Summary
超高频超声是一个功能强大的实时成像工具，研究在小动物心脏异常。其无创允许维持胚胎的生理状态。在这里，我们将展示采用M型超声测量胚胎的心脏率E18.5 在子宫内 。
Abstract
先天性心脏疾病（CHD）死亡是出生时最常见的非感染性原因。冠心病的发病率介乎4至50/1，000胞胎（疾病和损伤区域的估计，世界卫生组织，2004年）。手术，往往危及生命的质量需要纠正心脏缺陷，提醒发现冠心病的原因的重要性。突变小鼠模型和实时成像技术已成为必不可少的工具来研究这种疾病的病因。虽然先进的方法让心中异常胚胎的实时成像，后者的生理和血流动力学状态往往是由于手术和/或冗长的程序损害。非侵入性超声成像，但是，可以使用，不用手术暴露的胚胎，从而保持它们的生理机能。在此，我们用简单的M型超声在子宫内评估在E18.5胚胎的心脏速率。心脏异常率的检测的确是一个不错的籼对心脏功能障碍的器，从而构成，可能导致心脏衰竭发育缺陷的识别的第一步。
Introduction
冠心病是死亡在出生1最常见的非感染性原因。通常需要多次手术，以纠正其科目的生活质量可能会保持1受损的结构性缺陷。冠心病的孩子经常发生，即使他们没有经历手术神经系统紊乱，说明在发展2,3 宫内的后果非常重要。遗传和环境因素，如接触到病毒或化学品（酒精）怀孕期间，引起冠心病。研究遗传贡献者仍然处于早期阶段，但发展迅速。为了找出这些贡献者和了解他们在心脏发育的作用，表型分型突变小鼠用一个简单而强大的工具将是非常有益的。
鼠标确实是选择冠心病研究的动物模型，和大多数人的情况下，可以在小鼠4,5重现。因此，胎鼠心脏表型已成为INCreasingly重要的是要研究人类冠心病的病因，需要足够的工具。虽然固定的标本组织学研究是非常宝贵的，活的动物的实时成像关键的是要了解心脏的生理机能。视频显微镜提供实时成像。但是，它需要剖腹暴露的胚胎，从而危及到他们的生理和血流动力学状态。最近，超声心动图已成为在诊所以及在小鼠心脏评估的标准成像技术。
小鼠胎儿超声心动图是使用标准的临床超声诊断系统，以及超高频超声系统进行。后者提供30 MHz或产生二维图像，并允许早期胚胎阶段的评价较高频率换能器。这些传感器具有相对较差的穿透深度（〜13毫米）的，这一点，然而，足以获得足够的成像平面，并确定基本心脏每年rameters，如心脏速率，左，右心室内径在舒张期和收缩期和隔垫和壁厚，不进行剖腹手术。
在我们的研究中，我们使用了一个超高频超声系统，以评估在胚胎一天E18.5小鼠胚胎的心脏速率。我们选择了30 MHz的换能器，提供20毫米×20毫米，这是理想的给定的胎儿的大小，具有12.7毫米的焦距的视场。然而，较高的频率换能器可以被选择为分析早期发育阶段。所选择的M-模式允许组织在运动中由于1000帧/秒的高时间分辨率的可视化。完整的程序很简单，应该尽快进行，以避免胎儿的生理和血流动力学状态中的任何扰动。约8个胚胎的分析需要约1小时。
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Protocol
在这个协议中显示的所有程序已批准红外对抗动物保护委员会。
1。超声系统和终端准备
- 启动超声成像系统，并根据制造商的指示（ 图1）连接的扫描头以及生理学控制器单元。选择心脏测量程序和相对应的30兆赫传感器的扫描头。
- 填用离子交换水的扫描头的物镜转换器。避免产生气泡，因为他们与成像分辨率干涉。将扫描头与手柄侧面上的保持器附近的成像平台（ 图1A）。
- 消毒成像平台和工作区。
- 完全填充瓶超声波凝胶，避免泡沫的形成，并把它倒挂在其prewarming容器设置为37°C（ 图1B）。
- 验证氧基的含量根和异氟醚和管道系统进行麻醉。一个实验〜8胚胎会使用约15-20 L氧气。
- 将眼科唇膏，脱毛霜及附近的成像平台（ 图1B）电极凝胶的瓶子。
