Summary
Ultra-ultrasuoni ad alta frequenza è un potente strumento di imaging dal vivo per esaminare anomalie cardiache nei piccoli animali. La sua invasività consente di mantenere lo stato fisiologico di embrioni. Qui, vi mostriamo l'uso di M-mode ultrasuoni per misurare le frequenze cardiache di embrioni a E18.5 in utero.
Abstract
Cardiopatie congenite (CHD) è la causa infettiva più frequente di morte alla nascita. L'incidenza di CHD va 4-50 / 1, 000 nascite (Malattia e stime regionali lesioni, Organizzazione Mondiale della Sanità, 2004). Ambulatori che spesso compromettono la qualità della vita sono necessari per correggere i difetti cardiaci, ricordandoci l'importanza di trovare le cause di CHD. Modelli di topo mutante e tecnologia di imaging dal vivo sono diventati strumenti essenziali per studiare l'eziologia di questa malattia. Anche se i metodi avanzati permettono l'imaging dal vivo di cuori anomali negli embrioni, gli stati fisiologici e emodinamici di quest'ultimo sono spesso compromesse a causa di procedure chirurgiche e / o lunghi. Noninvasive immagini ecografiche, tuttavia, può essere utilizzato senza chirurgicamente esporre gli embrioni, mantenendo quindi la loro fisiologia. Qui, usiamo semplice ecografia M-mode per valutare le frequenze cardiache di embrioni a E18.5 in utero. La rilevazione dei tassi anormali del cuore è davvero un buon indicatoretor di disfunzione del cuore e, quindi, costituisce un primo passo verso l'identificazione di difetti di sviluppo che possono portare a insufficienza cardiaca.
Introduction
CHD è la causa infettiva più comune di morte alla nascita 1. Interventi chirurgici multipli sono spesso necessari per correggere i difetti strutturali nei soggetti la cui qualità della vita può rimanere compromessa 1. I bambini con CHD sviluppano frequentemente disturbi neurologici, anche se non hanno subito un intervento chirurgico, indicando importante in utero conseguenze sullo sviluppo 2,3. Entrambi i fattori genetici e ambientali, come l'esposizione a virus o agenti chimici (alcol) durante la gravidanza, causa CHD. Studiare le contributori genetici è ancora nella sua fase iniziale, ma in rapida crescita. Per identificare questi collaboratori e comprendere il loro ruolo nello sviluppo del cuore, fenotipo topi mutanti con uno strumento semplice e potente sarà di grande beneficio.
Mouse è infatti un modello animale di scelta per studiare CHD, e la maggior parte dei casi umani può essere riprodotto in topi 4,5. Di conseguenza, mouse fetale fenotipo cardiaco è diventato increasingly importante indagare l'eziologia della malattia coronarica umana e richiede strumenti adeguati. Anche se gli studi istologici su campioni fissati hanno un valore inestimabile, in tempo reale immagini di animali vivi è fondamentale per comprendere la fisiologia del cuore. Microscopia Video offre immagini dal vivo. Tuttavia, richiede laparotomia per esporre embrioni, compromettendo così la loro stato fisiologico e emodinamico. Recentemente, ecocardiografia è diventata la tecnica di imaging standard per valutazioni cardiache nella clinica così come nei topi.
Ecocardiografia fetale mouse viene condotta utilizzando sistemi standard ultrasuoni clinici, nonché sistemi ad ultrasuoni ad altissima frequenza. Questi ultimi prevedono 30 MHz o trasduttori di frequenza superiore che generano immagini bidimensionali e permettono di valutare gli stadi embrionali precoci. Questi trasduttori hanno una profondità relativamente scarsa penetrazione (~ 13 mm), che è tuttavia sufficiente avere piani d'immagine adeguate e determinare pa cuore fondamentaleparametri, come la frequenza cardiaca, diametro interno del ventricolo sinistro e destro in diastole e sistole e setto e lo spessore della parete, senza eseguire laparotomia.
Nel nostro studio, abbiamo utilizzato un sistema ad ultrasuoni ad altissima frequenza per valutare le frequenze cardiache di embrioni di topo al giorno E18.5 embrionale. Abbiamo scelto un trasduttore 30 MHz che fornisce un campo visivo di 20 mm x 20 mm, l'ideale date le dimensioni dei feti, con una lunghezza focale di 12,7 mm. Tuttavia, un trasduttore frequenza più elevata può essere scelto per analizzare stadi precoci di sviluppo. L'M-mode selezionata permette la visualizzazione dei tessuti in movimento grazie ad una risoluzione temporale massimo di 1.000 fotogrammi / sec. La procedura completa è semplice e deve essere effettuata il più rapidamente possibile per evitare qualsiasi perturbazione degli stati fisiologici ed emodinamiche del feto. L'analisi di circa 8 embrioni richiede circa 1 ora.
