Summary
매우 높은 주파수의 초음파는 작은 동물의 심장 이상을 검사 할 수있는 강력한 라이브 이미징 도구입니다. 그 noninvasiveness는 태아의 생리 학적 상태를 유지 할 수 있습니다. 여기서, 우리는 자궁에서 E18.5에서 태아의 심장 박동수를 측정하는 M-모드 초음파의 사용을 보여줍니다.
Abstract
선천성 심장 질환 (CHD)의 출생에서 사망의 가장 흔한 감염성 원인이다. CHD의 발생 빈도는 4 ~ 50 / 1, 000의 출생 (질병 및 상해 지역 추정, 세계 보건기구, 2004)까지입니다. 종종 삶의 질을 손상 수술은 관상 동맥 질환의 원인을 발견의 중요성을 우리에게 상기시켜, 심장 결함을 해결하는 데 필요한. 돌연변이 마우스 모델과 라이브 영상 기술이 질병의 원인을 연구하는 중요한 도구가되었다. 고급 방법은 태아의 비정상적인 마음의 라이브 영상을 할 수 있지만, 후자의 생리 학적 및 혈역학 적 상태는 종종 인해 수술 및 / 또는 긴 절차에 손상됩니다. 비 침습 초음파 영상은, 그러나, 수술함으로써 그들의 생리 기능을 유지, 배아를 노출하지 않고 사용할 수있다. 여기서, 우리는 자궁에서 E18.5에서 태아의 심장 박동을 평가하기 위해 간단한 M-모드 초음파를 사용합니다. 비정상적인 심장 박동의 검출은 참으로 좋은 인디입니다따라서 심장의 기능 장애의 산 및 심장 마비로 이어질 수 있습니다 발달 결함의 식별의 첫 번째 단계를 구성한다.
Introduction
CHD는 출생 1에서 사망의 가장 흔한 감염성 원인이다. 여러 수술은 종종 삶의 질 1을 손상 남아있을 수 있습니다 주제의 구조적 결함을 해결하기 위해 필요합니다. CHD를 가진 아이들은 자주 개발 2,3에 자궁의 결과에 중요한 나타내는, 그들은 수술을하지 않은 경우에도 신경 장애를 개발한다. 이러한 임신 중 바이러스 나 화학 물질 (알코올)에 노출, 원인 CHD로 모두 유전과 환경 요인. 유전 적 기여를 공부하는 것은 초기 단계에서 아직이지만, 빠르게 성장. 이 참여자를 식별하고 간단하고 강력한 도구와 돌연변이 생쥐를 표현형, 심장 개발에 자신의 역할을 이해하는 것은 매우 도움이 될 것입니다.
마우스는 실제로 CHD을 연구하는 선택의 동물 모델이며, 인간의 대부분의 경우는 마우스 4,5에서 재현 할 수 있습니다. 결과적으로, 태아의 심장 마우스 표현형은 INC되고있다reasingly 중요한 인간의 관상 동맥 질환의 원인을 조사하고 적절한 도구가 필요합니다. 고정 표본에 대한 조직 학적 연구는 매우 중요한 있지만, 살아있는 동물의 실시간 영상은 심장의 생리를 이해하는 것이 중요합니다. 비디오 현미경 라이브 영상을 제공합니다. 그러나, 따라서 자신의 생리 학적 및 혈역학 적 상태를 손상, 배아를 노출하는 개복 수술이 필요합니다. 최근 심 초음파 검사는 병원에서뿐만 아니라 생쥐의 심장 평가를위한 표준 영상 기술이되고있다.
마우스 태아 심장 초음파 검사는 표준 임상 초음파 시스템뿐 아니라 초고 주파수 초음파 시스템을 이용하여 수행된다. 후자는 30 MHz 또는 이차원 화상을 생성하고, 초기 배아 단계의 평가를 허용 고주파 트랜스 듀서를 제공한다. 이 트랜스 듀서는, 그러나, 적절한 영상 평면을 획득하고 근본적인 심장 PA를 결정하기에 충분하다 상대적으로 가난한 침투 깊이 (~ 13mm)을 가지고심장 박동, 심장 확장 및 수축기 및 격벽 및 벽 두께에 좌우 심실 내경, 개복술을 수행하지 않고 같은 rameters.
