Summary
يرقات ذبابة الفاكهة هي نظام نموذجا جذابا للتصوير الحية نظرا لبشرة شفافة وعلم الوراثة الخاصة بهم قوية. يصف هذا البروتوكول كيفية الاستفادة من جهاز PDMS طبقة واحدة، ودعا 'رقاقة اليرقة' للتصوير حية من العمليات الخلوية داخل الخلايا العصبية من 3 طور مرحلي الثالثة يرقات ذبابة الفاكهة.
Abstract
التصوير الحي هو أسلوب مهم لدراسة العمليات البيولوجية الخلية، ولكن هذا يمكن أن يكون تحديا في الحيوانات الحية. بشرة شفافة من يرقة ذبابة الفاكهة يجعلها كائن نموذجا جذابا للدراسات التصوير الحي. ومع ذلك، تحديا هاما للتقنيات التصوير الحية يتمثل في شل noninvasively ووضع حيوان على المجهر. ويعرض هذا البروتوكول طريقة بسيطة وسهلة الاستخدام للشل حركة والتصوير يرقات ذبابة الفاكهة على polydimethylsiloxane (PDMS) جهاز ميكروفلويديك، الذي نسميه 'رقاقة اليرقة'. وتتألف الشريحة اليرقة من PDMS microchamber تركيب دافئ التي يتم تركيبها على الزجاج ساترة رقيقة، والتي، بناء على طلب من فراغ عن طريق حقنة، يشل الحيوان ويجلب هياكل بطني مثل الحبل العصبي والأعصاب قطعي، والجسم عضلات جدار، على مقربة من ساترة. وهذا يسمح لالتصوير ذات الدقة العالية، والأهم من ذلك، يتجنب استخدام انوsthetics والمواد الكيميائية، مما يسهل دراسة مجموعة واسعة من العمليات الفسيولوجية. منذ اليرقات بسهولة استعادة من الشلل، ويمكن أن تخضع بسهولة لجلسات التصوير متعددة. وهذا يسمح للدراسات طولية على دورات زمنية تتراوح بين ساعات إلى أيام. يصف هذا البروتوكول خطوة بخطوة كيفية إعداد شريحة وكيفية الاستفادة من رقاقة لتصوير حي للأحداث العصبية في 3 الثالثة طور مرحلي اليرقات. وتشمل هذه الأحداث في النقل السريع من العضيات في محاور عصبية، والاستجابات الكالسيوم إلى الإصابة، ودراسات الوقت الفاصل بين الاتجار وصور قابلة للتحويل البروتينات لمسافات طويلة وجداول زمنية. تطبيق آخر من الشريحة هو دراسة التجدد والاستجابات التنكسية للإصابة محور عصبي، وبالتالي فإن الجزء الثاني من هذا البروتوكول يصف الإجراء الجديد وبسيطة للإصابة محاور داخل الأعصاب الطرفية عن طريق سحق العصب قطعي.
Introduction
ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة السوداء البطن، وقد استخدمت بوصفها النموذج الحي لأكثر من 100 سنة، ولقد أثبتت تأثيرها الفعال في تحديد الإشارات الأساسية والمسارات التنموية التي يتم حفظها من اللافقاريات إلى الإنسان. التصوير الحي هو مدخلا مهما لدراسة الآليات الخلوية، والخطة بسيطة وبشرة الجسم الشفاف لليرقة ذبابة الفاكهة يجعلها جذابة للنظام التصوير الحية، لا سيما وأن هناك العديد من الأدوات الجينية المتاحة للتعبير عن البروتينات الموسومة fluorescently في أنواع معينة من الخلايا.
تحديا هاما للتقنيات التصوير الحية يتمثل في شل noninvasively ووضع حيوان للفحص المجهري. وتشمل النهج الشلل التقليدية تشريح 1،2 أو استخدام الكلوروفورم، وكلاهما قتل الحيوان. والتخدير استخدمت أيضا الأثير 4 وisofluorane 5-8. بينما توفر العديد من المزايا التخدير، كما أنها تمنع النشاط العصبي وعلم وظائف الأعضاء الهامة (بما في ذلك ضربات القلب) 9-11، وبالتالي يمكن أن يؤثر على عملية دراسة وخلق الضغط على الحيوان. وهناك أيضا مخاوف تتعلق بالسلامة الإنسان للعمل مع الأثير، وisofluorane.