- 确认红外线烤灯功能。在训练过程中，设置热级中，灯的位置和使灯泡的小鼠以维持恒定的体温和心脏速率之间的距离。
注意：适当准备的系统和材料是至关重要的。冗长的程序，可能会影响胎儿的生理和血流动力学特征，只要麻醉通过降低心脏心率，血压和血液氧合水平踩下心脏功能。的处理时间〜8胎（平均产仔数的C57BL / 6）应为大约1小时。其他小鼠品系可以提供一些胎儿较高，可能与较大的女性的大小。训练是必不可少的，以优化processi纳克时间。
2。鼠标准备
- 麻醉的妊娠女性中，用2％异氟烷在氧气中连续供给（200毫升/分钟）的腔室，直到它变得无响应。
- 将鼠标的成像平台上仰卧位，调整管连续吸入氧气1.5％异氟醚（200毫升/分钟），并固定吸入管带（ 图2A）。足够的麻醉应在手术过程中通过鼠标的轻松的姿势，并没有对尾部和脚趾捏的任何响应的证实。
- 仅在左上角和右下角电极片（右前腿和左后腿，也称为Ⅱ导联位置）心电图电极放置凝胶。 II导地位提供了更好的定义正面直立P波和QRS波群，以确定心脏速率。使用胶带（ 图2A）固定四只爪子到每个焊盘。为了防止眼睛干涩，适用1滴眼科唇膏为每只眼睛。
- 从胸部剃腹部膀胱理发推子。然后申请脱毛霜2分钟，用纱布和/或棉签擦去小心删除任何剩余的头发。注意不要切断乳头。
- 插入预润滑与电极凝胶进入女性的直肠监测体温的温度计（应保持在37±0.5℃下，通过调整在红外加热灯下放在上面的平台）。心脏率应该是450±50次/分（BPM）。温度和心脏速率显示在生理学控制器单元（ 图1B）上。
注：龙麻醉，脱发和超声波凝胶（尽管预热的）可以导致体温降低，这可能会影响女性的心脏速率。如果体温低于36.5℃时，停止该程序，并修改所述加热灯的位置来调节温度和心脏速率。等待一两分钟BEF矿石再次出发。
3。胚胎鉴定
- 轻轻按在腹部赤裸下来，找到胚胎。慢慢地，轻轻地传播出来有大部分胚胎在腹部表面下的单层。在每个子宫角，囊直线地彼此连接。尝试蔓延时要尊重这个秩序。
- 马克每个胚胎在女性的裸体腹部与他们的前/后和背/腹方向上的永久性标记。知道方向将促进与探头定位的心脏。数在右边的胚胎和离开角从子宫颈（1，2，3 ...和1'，2'，3'...分别; 图2B）开始。
附注：（i）避免与传播过度用力的胚胎。画出其上的一张纸的位置来跟踪它们（ 图2C）。 （二）C57BL / 6女性有每胎〜8胎。然而，胚胎0-2在每个垃圾都升ocated别人之下，使他们的成像是不可能的。从分析中排除这些胚胎，如果需要评估更多的窝。
4。心脏速率的测定
- 将少量的赤裸的腹部超声预热凝胶均匀涂抹均匀。避免形成气泡。上的特定区域进行图像添加较大量的凝胶（〜5ml）中。
- 将探头与厚的凝胶层（10mm）的接触，并逐渐移动探头向皮肤，同时寻找跳动的心脏。一次跳动的心脏被可视屏幕上，调整探头的角度，有两个心室中的最大尺寸在成像平面（ 图2D）。
- 开始采集图像。用前臂休息站上，放置在超声凝胶换能器，以获得实时图像的观察屏（ 图2D）上。保持传感器顶部的脊，然后点击扫描头倾向¼Ñ标记（在图像的左上角）允许指针的动作及可视区域在屏幕上的协调。
- 从子宫颈开始，移动到标记（在右侧或左侧子宫角1或1'，分别）以可视化的心脏跳动在屏幕上最接近的胚。由于焦点深度是固定的，轻轻移动探头向上/向下和横向不丢失与凝胶接触，以获得所需的图像平面。
- 由代表聚焦区域获得更好的数据采集黄色虚线表示的区域内的屏幕中心跳动的心脏的位置。
- 采集现场录音。获得侦察员形象和恢复录制（ 图3A）。一旦获得最低10秒稳定的记录的，停止录音并保存。
- 继续下一个胚胎。
- 一旦所有的胚胎进行了分析在键盘上，按“浏览”来查看记录列表。发挥每个记录的M型崔西纳克和执行相邻峰（时间/流循环）之间的间隔的多个测量值（至少是5,00跟踪），以获取平均心脏速率（ 图3B）。
