כמו immunoblotting ולמשוך וירידות. Assay אנוקלאציה המהיר נותן את היתרון של זמן דורש רק 2 ימים לביצוע, אם כי עכבר צריך להיות phlebotomized 4 ימים לפני הניסוי. אנחנו לא נצפו הבדל משמעותי ביעילות אנוקלאציה בין שתי השיטות. ראוי לציין, cytometry זרימת ההערכה, אשר אינו מחייב את צעד permeabilization ההכרחי לimmunofluorescence של מבנים תאיים, כפי שתואר לפני 7, הוא מתאים ביותר להערכה כמותית של יעילות אנוקלאציה.
מגבלות של הטכניקה
השיטה מתוארת כאן UTIlizes מושרה erythropoiesis מתח in vivo והתרבות במדיום המכיל הידרוקורטיזון במבחנה כדי להגביר אוכלוסיות erythroid ולסנכרן אותם בשלב של אנוקלאציה. שני תנאים אלה סביר לחקות erythroblast-אנוקלאציה תחת לחץ. בנוסף, הידרוקורטיזון מגביר באופן משמעותי תשואת erythroid והישרדות. כדי להשיג תשואה דומה של אירועי אנוקלאציה מתאי מח עצם שנלקחו מעכברי סוג בר עם erythropoiesis מצב יציב ותרבית, ללא הידרוקורטיזון (סנכרון לכן הימנעות), היינו צריכים לתאי תרבות מעכברים מרובים ולהפעיל ולעבד הרבה יותר אירועים דרך Multi -Spectral Imaging cytometry הזרימה. למרות זרימת הדמיה רבת רפאים cytometry מאיצה אוסף של נתונים מורפולוגיים מאוד בהשוואה למיקרוסקופיה immunofluorescence באמצעות עד 60x עדשת הגדלה, השוואה של התצפיות שהושגו על ידי הדמיה לזרום cytometer עם קלאסית, Z-מחסנית,ותמונות מיקרוסקופיה confocal היא בעל ערך כדי לקבל פירוט טוב יותר, שכן העדשה האובייקטיבית במיקרוסקופ בהגדלה יכולה לספק עד 100x ותמונות Z-מחסנית לתת רושם 3 ממדים של המבנים, הדבר שאינו בר השגה על ידי זרימת ההדמיה cytometer באותו תא. המספר הגבוה היחסי של תאים דומים שנאספו בזרימת הדמיה רבת רפאים cytometry ניסוי, באורינטציה אקראית, באופן חלקי מפצה על מגבלה זו ומאפשרת תצפיות מנקודתי מבט שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מודים זרימת מחקר Cytometry Core בבית החולים לקרן המחקר לילדים בסינסינטי וריצ'רד דימרקו, Sherree חבר, וסקוט מרדכי מחברת Amnis (חלק מEMD Milllipore) לקבלת תמיכה טכנית מומחה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות מעניק K08HL088126 וR01HL116352 (TAK) וDK090971 P30 (YZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| αMEM medium | CellGro | 15-012-CV | |
| IMDM medium | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30228.01 | |
| Stempro-34 SFM | GIBCO (Life Tech) | 10640 | |
| Stempro-34 nutrient supplement | GIBCO (Life Tech) | 10641-025 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | 512450 | |
| BIT9500 | Stemcell Technologies | 09500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30028.02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone (Thermo Scientific) | SV30010 | |
| L-glutamine | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30590.01 | |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler-Schein | 029405 | |
| Histopaque 1.083 mg/ml | Sigma | 10831 | |
| BD Pharmlyse (RBC lysis buffer) | BD Biosciences | 555899 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 534064 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP 531-500 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Stem Cell Factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | |
| Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | 213-13 | |
| EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO) | AMGEN | available by pharmacy | |
| CD44-FITC antibody | BD Pharmingen | 553133 | |
| CD71-FITC antibody | BD Pharmingen | 553266 | |
| Ter119-PECy7 antibody | BD Pharmingen | 557853 | |
| Phalloidin-AF488 | Invitrogen (Life Technologies) | A12379 | |
| β-tubulin-AF488 antibody | Cell Signaling | #3623 | |
| anti-rabbit AF488-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A11008 | |
| anti-rabbit AF555-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A21428 | |
| AF594-cholera toxin B subunit | Invitrogen (Life Technologies) | C34777 | |
| pMRLC (Ser19) antibody | Cell Signaling | #3671 | |
| γ-tubulin antibody | Sigma | T-3559 | |
| Syto16 | Invitrogen (Life Technologies) | S7578 | |
| Draq5 | Biostatus | DR50200 | |
| Ferrous sulfate | Sigma | F7002 | |
| Ferric nitrate | Sigma | F3002 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 15-ml tubes | BD Falcon | 352099 | |
| 50-ml tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | BD Falcon | 351147 | |
| Flow tubes | BD Falcon | 352008 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309602 | |
| Insulin syringe | BD | 329461 | |
| Syringe needle 25-G 5/8 | BD | 305122 | |
| Capped flow tubes | BD | 352058 | |
| 40-μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Scalpel (disposable) | Feather | 2975#21 | |
| FACS Canto Flow Cytometer | BD | ||
| ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up. | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Hemavet 950 Cell Counter | Drew Scientific | CDC-9950-002 | |
| NAPCO series 8000WJ Incubator | Thermo scientific | ||
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Mini Mouse Bench centrifuge | Denville | C0801 |
References
- McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of "pyrenocytes" in the mammalian fetus. Blood. 111, 2409-2417 (2008).
- Chasis, J. A., Mohandas, N. Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis. Blood. 112, 470-478 (2008).
- Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. C. Cytoskeletal distribution and function during the maturation and enucleation of mammalian erythroblasts. J Cell Biol. 109, 3005-3013 (1989).
- Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nat Cell Biol. 10, 314-321 (2008).
- Keerthivasan, G., Small, S., Liu, H., Wickrema, A., Crispino, J. D. Vesicle trafficking plays a novel role in erythroblast enucleation. Blood. 116, 3331-3340 (2010).
- McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
- Konstantinidis, D. G., et al. Signaling and cytoskeletal requirements in erythroblast enucleation. Blood. 119, 6118-6127 (2012).
- Giarratana, M. C., et al. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
- Chen, K., Liu, J., Heck, S., Chasis, J. A., An, X., Mohandas, N. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2009).
- Kalfa, T. A., et al. Rac1 and Rac2 GTPases are necessary for early erythropoietic expansion in the bone marrow but not in the spleen. Haematologica. 95, 27-35 (2010).
- Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. J Vis Exp. , (2011).
- Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., Nagata, S. Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells. Nature. 437, 754-758 (2005).
- Ortyn, W. E., et al. Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging. Cytometry A. 69, 852-862 (2006).