우리의 연구는 배아 일 E18.5에서 마우스 태아의 심장 박동수를 평가하기 위해 매우 높은 주파수의 초음파 시스템을 사용했습니다. 우리는 12.7 mm의 초점 거리를 가진 태아의 크기, 주어진 이상적인 20mm × 20 mm의 필드보기를 제공하는 30 MHz의 변환기를 선택했다. 그러나, 높은 주파수 변환기는 초기 발달 단계를 분석하기 위해 선택 될 수있다. 선택한 M-모드는 1000 프레임 / 초 높은 시간 해상도에 모션 덕분에 조직의 시각화를 할 수 있습니다. 전체 절차는 간단하고 태아의 생리 학적 및 혈역학 적 상태의 교란을 방지하기 위해 가능한 한 빨리 수행되어야한다. 약 8 배아의 분석은 약 1 시간이 필요합니다.
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Protocol
이 프로토콜에 표시된 모든 절차는 IRCM 동물 보호위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 초음파 시스템 및 역 준비
- 초음파 영상 시스템을 시작하고, 제조업체의 지시 (그림 1)에 따라 scanhead뿐만 아니라 생리 컨트롤러 장치를 연결합니다. 심장 측정 프로그램 및 30 MHz의 변환기에 해당하는 scanhead을 선택합니다.
- 탈 이온수로 scanhead의 노즈 피스를 입력합니다. 그들은 영상 해상도 방해로 공기 방울을 피하십시오. 이미징 플랫폼 근처의 홀더의 손잡이 사이드 (그림 1A)와 scanhead를 놓습니다.
- 영상 플랫폼과 작업 영역을 소독.
- 거품의 형성을 방지하고 37 ° C (그림 1B)에 해당 prewarming 용기 세트에 거꾸로 배치 완전히 초음파 젤의 병을 채우십시오.
- 옥시의 검증 레벨세대와 이소 플루 란 마취의 튜브 시스템. ~ 8 배아와 함께 한 실험은 약 15 ~ 20 L의 산소를 사용합니다.
- 안과 크림, 제모 크림과 영상 플랫폼 (그림 1B) 부근의 전극 젤의 병을 놓습니다.
- 그 적외선 열 램프의 기능을 확인합니다. 트레이닝 동안, 열 레벨, 램프의 위치와 상수 체온과 심박을 유지하기 위하여 생쥐 램프의 거리를 설정한다.
참고 : 시스템 및 재료의 적절한 준비가 중요합니다. 긴 절차는 한 마취는 심장 박동, 혈압 및 혈액 산소 수준을 낮추는 방법으로 심장 기능을 우울하게 태아의 생리 학적 및 혈역학 적 특성에 영향을 미칠 수 있습니다. (C57BL / 6 평균 산자 수) ~ 8 태아에 대한 처리 시간은 약 1 시간이어야한다. 다른 마우스 변종 가능성이 큰 여성의 크기로, 태아의 높은 숫자를 제공 할 수 있습니다. 교육은 플라스틱 가공을 최적화하는 것이 필수적입니다NG 시간.
2. 마우스 준비
- 이 응답하지 않는 될 때까지 산소의 2 % 이소 플루 란 (isoflurane)의 연속 공급 장치 (200 ㎖ / 분)와 챔버에서 임신 여성을 마취.
- 산소 1.5 % 이소 플루 란 (200 ㎖ / 분)의 연속 흡입을위한 튜브를 조정하고, 테이프 (그림 2A)로 흡입 튜브를 고정, 앙와위에서 이미징 플랫폼에 마우스를 놓습니다. 충분한 마취 마우스의 편안한 자세와 꼬리와 발가락 핀치에 대한 응답의 부재로 절차를 수행하는 동안 확인해야한다.
- 만 심전도 용 (오른쪽 다리도 리드 II 위치라는 왼쪽 뒷다리, 앞) 왼쪽 상단과 오른쪽 하단 전극 패드에두고 전극 젤. 리드 II 위치는 심장 박동을 결정하는 복잡한 더 나은 정의 똑바로 긍정적 인 P 파 및 QRS을 제공합니다. 테이프 (그림 2A)를 사용하여 각 패드에 네 발을 고정합니다. 눈의 건조를 방지하기 위해, 1 방울의 적용각각의 눈에 안과 연고.
- 머리 깎기와 방광에 가슴에서 복부를 면도. 그런 다음 2 분 동안 제모 크림을 적용하고 신중하게 남아있는 머리카락을 제거하기 위해 거즈 및 / 또는 면봉으로 닦아냅니다. 젖꼭지를 잘라하지 않도록주의하십시오.
- 몸의 온도를 모니터링하기 위해 여성의 직장에 전극 젤 prelubricated 온도계를 삽입 (플랫폼 위에 배치 적외선 가열 램프를 조정하여 37 ± 0.5 ° C로 유지해야한다). 심박수는 450 ± 50 비트 / 분 (BPM)해야한다. 온도와 심박수 모두는 생리 컨트롤러 장치 (그림 1B)에 표시됩니다.