注意：某些协议建议使用固定支架的扫描头，以避免晃动。然而，它抑制分析的角度，使得横向观察胚胎的困难。它也减慢了分析，如支架，必须调整每个胚。拿着扫描头同时解决前臂站上有效地减少震动。培训与5-10怀孕的女性，建议优化的结果。
5。基因分型
- 使用清洁的外科剪刀和镊子，切割纵向皮肤和腹部的肌肉层。找到囊中的每个子宫角和相匹配的数字。剖开卵黄囊揭露胚胎在上面使用的顺序。如果不是以线性排列，一块胚胎位置的草图纸将是至关重要的，一旦在皮肤上的标记是不可见。
- 用于基因分型只切〜4毫米尾基因组DNA是从胚胎尾部非常有效地提取。
注：（ⅰ）所述的外科手术过程可能需要在一个单独的位置，从成像室进行。然而，它不移动鼠标并具有以保持编号的胚胎的轨道成像平台上的外科手术是非常重要的。咨询动物设施经理优化外科手术。 （二）怀孕的女性很快因失血死亡的胎儿影像被删除后，进行基因分型。后尾切，胎儿被放置3分钟，冰浴麻醉体温过低，然后断头用剪刀的建议，我们的动物保护委员会。
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Representative Results
上述方法被用于评估在子宫内对小鼠胚胎的心脏速率存在或不存在的丝氨酸蛋白酶弗林蛋白酶的内皮细胞在E18.5的影响。弗林属于前蛋白转化酶（个人电脑）的切割蛋白前体的碱性氨基酸残基后的家庭。弗林蛋白酶和它的底物是分泌蛋白和裂解可以发生在高尔基体，内体或在细胞表面。弗林蛋白酶的关键底物包括TGFB，以及TGFB样因子，如骨形态发生蛋白（BMPs）中发挥心脏发育中起重要作用。在PC家族的其他成员也可以激活弗林通过体外切割6典型的底物。弗林的发展过程中的重要而独特的作用是通过弗林蛋白酶缺陷的胚胎在胚胎11天7早期死亡证明。
因为许多由弗林缺陷的胚胎表现出的缺陷提出的一项重要功能弗林蛋白酶在血管内皮细胞中，酶的作用进行了检查中的内皮细胞特异性敲除（ECKO）小鼠。携带的弗林蛋白酶基因8的条件FLOX等位基因弗林蛋白酶FLOX / FLOX小鼠进行划线与弗林蛋白酶 FLOX / +携带的转基因小鼠该Cre重组酶的表达是由内皮细胞特异性启动子的Tie2 9驱动。在内皮细胞中，重新组合的Cre侧翼弗林蛋白酶基因，它编码信号肽和prosegment的一部分，并由此产生灭活的弗林蛋白酶等位基因的外显子2 的两个loxP序列 。 ECKO新生儿死亡出生后不久，证实弗林在内皮细胞前体加工中的重要作用。
在心脏率，胚胎在E18.5的子宫内分析表明，纯合子，但不杂，从心动过速遭受ECKO胚胎（高架心脏速率; 图4 10。
图1。所示的系统设置概述（一 ）超高频超声系统，在其持有的扫描头。 （B）该站包括麻醉剂体系中，生理控制器单元和材料。 CLIC ķ此处查看大图。
图2。鼠标设置。（一 ）孕鼠置于仰卧位与异氟醚供应和抑制用胶带在平台上。 （二）后腹部脱毛，胚胎的位置上标有上腹部或（C）描绘在纸上。 （D）期望的成像平面是通过移动该保持与超声凝胶接触的扫描头获得的。前臂稳固地放在站上，以避免晃动。 点击这里查看大图 。
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图3。心脏速率代表性的评估。（A）是由集中于黄色虚线的焦点区域内的定位也获得了胚胎的心脏在E18.5的二维超声心动图图像。两个心室由箭头指示。 LV，左心室，房车，右心室。 （二）心率是从M型跟踪相邻的流周期之间反复测量计算。 点击这里查看大图 。
图4。 在子宫内超声心动图9 WT和7 ECKO胚胎心脏在E18.5（M型）使用30 MHz的传感器进行心脏速率代表性的数据分析。这些胚胎瓦特ERE在3个独立窝获得。 P <0.0005（***）通过双尾学生t-检验并确定棒代表平均值±SEM表示。 WT，转基因阴性弗林FLOX / +或弗林FLOX / FLOX小鼠; ECKO， 弗林FLOX / FLOX的Tg（的Tie2-CRE）+ / 0小鼠点击这里查看大图 。