قمنا بتطوير طريقة خالية من المخدرات لشل حركة يرقات ذبابة الفاكهة في طبقة PDMS الجهاز ميكروفلويديك واحد، والذي نسميه 'رقاقة اليرقة' 12. وهذا البروتوكول تصف كيفية الحصول أو جعل رقاقة يرقة، وكيفية الاستفادة منه لتصوير حي في أوائل نظموا 3 طور مرحلي الثالثة اليرقات. تتألف الرقاقة من microchamber تركيب دافئ، والتي، بناء على طلب من فراغ عن طريق حقنة، يشل الحيوان عن طريق القوة الميكانيكية لطيف. طريقة تجميد يجلب هياكل بطني مثل الحبل العصبي والأعصاب قطعي، وعضلات جدار الجسم، على مقربة من ساترة الزجاج. وهذا يسمح لتصوير عالية الدقة من هذه الهياكل مع أبر العددية عاليةتلح (تضخم عالية) الأهداف.
وتشمل المزايا التي تتمتع بها رقاقة اليرقة على التقنيات التقليدية الأخرى ما يلي: (ط) استخدام رقاقة يرقة يحل محل استخدام المواد الكيميائية، والسماح لفي الجسم الحي التصوير من الحيوانات unanesthetized. (ب) استعادة اليرقات على الفور بعد الافراج عن رقاقة (على النقيض من فترة نقاهة 2 ساعة لisofluorane 8،13). وهذا يسمح للتصوير على جداول زمنية واسعة، بدءا من ميلي ثانية إلى دقيقة، لساعات وأيام. (ج) استخدام PDMS، والذي هو مادة قابلة للاختراق الغاز، وتمكن لنشر المستمر من الأوكسجين / الهواء من البيئة إلى الجسم اليرقة. (د) رقاقة سهلة وآمنة للاستخدام، و (ت) هو قابل لإعادة الاستخدام، ويمكن تصنيعها بأقل تكلفة.
بالإضافة إلى التعليمات الخاصة باستخدام رقاقة يرقة، وهذا البروتوكول تقديم عدة أمثلة لاستخدامه لدراسة الأحداث العصبية في 3 الثالثة طور مرحلي اليرقات. وتشمل هذه التصوير الحي من axonaالنقل لتر، الكالسيوم الاستجابات للإصابة، ودراسات الوقت الفاصل بين الاتجار وصور قابلة للتحويل البروتينات عبر مسافات طويلة وجداول زمنية.
تطبيق آخر من الشريحة هو دراسة الاستجابات العصبية للإصابة محور عصبي. لهذا يوصف إجراء إضافية (في الجزء 3) لإصابة في الأعصاب الطرفية محاور عصبية من قبل سحق العصب قطعي. هذا الفحص بسيط يمكن أن يؤديها على حد سواء بسرعة وبتكاثر تحت stereomicroscope تشريح القياسية، والذي يسمح لكثير من الحيوانات التي سيتم تجهيزها في نفس الوقت. الاستجابات الخلوية إلى إصابة يمكن دراستها عن طريق التصوير الحي في رقاقة اليرقة.
Protocol
1. جعل رقاقة PDMS
لجعل شريحة PDMS من العفن SU-8، اتبع الخطوات 1،1-1،7. إذا كان هو رقاقة على يد، لكنه يحتاج إلى تجميعها لاستخدامها، انتقل إلى الخطوة 1.8.
- خلط 45 غراما من قاعدة PDMS و 4.5 غرام من وكيل علاج (نسبة 10:1) من مجموعة PDMS في وعاء صغير من البلاستيك يمكن التخلص منها ومزجها جيدا باستخدام ضجة عصا من البلاستيك.
- وضع الحاوية في وعاء فراغ (مثل مجفف) لمدة 10 دقيقة لإزالة أي فقاعات.
- وضع العفن SU-8 في الجزء السفلي من 150 ملم في القطر طبق من البلاستيك وتصب ببطء الخليط PDMS على القالب. والحرص على عدم توليد فقاعات في حين صب PDMS.
- علاج PDMS في فرن (أو الحاضنة) في 650 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
- إزالة العفن PDMS/SU-8 الشفاء من الفرن واتركها تبرد لبضع دقائق.
- باستخدام شفرة حلاقة، وقطع PDMS شفي على طول حافة القالب SU-8 وسلخه من SU-8 العفن.
- تقسيم بلاطة PDMSفي PDMS الفردية رقائق باستخدام شفرة حلاقة.
- باستخدام إبرة 21 G الاستغناء، كزة حفرة في ميناء فراغ (مبين في الشكل 1A) من رقاقة PDMS.
- اتخاذ الاستغناء إبرة 23 G وتحريف طرف الإبرة من قاعدتها عدة مرات لكسر إبرة تلميح الخروج من مركز القفل.