참고 : 긴 마취, 탈모 및 초음파 젤 (데워진하지만) 여성의 심장 박동에 영향을 미칠 수있는 저체온증으로 이어질 수 있습니다. 체온이 36.5 ° C 이하로 떨어질 경우, 절차를 중단하고 온도 및 심박수를 조정하는 가열 램프의 위치를 수정한다. BEF 몇 분을 기다립니다다시 진행 광석.
3. 배아 확인
- 부드럽게 배아를 찾을 수 벌거 벗은 복부를 아래로 누릅니다. 천천히 가볍게 복부 표면에서 단일 층에서 배아의 대부분을 가지고 그들을 밖으로 확산. 각 자궁 혼, 주머니가 선형 적으로 서로 연결되어있다. 확산 할 때이 순서를 존중하려고합니다.
- 마크 자신의 전방 / 후방 및 지느러미 / 복부 방향과 영구 마커와 여성의 벌거 벗은 복부의 각 배아. 방향을 아는 것은 프로브와 심장의 위치를 용이하게합니다. (; 그림 2B 각각 1, 2, 3, ..., 1 ', 2', 3 '...) 자궁 경부에서 시작 번호 오른쪽에있는 배아 왼쪽 뿔.
참고 : (I) 과도한 힘을 가진 배아를 확산하지 마십시오. (그림 2C)을 추적하기 위해 종이에 자신의 위치를 스케치합니다. (II) C57BL / 6 여성은 리터당 8 ~ 태아있다. 그러나 각 쓰레기에 0-2 배아는 L입니다자신의 이미지가 불가능하고, 다른 사람 아래에 ocated. 분석에서 이러한 배아를 제외하고 필요한 경우 더 많은 새끼를 평가합니다.
4. 심박수 측정
- 벌거 벗은 복부에 데워진 초음파 젤을 소량 넣고 골고루 퍼졌다. 거품 형성을 피할 것. 이미지에 특정 지역에서 겔 다량 (~ 5 ㎖)를 첨가.
- 두꺼운 겔 층 (10mm)과 접촉 프로브를 잡고 심장 박동을 찾고있는 동안 서서히 피부쪽으로 프로브를 이동합니다. 심장 박동이 화면에 가시화되면, 촬상면 (도 2D)에 자신의 최대 크기 모두 심실을 갖도록 프로브의 각도를 조정한다.
- 영상을 획득 시작합니다. 팔뚝 역에 쉬고,보기 화면 (그림 2D)에서 라이브 영상을 얻기 위해 초음파 젤에 변환기를 배치합니다. 상단의 트랜스 듀서의 능선을 유지하고 scanhead의 취향을 클릭(이미지의 왼쪽 상단 모서리에있는) 해당 마커가 화면에 시각화 손 운동과 지역의 조정을 할 수 있습니다.
- 자궁 경부에서 시작 화면의 심장 박동을 시각화 (각각 오른쪽 또는 왼쪽 자궁 경적의 1 또는 1 ')으로 표시된 가장 가까운 배아로 이동합니다. 초점 심도가 고정되어 있기 때문에, 부드럽게 원하는 이미지 평면을 얻기 위해 젤과의 접촉을 잃지 않고 / 아래 및 옆으로 프로브를 이동합니다.
- 더 나은 데이터 수집을위한 초점 영역을 나타내는 황색 점선으로 표시된 영역 내 화면의 중심에 심장 박동을 위치.
- 라이브 녹음을 획득. 스카우트의 이미지를 획득하고 (그림 3A)를 기록 다시 시작합니다. 안정적인 기록 10 초 최소 취득하면, 녹음을 중지하고 저장합니다.
- 다음 배아를 진행합니다.
- 모든 배아는 기록의 목록을 보려면 키보드의 키를 눌러 "찾아보기"를 분석하면. 각 기록 M 모드 TRACI을 재생NG와 평균 심장 박동수 (도 3b)을 구하는 인접한 피크 (시간 / 유동주기) 사이의 간격의 다수의 측정 (추적 당 적어도 5)를 수행한다.
참고 : 일부 프로토콜 흔들림 scanhead의 고정 스탠드를 사용하는 것이 좋습니다. 그러나, 횡 배아의 관찰 어렵게 분석의 각도를 억제. 스탠드 각 배아 조정되어야 것으로도, 분석 속도가 느려. 역에 팔을 정착하면서 scanhead을 잡고 효율적으로 흔들림 최소화 할 수 있습니다. 5-10 임신 한 여성과 훈련의 결과를 최적화하는 것이 좋습니다.