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Discussion
M型超声心动图是在小鼠胚胎的子宫内心脏率来衡量一种有效而简单的方法。市售的转换器提供足够的分辨率以可视化的小跳动的心。因此，它们允许一个高度精确的心脏速率测量时，相对于其他方法，如脉冲的测量，并且可以替换高分辨率视频显微镜。然而，目前的工具不允许所有胚胎的同时分析，这意味着一个繁琐的过程可视化每个胚胎。此外，鉴于相当窄的领域和不存在字段（2D图像）的深度，只需要由受过训练的手中实现了手动调节。事实上，适当的训练可以大大最大限度地利用这一方法的有效性。
在胚胎的心脏速率（E18.5）的体内测量由一种非侵入性实时成像的，从以前的方法不同，但它确实提供了心脏功能的生理评价不需要剖腹探查术。相反，标记上的怀孕女性腹部胚胎的位置确保了正确的跟踪，并保留其生理状态。因此，该过程克服了其他成像技术，如计算机断层扫描和磁共振成像的主要弱点。最后但并非最不重要的，这种方法是成本较低。
在这个方法中有几个关键的步骤包括保持孕鼠稳定通过调整加热灯的位置并产生异氟醚的正确率，以维持胚胎的生理状态，并获得可靠数据的体温和心脏速率。继续以一致的方式，并在最短的时间内是必不可少的。因此，保持程序简单，练习之前，继续强烈推荐。
总之，M型超声心动图是一种有效的方法，用于评估在子宫内胚胎的心脏速率。 Abnor正常心脏率是反映心脏功能障碍和描述的方法将允许专家，以及非专业人员，筛选导致心脏衰竭的小鼠模型发育缺陷。
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Disclosures
没有利益冲突声明。
Acknowledgments
我们感谢曼侬Laprise培训在超声心动图和安伯兰采取在图1和图2所示的照片。这项工作是由卫生研究院授予澳门币44363加拿大学院和加拿大主席950-216684支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406v2 | 1-chloro-2,2,2-trifluoroethyl difluoromethyl ether |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic Clear | |
| Electrode gel | Parker Laboratories Inc. | Spectra 360 | |
| Ophthalmic gel | Novartis | Tear-Gel | |
| Depilatory cream | Church Dwight Co., Inc. | Nair | |
| Hair clipper | |||
| Gauze/cotton swap | Q-tips | ||
| Permanent marker | |||
| High-Resolution In vivo Ultrasound Imaging System | Visual Sonics | Vevo770 | |
| 30 MHz Transducer | Visual Sonics | RMV707B | |
| Imaging platform and physiology controller unit | Visual Sonics | ||
| Anesthetic System | Cyprane North America Inc. | 312462 | |
| Infrared heating lamp |
References
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