- إدراج إبرة غيض 23 G إلى قطعة صغيرة من أنابيب البولي ايثيلين بحيث يغطي على الأقل أنابيب المليمتر من الإبرة. ثم استخدام شفرة حلاقة لقطع الأنابيب الزائدة بعيدا عن إبرة. وهذا يخلق حلقة بلاستيكية حول واحدة من نهاية الإبرة، الأمر الذي سيخلق ختم عند إدراجها في منفذ كمية فراغ.
- للاستخدام مع مجهر مقلوب (الأرقام 1B و 2A-B): إدراج إبرة غيض 23 G في حفرة من ميناء فراغ. للاستخدام مع المجهر تستقيم (أرقام 1C و2C-D): كزة حفرة الثاني على جانب رقاقة PDMS مع الدهانات 21 Gnsing إبرة؛ وهذا الثقب توفير الوصول إلى الفتحة الأولى من الجانب. ثم أدخل إبرة غيض 23 G مع عصابة أنابيب في حفرة جانبية. ضع قطعة من الشريط على الوجهين عبر الجزء العلوي من الشريحة PDMS لاغلاق الفتحة العلوية (الشكل 1C).
- تأخذ قطعة من أنابيب البولي اثيلين أن ما يقرب من 20 سم في الطول. ربط جانب واحد من الأنابيب لطرف الإبرة التي يتم إدراجها في منفذ فراغ.
- ربط الجانب الآخر من الأنبوب إلى أحد موانئ صمام 3 الطريقة (انظر '3 في اتجاه ومحبس "في قائمة المواد)
- نعلق حقنة 20 مل في واحدة من اثنين من الموانئ المتبقية. ميناء مشاركة مفتوحة للبيئة.
2. باستخدام رقاقة اليرقة للتصوير لايف
- تنظيف رقاقة PDMS مع شريط لاصق شفاف. نعلق قطعة من الشريط إلى أسفل الشريحة. تأكد من أن الشريط لمس سطح PDMS بأكمله، ثم انزع الشريط.
- كرر الخطوة أعلاه 2-3X للتأكد من عدملا توجد جزيئات أو زيت (المدورة من التجارب السابقة) على سطح الرقاقة PDMS. منذ رقاقة PDMS هي قابلة لإعادة الاستخدام، من المهم جدا لإزالة بقايا النفط لأنها يمكن أن تؤثر على التصاق PDMS على الزجاج ويؤدي إلى عدم كفاية الختم.
- نقل في وقت مبكر (أي تستخدم علفا) 3 اليرقات طور مرحلي الثالثة إلى طبق بتري تحتوي على الماء. (وتستخدم علفا 3 طور مرحلي الثالثة مرحلة اليرقات في الطعام، بدلا من الجانب من القارورة الثقافة). يستحم اليرقات في المياه لإزالة ثقافة المتوسط.
- اتخاذ ساترة الزجاج نظيفة ووضع قطرة صغيرة من النفط الهالوكربون 700 في وسطها.
- باستخدام ملقط، واختيار بلطف صعودا نظيفة، في وقت مبكر، نظموا 3 يرقة طور مرحلي الثالثة من الماء (ينبغي أن تكون اليرقة ~ 3.5-4 ملم في الطول). وضع الحيوان لفترة وجيزة على مسح خفيفة الوزن أو منشفة ورقية لإزالة الماء الزائد، ثم وضعه على انخفاض اسعار النفط. يجب أن يكون قطرة صغيرة بما فيه الكفاية بحيث القصبة الهوائية من اليرقات لا المغلفة. دعونا ستا يرقةy على انخفاض اسعار النفط لمدة 10 ثانية.
- إزالة اليرقة من انخفاض اسعار النفط ومن ثم وضعه على ساترة الزجاج نظيفة.
- نقل اليرقة إلى ساترة الزجاج نظيف آخر. هذه الخطوة يزيل فائض المعروض النفطي.
- إيلاء الاهتمام لتوجه اليرقة. لتصوير النخاع والأعصاب قطعي العصبية، وينبغي أن الجانب البطنية من يرقة الجلوس على ساترة. في الجانب الظهري، وتتميز أنبوبين القصبة الهوائية الطولية، يجب أن تواجه صعودا. ملاحظة: هذا هو التوجه اليرقة يفضل بشكل طبيعي.
- وضع بلطف رقاقة PDMS على رأس اليرقة. يجب أن تكون محاذاة اليرقة إلى منتصف وسط microchamber، مع ذيله الموجهة نحو ميناء فراغ. كن حذرا أن اليرقة لا تلمس حواف الغرفة. هذا مهم خاصة بالنسبة للمحطات القصبة الهوائية الأمامية والخلفية. ملاحظة: من الأفضل القيام بهذه الخطوة تحت stereomicroscope.