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Protocol
Tutte le procedure indicate in questo protocollo sono state approvate dal Comitato Animal Care IRCM.
1. Sistema a ultrasuoni e la stazione di preparazione
- Avviare il sistema di imaging ad ultrasuoni e collegare la sonda e l'unità di controllo fisiologia secondo le istruzioni del produttore (Figura 1). Scegli cardiaca programma di misurazione e la sonda che corrisponde al trasduttore 30 MHz.
- Riempire il revolver del la sonda con acqua deionizzata. Evitare le bolle d'aria in quanto interferiscono con risoluzione di immagini. Posizionare la sonda con il lato maniglia sul suo supporto vicino alla piattaforma di imaging (Figura 1A).
- Disinfettare la piattaforma di imaging e area di lavoro.
- Riempire completamente la bottiglia di gel ultrasuoni per evitare la formazione di bolle e metterlo capovolto nel suo insieme contenitore preriscaldamento a 37 ° C (Figura 1B).
- Verificare i livelli di ossigenogen e isoflurano e il sistema di tubi per l'anestesia. Un esperimento con ~ 8 embrioni avrebbe utilizzato circa il 15-20 L di ossigeno.
- Mettere le bottiglie di balsamo oftalmica, crema depilatoria e l'elettrodo gel nei pressi della piattaforma di imaging (Figura 1B).
- Verificare che le funzioni della lampada a raggi infrarossi il calore. Durante la formazione, impostare il livello di calore, la posizione della lampada e la distanza della lampada a topi per mantenere costante la temperatura corporea e la frequenza cardiaca.
Nota: preparazione adeguata del sistema e il materiale è critica. Lunghe procedure possono influenzare le caratteristiche fisiologiche ed emodinamiche di feti più a lungo anestesia deprime la funzione cardiaca abbassando la frequenza cardiaca, la pressione sanguigna e il livello di ossigenazione del sangue. Il tempo di elaborazione per ~ 8 feti (dimensione media della cucciolata nei C57BL / 6) dovrebbe essere di circa 1 ora. Altri ceppi di topo potrebbero fornire un numero elevato di feti, possibilmente con una dimensione più grande femmina. La formazione è fondamentale per ottimizzare la Processitempo ng.
2. Preparazione mouse
- Anestetizzare la femmina incinta in una camera con continuo ricambio di 2% isoflurano in ossigeno (200 ml / min) fino a quando diventa nonresponsive.
- Posizionare il mouse sulla piattaforma di imaging in posizione supina, regolare il tubo per inalazione continua di 1,5% isoflurano in ossigeno (200 ml / min), e fissare il tubo di inalazione con nastro (Figura 2A). Anestesia sufficienti dovrebbero essere confermati nel corso del procedimento dalla postura rilassata del mouse e l'assenza di qualsiasi risposta a coda e punta pizzichi.
- Luogo elettrodi gel solo in alto a sinistra e destra elettrodi inferiori (destra anteriore della gamba e zampa posteriore sinistra, chiamata anche la posizione di piombo II) per elettrocardiografia. Piombo posizione II fornisce una migliore posizione verticale positivo P-wave definito e complesso QRS per determinare la frequenza cardiaca. Fissare le quattro zampe a ogni pad con del nastro (Figura 2A). Per prevenire la secchezza degli occhi, 1 goccia dibalsamo oftalmica in ogni occhio.
- Radere l'addome dal torace a vescica con un tagliatore di capelli. Quindi applicare la crema depilatoria per 2 minuti e pulirli con una garza e / o tampone di cotone per rimuovere con attenzione tutti i capelli rimanenti. Fare attenzione a non tagliare i capezzoli.
- Inserire il termometro prelubrificati con elettrodo gel nel retto del femminile per monitorare la temperatura corporea (dovrebbe essere mantenuto a 37 ± 0,5 ° C regolando una lampada di calore a raggi infrarossi posto sopra la piattaforma). Frequenza cardiaca dovrebbe essere di 450 ± 50 battiti / min (bpm). Sia la temperatura e la frequenza cardiaca vengono visualizzati sul controllore fisiologia (Figura 1B).