5. 유전자형
- 깨끗한 수술 가위 집게를 사용하여, 길이 방향으로 피부와 복부의 근육 층을 새겨. 각 자궁 경적의 주머니를 찾아 번호를 일치합니다. 위에서 사용 된 순서로 배아를 노출하는 난황을 열 컷. 선형 배열에없는 경우, 조각에 태아 위치의 스케치피부에 자국이 더 이상 볼 수 있습니다 일단 종이 필수적 일 것이다.
- 게놈 DNA는 매우 효율적으로 배아의 꼬리에서 추출한으로 유전자형에 꼬리 만 ~ 4mm를 잘라.
참고 : (I) 수술은 영상 실에서 별도의 위치에서 수행해야 할 수 있습니다. 그러나, 마우스를 이동 번호 배아의 트랙을 유지하기 위하여 이미징 플랫폼에서 수술을하지 않는 것이 중요하다. 수술을 최적화하는 동물 시설 관리자에게 문의하십시오. 태아는 촬영 후 유전자형에 제거 할 때 (II) 임신 한 여성이 빠르게 인한 혈액 손실에 죽는다. 우리의 동물 관리위원회에서 권장하는대로, 꼬리 절단 한 후, 태아는 저체온증에 의해 마취 얼음에 3 분을 배치 한 다음 가위로 목을 베.
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Representative Results
위의 방법은 자궁에서 E18.5에서 마우스 태아의 심장 박동수에 내피 세포에 존재 세린 프로테아제 furin의 부재의 영향을 평가하기 위해 사용되었다. Furin 기본 잔류 후 proprotein의의 convertases (PCS) 그 베기 단백질 전구체의 가족에 속한다. Furin와 그 기판은 분비 단백질 및 단리는 골지체, 엔도 좀에서 또는 세포 표면에서 발생할 수있다. furin의 핵심 기판 TGFB 및 심장 개발에 중요한 역할을 같은 뼈 형태 형성 단백질 (BMP에) 등 TGFB 같은 요인을 포함한다. PC의 가족의 다른 구성원은 체외 절단 (6)에 의해 furin의 전형적인 기판을 활성화 할 수 있습니다. 개발하는 동안 furin의 키와 고유 한 역할은 배아 일 11 7에서 furin 결핍 된 배아의 조기 사망에 의해 입증된다.
furin 결핍 배아에 의해 전시 된 결함의 대부분의 중요한 기능을 제안하기 때문에furin는 내피 세포에서 효소의 역할이 내피 세포의 특정 녹아웃 (ECKO) 쥐에서 조사 하였다. Furin 유전자 (8)의 조건 flox 대립 유전자를 가지고 Furin flox / flox 생쥐에 유전자를 운반 Furin flox / + 생쥐와 교배 Cre 호텔 재조합 효소의 발현은 내피 세포의 특정 Tie2의 프로모터 (9)에 의해 구동된다. 내피 세포에서, 크레는 신호 펩티드 및 prosegment의 일부를 인코딩함으로써 불활 Furin 대립 유전자를 발생 Furin 유전자의 엑손 2의 측면이 효소는 loxP 서열을 재결합. ECKO 신생아는 내피 세포 전구체의 처리 furin의 중요한 역할을 확인, 출생 직후 사망합니다.
E18.5에서 태아의 심장 박동의 자궁 분석에서 그 동형 접합, 그러나 이형, 빈맥 고통 ECKO 배아 (높은 심박수 보여, 그림 4 10을 발표했다.
그림 1. 시스템 셋업의 개요. 홀더의 scanhead와 (A) 매우 높은 주파수의 초음파 시스템이 표시됩니다. (B) 역은 마취 시스템, 생리 컨트롤러 장치 및 재료를 포함한다. 카릭 큰 이미지를 보려면 여기를 K.