- دفع رقاقة PDMS ضد ساترة الزجاج لتحقيق ختم جيدة. تأكد من أن اليرقة تماماالمغلقة من قبل microchamber عندما رقاقة PDMS لمس ساترة الزجاج.
- تبديل 3 الطريقة صمام على ان هذه الحقنة يمكن سحب الهواء من microchamber PDMS (من خلال أنابيب) لخلق فراغ.
- بيد واحدة، وعقد ساترة PDMS رقاقة / زجاج بحزم. استخدام اليد الأخرى لسحب المكبس المحاقن. سحب 2-2.5 مل من الهواء، حتى يشعر المقاومة في التعامل مع حقنة، لخلق فراغ. الفراغ تنتج ختم ضيق بين رقاقة PDMS، والنفط، واجهات ساترة ويحد من التنقل من اليرقة.
- تبديل صمام قبالة بحيث رقاقة PDMS عزل من حقنة ومن البيئة. ونتيجة لذلك، يتم الحفاظ على مستوى مستقر نسبيا فراغ في microchamber دون الحاجة لعقد المكبس المحاقن.
- تحقق اليرقة تحت المجسام للتأكد من أن جسم الحيوان كله يتم وضعها داخل microchamber، وهذا الحيوان غير متحرك. يجب أن تكون القصبة الهوائية مرئية. بقيةوينبغي أن يكون PDMS رقاقة في اتصال مع ساترة. ملاحظة: انظر الشكلين 2E و2F للحصول على أمثلة من الحيوانات يجمد بشكل صحيح في رقاقة. وتظهر بعض التوجهات غير صحيحة في أرقام 2G و 2H.
- وضع رقاقة يرقة (PDMS رقاقة + الزجاج ساترة) على المجهر. وينبغي التعامل مع رقاقة يرقة، وأنابيب المحقنة بعناية لتجنب مفرزة من رقاقة من PDMS ساترة. لمجهر تستقيم، وتحديد الجانب 'رأس' من الشريحة إلى مرحلة المجهر مع الوجهين الشريط (الشكل 1C).
- استخدام هدفا عالية التكبير (النفط الغمر، فمن المستحسن 40-63X) لتحديد موقع هيكل الحيوان (ق) من الفائدة وإجراء التصوير. في بعض الحالات، قد تكون هناك حاجة إلى التكبير أقل لتحديد المنطقة المطلوب للتصوير قبل أن ينتقل إلى تضخم أعلى.
- عند اكتمال التصوير، وإطلاق سراح الفراغ عن طريق التحول صمام لموقفمنفتحة على البيئة.
- فصل رقاقة من PDMS ساترة. وينبغي أن تكون اليرقة متحركة على الفور.
- استخدام ملقط لإزالة اليرقة من microchamber وبلطف وضع اليرقة على طبق أجار العنب عصير لتحقيق الانتعاش.
3. الأمر الذي أدى إلى إصابة العصب سحق إلى الأعصاب القطاعي اليرقات
- اتبع الخطوة 2.3 أعلاه لعزل نظموا في وقت مبكر 3 اليرقات طور مرحلي الثالثة من النمط الجيني المطلوب. كما هو موضح في الخطوة 2.3 يستحم اليرقات في المياه لإزالة الطعام.
- استخدام محطة التخدير القياسية ذبابة CO 2، CO أبقى مع 2 وسادة تحت stereomicroscope تشريح، لإخضاع اليرقات. ينبغي أن تصبح يرقات immotile بعد التنسيب على CO 2 وسادة لمدة 1-2 دقيقة.
- الآن وضع اليرقة تخدير واحدة على عصير العنب لوحة آغار تحت stereomicroscope. بدوره الجانب البطني الحيوانية تصل إلى تصور الحبل البطني العصب والأعصاب قطعي من خلال بشرة (
- باستخدام عدد Dumostar-5 ملقط، قرصة الأعصاب قطعي بإحكام من خلال بشرة لمدة 5-10 ثانية. عندما يتم ذلك بشكل صحيح، يبقى بشرة سليمة وليس اخترقت جدار الجسم. ملاحظة: يمكن أن تتم الإصابة في مواقع مختلفة على طول محور الجسم الأمامي الخلفي، طالما أن الحبل البطني العصب، والغدد اللعابية، والأمعاء لا التالفة. الموقع الأكثر فعالية الإصابة في نهاية الجزء الثالث 3 في البطن، كما هو مبين في الشكل 3D. إصابة في هذا الموقع يضر معظم الأعصاب وأسهل لإعادة إنتاج من دون قتل الحيوان.