Nota: anestesia lunga, perdita di capelli e gel per ultrasuoni (anche se preriscaldata) può portare a ipotermia, che può influenzare la frequenza cardiaca della femmina. Se la temperatura corporea scende sotto 36,5 ° C, fermare la procedura e modificare la posizione della lampada di riscaldamento per regolare la temperatura e la frequenza cardiaca. Attendere un paio di minuti befORE procedere di nuovo.
3. Embrione Identificazione
- Premere delicatamente sul ventre nudo per individuare gli embrioni. Lentamente e leggermente diffonderli ad avere la maggior parte degli embrioni in un unico strato sotto la superficie addominale. In ogni corno uterino, sacche sono linearmente collegati l'uno all'altro. Provate a rispettare questo ordine quando la diffusione.
- Mark ogni embrione sul ventre nudo della femmina con un pennarello indelebile con la loro anteriore / posteriore e dorsale / ventrale direzioni. Conoscendo l'orientamento faciliterà localizzare il cuore con la sonda. Numero degli embrioni nel giusto e corna di sinistra a partire dalla cervice (1, 2, 3 ... e 1 ', 2', 3 '... rispettivamente Figura 2B).
Note: (i) Evitare di diffondere gli embrioni con forza eccessiva. Disegnare le loro posizioni su un pezzo di carta per tenere traccia di loro (Figura 2C). (Ii) C57BL / 6 femmine hanno ~ 8 feti per figliata. Tuttavia, 0-2 embrioni in ogni cucciolata sono lituato sotto le altre, rendendo impossibile la loro rappresentazione. Escludi questi embrioni dall'analisi e valutare altre cucciolate, se necessario.
4. Misurazione frequenza cardiaca
- Mettere una piccola quantità di gel per ultrasuoni preriscaldata sul ventre nudo e distribuirlo in modo uniforme. Evitare la formazione di bolle. Aggiungere una maggiore quantità di gel (~ 5 ml) nell'area specifica di immagine.
- Tenere la sonda in contatto con lo strato di gel di spessore (10 mm) e spostare gradualmente la sonda verso la pelle mentre cerca il cuore pulsante. Una volta che il cuore pulsante è visualizzato sullo schermo, regolare l'angolo della sonda di avere entrambi i ventricoli nella loro grande dimensione nel piano dell'immagine (Figura 2D).
- Inizia l'acquisizione delle immagini. Con l'avambraccio appoggiato sulla stazione, collocare il trasduttore sul gel ultrasuoni per ottenere un'immagine reale sullo schermo di visualizzazione (Figura 2D). Mantenere la cresta del trasduttore sulla parte superiore e fare clic sul orientatio testina di scansionen marcatore (in alto a sinistra dell'immagine) consentono il coordinamento del movimento della mano e l'area visualizzata sullo schermo.
- Partendo dalla cervice, spostare l'embrione più vicino contrassegnato (1 o 1 'nel corno uterino destra o verso sinistra) per visualizzare il cuore che batte sullo schermo. Perché profondità focale è fissa, spostare delicatamente la sonda su / giù e lateralmente senza perdere il contatto con il gel per ottenere il piano immagine desiderata.
- Posizionare il cuore pulsante al centro dello schermo nella regione indicata dalla linea tratteggiata gialla che rappresenta la zona focale per una migliore acquisizione dati.
- Acquisire la registrazione dal vivo. Ottenere l'immagine esploratore e riprendere la registrazione (Figura 3A). Una volta ottenuto un minimo di 10 secondi di registrazione stabile, interrompere la registrazione e salvare.
- Procedere alla prossima embrione.
- Una volta che tutti gli embrioni vengono analizzati, premere il tasto "Browse" sulla tastiera per visualizzare l'elenco delle registrazioni. Gioca ogni M-mode registrato tracing e di eseguire misurazioni multiple (almeno 5 per tracing) della distanza tra picchi adiacenti (ciclo tempo / flusso) per ottenere la frequenza cardiaca media (Figura 3B).
Nota: Alcuni protocolli suggeriscono utilizzando un supporto stazionario per la sonda per evitare di tremare. Tuttavia, esso trattiene l'angolo di analisi, rendendo l'osservazione di embrioni laterali difficile. Si rallenta anche l'analisi, il supporto deve essere regolata per ogni embrione. Tenendo la sonda mentre stabilirsi l'avambraccio sulla stazione minimizza in modo efficiente agitazione. Allenamento con 5-10 femmine gravide si consiglia di ottimizzare il risultato.