그림 2. 마우스 - 설정합니다. (A) 임신 한 마우스가 이소 플루 란 공급 부정사 위치에 배치하고 테이프로 플랫폼에 구속된다. (B) 복부 제모 후에, 배아의 위치는 복부에 표시되고, 또는 (C)는 용지에 스케치. (D) 목적 결상면은 초음파 겔과 접촉 유지 scanhead 이동시킴으로써 얻어진다. 팔뚝 안전하게 흔들림 역에 배치됩니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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그림 3. 심박수의 대표적인 평가는. (A) E18.5에서 배아 심장의 이차원 심 초음파 화상은 황색 점선 중심 초점 영역 내에서의 위치를 얻었다. 두 심실은 화살표로 표시됩니다. LV, 심실 왼쪽, RV, 우심실을. (B) 심박수는 M 모드 추적 인접 흐름주기 사이의 반복 측정에서 계산됩니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. 심장 박동의 대표적인 데이터 분석은. 자궁 초음파 검사에서 E18.5에서 9 WT 7 ECKO 배아 마음 (M 모드)는 30 MHz의 변환기를 사용하여 수행 하였다. 이러한 배아 w감수 3 독립적 인 새끼 얻을. P <0.0005 (***)는 두 개의 꼬리 학생의 T-테스트 및 막대로 결정 하였다는 평균 ± SEM을 나타냅니다. WT, 유전자 부정적인 Furin flox / + 또는 Furin flox / flox 마우스;. ECKO, Furin flox / flox의 Tg (Tie2의-CRE) + / 0 생쥐는 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
M-모드 초음파 심장 검진 법은 마우스 배아의 자궁 내 심장 요금에 측정 할 수있는 효과적이고 간단한 방법입니다. 시판 트랜스 듀서는 작은 고동 치는 마음을 시각화하기에 충분한 해상도를 제공합니다. 따라서, 그런 펄스 측정과 같은 다른 방법에 비해, 매우 정확한 심박수 측정을 허용하고, 고해상도 비디오 현미경을 대체 할 수있다. 그러나, 현재의 도구는 배아의 각을 시각화하는 지루한 과정을 의미, 모든 배아의 동시 분석을 허용하지 않습니다. 또한,보기의 비교적 좁은 필드와 필드 (2D 이미지)의 깊이의 부재는 숙련 된 손에 의해 달성 수동 조정이 필요합니다. 실제로, 적절한 교육이 크게이 방법의 효율성을 극대화 할 수 있습니다.
배아 심장 박동수 (E18.5)의 생체 측정에서 이전의 방법과 다른, 그것은 수행과 같은 비 침습적 라이브 영상으로 심장 기능의 생리 학적 평가를 제공합니다개복 수술을 필요로하지. 대신, 임신 한 여성의 복부에 태아의 위치를 표시하는 적절한 추적을 보장하고 자신의 생리 상태를 유지합니다. 그러므로, 절차는 컴퓨터 단층 촬영 및 자기 공명 영상과 같은 다른 이미징 기술의 중요한 약점을 극복한다. 적어도 마지막으로,이 방법은 비용이 저렴.
이 방법의 몇 가지 중요한 단계는 가열 램프의 위치를 조정하고 태아의 생리 학적 상태를 유지하고, 신뢰성있는 데이터를 얻기 이소 플루 란의 적절한 비율을 생성함으로써 안정된 임신 한 쥐의 체온과 심박수를 유지 있습니다. 일관된 방식으로 가능한 짧은 시간에 진행하는 것은 필수적이다. 따라서 절차의 간단한 유지하고 이전 절차를 연습하는 것이 좋습니다.
결론적으로, M-모드 초음파 검사는 자궁 내 태아의 심박수를 평가하기위한 효과적인 방법입니다. 비정상말의 심박수는 심장 기능 장애의 지표로하고 설명하는 방법은 마우스 모델에서 심장 마비로 이어지는 발달 결함에 대한 화면으로, 전문가뿐만 아니라 비전문가을 허용합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 그림 1과 2의 사진 촬영을 위해 심 초음파 앤 Chamberland에서 훈련 마농 Laprise 감사합니다. 이 작품은 건강 연구 보조금 MOP 44,363의 캐나다 연구소와 캐나다 의자 950-216684에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406v2 | 1-chloro-2,2,2-trifluoroethyl difluoromethyl ether |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic Clear | |
| Electrode gel | Parker Laboratories Inc. | Spectra 360 | |
| Ophthalmic gel | Novartis | Tear-Gel | |
| Depilatory cream | Church Dwight Co., Inc. | Nair | |
| Hair clipper | |||
| Gauze/cotton swap | Q-tips | ||
| Permanent marker | |||
| High-Resolution In vivo Ultrasound Imaging System | Visual Sonics | Vevo770 | |
| 30 MHz Transducer | Visual Sonics | RMV707B | |
| Imaging platform and physiology controller unit | Visual Sonics | ||
| Anesthetic System | Cyprane North America Inc. | 312462 | |
| Infrared heating lamp |
References
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- Miller, S. P., et al. Abnormal brain development in newborns with congenital heart disease. N. Engl. J. Med. 357, 1928-1938 (2007).
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