- بعد الإصابة، وتحويل الحيوان بحيث الجانب البطني إلى أسفل على لوحة العنب. يجب أن تكون قادرة على التحرك رأسه وتناول الطعام. إذا كانت الاصابة ناجحة، ثم ستصاب بالشلل في النصف الخلفي من يرقة.
- الحفاظ على الحيوانات المصابة على لوحة أجار عصير العنب في 25 و# 176؛ مئوية لمدة الوقت المطلوب وفقا للهدف التجريبية. لالعصبونات الحركية، ويبدأ الجذع الأقرب إلى تنبت في غضون 8-10 ساعة من إصابة 14، والجدعة البعيدة يبدأ تتحول في غضون 6-8 ساعة 15. لفئة IV دا الخلايا العصبية الحسية، ويبدأ الجذع الأقرب إلى تنبت في غضون 4-6 ساعة، وبدء الجدعة البعيدة لتتحول في غضون 3-4 ساعة بعد الاصابة. ملاحظة: مع السائقين GAL4 المناسبة وصحفيين الفلورسنت، وتنتشر وانحطاط يمكن ملاحظتها في رقاقة يرقة (على سبيل المثال، انظر الشكل 6).
Representative Results
وتتألف الشريحة يرقة واحدة كتلة طبقة PDMS، (شريحة PDMS) التي تم تفصيلها في التخطيطي في الشكل 1 التصميم. (انظر أيضا ملف DXF التكميلية لتصميم القالب الخاص بك). وmicrochamber يرقة، ومنفذ فراغ، وقنوات محيط (الشكل 1A) هي 140 ميكرون المسافات البادئة في رقاقة PDMS. يتم وضع رقاقة على قمة نظموا في وقت مبكر 3 يرقة طور مرحلي الثالثة، والتي تقع على رأس ساترة مع النفط (الأرقام 1B و 1 C). واجهة من الزجاج النفط بين ساترة وPDMS رقاقة تسمح للختم المراد إنشاؤها بناء على طلب من فراغ خفيفة. هذا الختم الفخاخ اليرقات داخل غرفة، ونظموا في وقت مبكر منذ 3 يرقة طور مرحلي الثالثة هو أكثر سمكا قليلا من الغرفة، وختم الغرفة يخلق بعض انقباض المادية على الحيوان، شل بفعالية وتقييد حركتها. في هذه الحالة يجمد، بطني معينةيتم دفع هياكل الجسم، مثل الحبل البطني العصب وقطعي على مقربة من ساترة. هذا هو مفيد للتصوير، لأنه في حالة يجمد يمكن لهذه الهياكل تقع ضمن مسافة العمل من 40X 63X والأهداف. بعد إصدارها الفراغ، اليرقة يمكن إزالتها بسهولة من microchamber، مما يسمح للمزيد من التجارب التي يتعين القيام بها. هذا النهج تجميد ميكانيكية بحتة يمكن أن تبقي على 90٪ من اليرقات على قيد الحياة بعد فترات الشلل المستمر لمدة تصل إلى 1 ساعة 12.
يتم إنشاء فراغ بنسبة بسيطة 20 مل حقنة، وبالتالي وحدة كاملة من السهل لنقل من stereomicroscope، حيث يتم تنفيذ المواقع في الغرفة، إلى المجهر متحد البؤر أو epifluorescence، حيث يتم تنفيذ التصوير الحي. يتم توصيل حقنة لميناء فراغ عبر أنابيب البولي اثيلين و 23 G الإبر الاستغناء (مع محاور قفل إزالة)، كما هو موضح في الخطوات 1،6-1،14. لالمجاهر المقلوب، وأنابيبوترتبط حقنة عبر الجزء العلوي من رقاقة (أرقام 1B، 2A، و 2 ب). لالمجاهر تستقيم، ويرتبط بعضها ببعض عن طريق منفذ على جانب رقاقة (أرقام 1C، 2C، و 2 D). تكوين لالمجاهر المقلوب هو أسهل نوعا ما للاستخدام. يتم سحبها حقنة لخلق فراغ لطيف (حوالي 10 رطل)، الذي يربط واجهة من الزجاج النفط PDMS لتشكيل ختم ضيق بين ساترة والجهاز PDMS، محاصرة وشل حركة اليرقة داخل الغرفة.