5. Genotipizzazione
- Utilizzando forbici chirurgiche pulite e pinze, incidere longitudinalmente la pelle e lo strato muscolare dell'addome. Individuare le sacche in ogni corno dell'utero e corrispondere i numeri. Tagliare aprire il sacco vitellino per esporre l'embrione nell'ordine utilizzato al di sopra. Se non in una disposizione lineare, il disegno delle posizioni embrione su un pezzodi carta sarà fondamentale una volta che i segni sulla pelle non sono più visibili.
- Tagliare solo ~ 4 mm di coda per la genotipizzazione del DNA genomico è molto efficiente estratto da code embrionali.
Note: (i) La procedura chirurgica può essere eseguita in una posizione separata dalla camera di imaging. Tuttavia, è importante non spostare il mouse e avere la procedura chirurgica sulla piattaforma di imaging per tenere traccia degli embrioni numerate. Consultare il gestore stabulario per ottimizzare la procedura chirurgica. (Ii) La femmina incinta muore rapidamente a causa della perdita di sangue come i feti vengono rimosse per la genotipizzazione dopo imaging. Dopo il taglio della coda, i feti sono collocati 3 minuti in ghiaccio per l'anestesia da ipotermia e poi decapitati con le forbici, come raccomandato dal nostro Comitato Animal Care.
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Representative Results
Il suddetto metodo è stato usato per valutare l'impatto della presenza o assenza della furina serina proteasi in cellule endoteliali su frequenze cardiache di embrioni di topo a E18.5 in utero. Furin appartiene alla famiglia delle convertasi proprotein (PC) che i precursori delle proteine fendere dopo residui basici. Furin e suoi substrati sono proteine secretorie e scissione possono verificarsi nel Golgi, endosomi o sulla superficie cellulare. Substrati chiave di furin includono TGFb, e fattori TGFb-like, come le proteine morfogenetiche ossee (BMP) che svolgono un ruolo importante nello sviluppo del cuore. Altri membri della famiglia PC possono anche attivare substrati tipici di furin per scissione in vitro 6. Il ruolo fondamentale e unico di furin durante lo sviluppo è testimoniato dalla morte precoce degli embrioni furina-carenti a giorno embrionale l'11 7.
Poiché molti dei difetti esposti da embrioni Furin-carente suggerito una funzione importante diFurin in cellule endoteliali, il ruolo dell'enzima è stato esaminato in endoteliali cellule specifiche knockout (Ecko) topi. Furin flox / flox topi che portano alleli flox condizionali del gene Furin 8 sono stati incrociati con Furin flox + / topi che portano un transgene in che l'espressione della ricombinasi Cre è guidato dal endoteliale cellule specifiche Tie2 promotore 9. Nelle cellule endoteliali, Cre ricombina due siti loxP che fiancheggiano l'esone 2 di Furin gene, che codifica il peptide segnale e parte prosegment, e quindi genera inattivati alleli Furin. ecko neonati muoiono poco dopo la nascita, confermando il ruolo essenziale della furin nel trattamento dei precursori delle cellule endoteliali.
Nell'analisi utero di frequenze cardiache in embrioni a E18.5 mostrato, ma non eterozigote, embrioni Ecko sofferto di tachicardia (battito cardiaco elevati omozigoti; Figura 4 10.