موضع اليرقة إلى microchamber (الخطوات 2،7 حتي 2،10 في البروتوكول) هو أمر حاسم لبقاء والشلل (أرقام 2E-H) فعالة. إذا كان الحيوان هو كبير جدا بالنسبة للغرفة، (الشكل 2G)، أو إذا كان رئيسها أو القصبة الهوائية تصبح اشتعلت بين حافة الغرفة والأغطيةالشفة (الشكل 1H)، فإنه من غير المرجح أن تنجو من الإجراء.
وفيما يلي عدة أمثلة لاستخدام رقاقة اليرقات لدراسة مختلف الاستجابات الخلوية في الخلايا العصبية (أرقام 4-7، وفيلم فيلم S1 S2).
التصوير النقل محور عصبي سريع: تم استخدام رقاقة اليرقة لصورة النقل بوساطة كينيسين من الحويصلات متشابك ضمن المحاور الطرفية الفردية (الشكل 4 و السينما S1) وتقدمي (~ 1.0 ميكرون / ثانية) وإلى الوراء (~ 0.8 ميكرون / ثانية. ) حركة هذه الحويصلات يمكن دراستها بسهولة من الأفلام التي تم جمعها على المجهر متحد البؤر القرص الغزل.
تحديد المواقع الحيوان لجراحة الليزر: كان مقطوع فالعصبون التغصنات الحسية باستخدام الليزر نابض صبغة الأشعة فوق البنفسجية (الشكل 5 و فيلم S2) بروتوكولات لاستخدام رطريقته لجراحة ويمكن الاطلاع على أماكن أخرى 16،17. تقنية تجميد فعالة تسمح التغييرات مقياس الوقت سريع في الخلايا العصبية المصابين، مثل التغيرات في الكالسيوم داخل الخلايا (الكشف عنها بواسطة المشفرة وراثيا كا 2 + GCamp3.0 المؤشر 18)، ليتم الكشف عن وقياس (الشكل 5).
دراسة استجابات التجدد والتنكسية الاصابة: إذا ما سمح لهذا الحيوان للراحة بين جلسات التصوير، ورقاقة يرقة ثم استخدامها لدراسة الأحداث الخلوية التي تحدث على نطاق واسع من النطاقات الزمنية. على سبيل المثال، على حد سواء "التجدد" والاستجابات التنكسية للإصابة محور عصبي، التي تجري على نطاق ووقت 15 ساعة، ويمكن تصويرها في رقاقة يرقة (الشكل 6). في هذا المثال، أصيب المحاور من العصبونات الحركية octopaminergic عن طريق سحق العصب قطعي (الشكل 3)، وصفت في الجزء 3 من البروتوكول. الجدعة محوار القريبة،الذي يخضع تنتشر جديدة، ومحاور البعيدة، والتي تشكل دوالي ومن ثم تصبح مجزأة من خلال عملية ولري انحطاط، ولا يمكن تصوير ودرس في فترات زمنية مختلفة بعد الاصابة.
تتبع البروتينات الفلورية photoconvertible على مر الزمن في الجسم الحي: تطوير البروتينات الفلورية photoconvertible، الذي يتغير بشكل لا رجعة فيه عند التعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية مضان) يسمح احد لتسمية تحديدا مجموعة فرعية من البروتينات داخل الخلية، وتتبع مصير البروتينات وصفت على مر الزمن 19 ، 20. تتم هذه التقنية الأكثر شيوعا في زراعة الخلايا، ولكن مع رقاقة يرقة واحدة يمكن أن تتبع البروتينات photoconvertible المشفرة وراثيا في خلايا محددة في الجسم الحي. كمثال وتبين لنا أن البروتين Denda2-α-تويولين الانصهار، وأعرب في الصف الرابع دا الخلايا العصبية الحسية، ويمكن photoconverted في أجسام الخلايا (أرقام 7A و
كل من الأمثلة الموضحة تم تصوير (الأرقام 4-7 وأفلام S1 و S2) باستخدام نظام متحد البؤر القرص الغزل، التي تتألف من ماسح ضوئي نيبكو CSU10 وكاميرا EMCCD C9100-50، التي شنت على محوري المراقب مع 63X (1.5 NA) الهدف النفط، ومدفوعة باستخدام البرمجيات Volocity الاستحواذ.
الشكل 1. الرسوم تخطيطي لاستخدام رقاقة اليرقة.
(A) ويتكون رقاقة اليرقة رقاقة PDMS، المشار إليها في الضوء الأزرق، انضمت إلى ساترة الزجاج. رقاقة تحتوي على 140 ميكرون قنوات ميكروفلويديك سميكة، أشارت باللون الأبيض. تم تصميم microchamber المركزية لتناسب بشكل مريح ونظموا في وقت مبكر 3 طور مرحلي الثالثة يرقة ذبابة الفاكهة (cartooned في الضوء الأخضر). يتم توفير ملف DXF تحتوي على الأبعاد الدقيقة التي يمكن استخدامها لتصميم قالب والبيانات التكميلية. مقياس شريط = 1.5 مم. مشاهدة الجانبية (BC) من الخطط لتحميل اليرقة إلى يرقة رقاقة. اليرقة يجلس الجانب البطني أسفل على ساترة، وجسمها تقع ضمن 140 ميكرون microchamber عميقة. تم توصيل 20 مل حقنة لميناء تناول فراغ ويستخدم للحث على فراغ لطيف. واجهة للنفط PDMS من الزجاج الهالوكربون لا بد من فراغ في ختم ضيق، الذي يقيد اليرقة في microchamber. هذا الختم هو عكسها بسهولةعن طريق الإفراج عن الضغط من الحقنة، وبعد ذلك الحيوان على الفور يستعيد القدرة على الحركة. لتستقيم المجاهر (B)، ويرتبط فراغ حقنة عبر أنابيب البولي ايثيلين-50 من أعلى الشريحة. لالمجاهر المقلوب (C)، يتم إجراء هذه الاتصالات من جانب رقاقة، في حين يتم إرفاق 'رأس' من الشريحة إلى مرحلة المجهر عبر الشريط على الوجهين.
الشكل 2. صور من رقائق PDMS وتحديد المواقع الصحيحة لليرقة.
(م). صور تظهر PDMS رقائق لالمجاهر المقلوب وتستقيم. تم إدراج G الاستغناء إبرة غيض 23 بمنفذ فراغ، والتي تمكن الاتصال عبر أنابيب إلى فراغ (حقنة). شريط النطاق = 1.5 مم. (EH). ذبابة الفاكهة يجمد. E و F عرض أمثلة من الحيوانات يجمد بشكل صحيح. الحيوان أصغر في جمعة هو الأفضل إذا كان سيتم إجراء صور متعددة على مدى فترات زمنية طويلة (> 12 ساعة). G يظهر الحيوان الذي هو كبير جدا، وH يدل على حيوان صغير يتم وضعه بشكل غير صحيح. شريط النطاق = 1.5 مم. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 3. إصابة العصب سحق الأعصاب قطعي في يرقات ذبابة الفاكهة.
(A) كارتون للمقايسة سحق العصبية. الأعصاب قطعي في غضون 3 الثالثة (B) عرض من الجهاز العصبي اليرقات من حيوان تشريح 20 ساعة بعد سحق العصبية. المناعية لأغشية الخلايا العصبية مع الأجسام المضادة لمكافحة HRP (الحمراء) يسلط الضوء على فصوص الدماغ، الحبل البطني العصب، والأعصاب قطعي طويلة والتي تحتوي على العصبون الحركي ومحاور الخلايا العصبية الحسية. وصفت مجموعة فرعية من العصبونات الحركية الفردية من قبل القيادة التعبير عن UAS-mCD8-GFP (الخضراء) مع السائق M12-GAL4. تقع أجسام الخلايا والتشعبات من هذه الخلايا العصبية في الحبل البطني العصب، في حين تتوقع بعض محاور عصبية لعضلات جدار الجسم عن طريق الأعصاب قطعي. (برنامج التشغيل هذا أيضا يدفع التعبير GFP في العضلات 12 لكل hemisegment اليرقات، والتي معا يمكن اعتبار المشارب الأمامي الخلفي على جانبي الحيوان). وسلط الضوء على المنطقة التي تضررت من سحق مع الخطوط المنقطة الزرقاء. شريط النطاق = 70 ميكرومتر. (C) عن قرب وجهات النظر من المحاور التالفة، 20 ساعة بعد الاصابة. اليسار: وشهدت محوار القريبة تنتشر ونمو جديدة. الحق: محور عصبي القاصي مجزأة، مع GFP القليل المتبقي، وذلك بسبب ولري الضمور وإزالة الحطام. شريط النطاق = 10 ميكرومتر (D) صور من سحق العصبية في وقت مبكر 3 اليرقات طور مرحلي الثالثة. نقاط السهم الأحمر إلى الحبل البطني العصب. موقع سحق هو نحو الجزء السفلي من الجزء 3، كما هو موضح في بروتوكول النص (بروتوكول 3). ونشرت الصور في D أصلا في J. بيول خلية 191، 211-223، دوى:. 