Figura 1. Panoramica del sistema di set-up viene visualizzata. (A) sistema ad ultrasuoni ad altissima frequenza con la sonda nel suo supporto. (B) La stazione comprende un sistema anestetico, l'unità di controllo fisiologia e materiali. Clic k qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 2. Mouse Set-up. (A) Il mouse incinta è posto in posizione supina con alimentazione isoflurano e trattenuto sulla piattaforma con nastro adesivo. (B) Dopo la rimozione dei capelli addominale, la posizione degli embrioni è segnato sull'addome o (C) abbozzato su una carta. (D) e il piano dell'immagine desiderata viene ottenuta spostando la sonda che rimane in contatto con il gel ultrasuoni. L'avambraccio è posizionato correttamente sulla stazione per evitare di tremare. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Figura 3. Valutazione rappresentativa della frequenza cardiaca. (A) Un'immagine ecocardiografia bidimensionale di un cuore embrionale a E18.5 stata ottenuta posizionando all'interno della zona focale centrata sulla linea tratteggiata gialla. I due ventricoli sono indicati da frecce. LV, ventricolo sinistro, RV, ventricolo destro. (B) La frequenza cardiaca è calcolata da misure ripetute tra i cicli di flusso adiacenti in M-mode tracing. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 4. Rappresentante analisi dei dati della frequenza cardiaca. In utero ecocardiografia (M-mode) del 9 WT e 7 Ecko cuori di embrioni a E18.5 è stata effettuata utilizzando un trasduttore 30 MHz. Questi embrioni were ottenuto in 3 cucciolate indipendenti. P <0.0005 (***) è stata determinata con il test t e barre di Student a due code rappresentano la media + SEM. WT, transgene negativo Furin flox / + o Furin topi flox / flox,. Ecko, Furin flox / flox Tg (Tie2-cre) + / 0 topi Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Discussion
Ecocardiografia M-mode è un metodo efficace e semplice per misurare in utero frequenze cardiache di embrioni di topo. Trasduttori disponibili in commercio offrono una risoluzione sufficiente per visualizzarne i piccoli cuori pulsanti. Così, essi consentono la misurazione della frequenza cardiaca estremamente preciso, rispetto ad altri metodi quali misurazione impulsi, e possono sostituire microscopia video ad alta risoluzione. Tuttavia, gli strumenti attuali non consentono l'analisi simultanea di tutti gli embrioni, che implica una procedura noiosa per visualizzare ciascuna delle embrioni. Inoltre, il campo relativamente ristretto di vista e l'assenza di profondità di campo (2D-immagine) richiedono una regolazione manuale realizzati soltanto a mani esperte. Infatti, una formazione adeguata può massimizzare notevolmente l'efficienza di questo metodo.
Nelle misure vivo di frequenza cardiaca embrionale (E18.5) offre una valutazione fisiologica della funzione cardiaca da un invasivo di imaging dal vivo, diverso dai metodi precedenti, lo fanon richiede laparotomia. Invece, segna la posizione degli embrioni sull'addome della donna incinta assicura un corretto inseguimento e conserva loro stato fisiologico. Pertanto, la procedura supera la maggiore debolezza di altre tecnologie di imaging, come la tomografia computerizzata e la risonanza magnetica. Ultimo ma non meno importante, questo metodo è meno costosa.
A pochi passi critici di questo metodo includono mantenere la temperatura corporea e la frequenza cardiaca del mouse incinta stabile regolando la posizione della lampada di riscaldamento e generando un tasso adeguato di isoflurano per mantenere lo stato fisiologico di embrioni e acquisire dati affidabili. Procedendo in modo coerente e nel più breve tempo possibile è essenziale. Pertanto, mantenendo la semplice procedura e la pratica prima di procedere è altamente raccomandato.
In conclusione, ecocardiografia M-mode è un metodo efficace per valutare le frequenze cardiache embrionali in utero. Anomaliefrequenze cardiache normali sono indicativi di disfunzione cardiaca e il metodo descritto consentiranno specialisti, così come non specialisti, per lo screening per difetti di sviluppo portato ad insufficienza cardiaca in modelli murini.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo Manon Laprise per la formazione in ecocardiografia e Ann Chamberland per scattare le foto esposte nelle figure 1 e 2. Questo lavoro è stato sostenuto dal Canadian Institutes of Health Research Grant MOP 44363 e Canada Chair 950-216.684.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406v2 | 1-chloro-2,2,2-trifluoroethyl difluoromethyl ether |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic Clear | |
| Electrode gel | Parker Laboratories Inc. | Spectra 360 | |
| Ophthalmic gel | Novartis | Tear-Gel | |
| Depilatory cream | Church Dwight Co., Inc. | Nair | |
| Hair clipper | |||
| Gauze/cotton swap | Q-tips | ||
| Permanent marker | |||
| High-Resolution In vivo Ultrasound Imaging System | Visual Sonics | Vevo770 | |
| 30 MHz Transducer | Visual Sonics | RMV707B | |
| Imaging platform and physiology controller unit | Visual Sonics | ||
| Anesthetic System | Cyprane North America Inc. | 312462 | |
| Infrared heating lamp |
References
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- Miller, S. P., et al. Abnormal brain development in newborns with congenital heart disease. N. Engl. J. Med. 357, 1928-1938 (2007).
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