10.1083 (2010) اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 4. الوقت الفاصل بين التصوير من النقل محور عصبي من الحويصلات متشابك ببتيدي المفعول. والفئران الببتيد الأذيني الناتريوتريك الموسومة ANF مع GFP، UAS GFP-ANF-21، وأعرب داخل العصبونات الحركية محددة باستخدام برنامج تشغيل عشية-RRA-GAL4 22. تصوير حي من الأعصاب قطعي يكشف عن النقل السريع للANF-GFP المسمى الحويصلات ببتيدي المفعول في محاور عصبية. انظر أيضا فيلم S1. (أ) إطارات واحدة من محاور العصبون الحركي من يعيش الوقت الفاصل بين التصوير. السهام الأخضر والأحمر والأزرق وتشير الأمثلة على تقدمي، حويصلات ثابتة وإلى الوراء، على التوالي. مقياس بار = 5 ميكرون. (A ') تم دمج الأطر الزمنية الفردية من الفيلم باستخدام يماغيج. (B) قد ولدت ولدت مخطاط التموج من الوقت الفاصل بين التصوير من النقل ANF-GFP، من مجموعة من الأطر واحدة تمتد من دقيقة واحدة وقت التصوير باستخدام 'متعددة مخطاط التموج' المكونات في ليماغيج 23. (C) الكمي لسرعات قطعي المتوسط، والتي تم حسابها من سفوح آثار مجزأة في kymographs. شريط أخضر حاضرانهاية الخبر تقدمي قطعي السرعة (ن = 543) وشريط أزرق يقدم الوراء سرعة قطعي (ن = 548) من الحويصلات من 10 kymographs. (D) الكمي لكثافة الجسيمات. وقد تم قياس كثافة الجسيمات من قبل عدد من تقدمي (كما هو موضح في شريط أخضر)، والجسيمات ثابتة (كما هو موضح في شريط أحمر) وإلى الوراء (كما هو موضح في الشريط الأزرق) لكل 100 ميكرومتر من طول محور عصبي من 10 kymographs. ونشرت البيانات في هذا الشكل أيضا سابقا في Ghannad-رضائي وآخرون، بلوس واحد 7 (1)، e29869، دوى: 0.1371/journal.pone.0029869 (2012).
الرقم 5. استخدام رقاقة اليرقة لجراحة الليزر والتصوير الكالسيوم.
ومقطوع والتغصنات من الخلايا العصبية الحسية الفئة الرابعة من قبل مع نبضات الليزر ذات الطاقة العالية من الأشعة فوق البنفسجية نابض صبغة الليزر. بروتوكولات لاستخدام هذا الأسلوب لجراحة يمكن العثور في أي مكان آخر 16. وتجميد فعالية في رقاقة يرقة يسمح للتغيرات السريعة في مستويات الكالسيوم داخل الخلايا لدراستها عن طريق التصوير الحي. في هذا المثال، أعرب عن المشفرة وراثيا GCaMP3.0 مؤشر الكالسيوم في الفئة الرابعة شجيري تشجر (C4da) الخلايا العصبية الحسية باستخدام برنامج تشغيل PPK-GAL4. كانت (A) وصور في الوقت الفاصل بين كثافة GCaMP3.0 كاذبة الملونة وفقا للون مقياس كثافة للإشارة إلى التغيرات في شدة مع مرور الوقت. تم استخراج إطارات فردية من فيلم مرور الزمن (فيلم S2) تصوير على المجهر متحد البؤر القرص الغزل في 5 لقطة / ثانية. (B) الكمي لديناميات الكالسيوم ردا على المجهرية الليزر. وقد تآمر التغيير أضعاف تطبيع سوما GCaMP3.0 كثافة مضان (ΔF/F0) من الخلايا العصبية الفردية ضد الزمن (ن = 7، كما هو موضح باللون الرمادي). كان ΔF/F0 متوسط ممثلة في البرتقال. وقد لوحظ زيادة ذروة كثافة GCaMP3.0 بين 1-2 ثوان بعد الجراحة. تم طرح الخلفية من G-CaMP3.0 الخام كثافة مضان. ونشرت البيانات في هذا الشكل أيضا سابقا في Ghannad-رضائي وآخرون، (2012) بلوس واحد 7 (1): e29869. دوى: 10.1371/journal.pone.0029869 12.
الرقم 6. محور عصبي التصوير تنتشر وانحطاط باستخدام رقاقة اليرقة. الصور متحد البؤر ممثل جدعة الداني (يسار) والجدعة البعيدة (يمين) من محاور العصبون الحركي octopaminergic في نقاط زمنية مختلفة بعد سحق العصبية. وقد أخذت صور في مواقع مماثلة كما هو مبين في الشكل 3C. وصفت هذه الخلايا العصبية من قبل القيادة تعبير عن التحوير UAS-mCD8-طلب تقديم العروض باستخدام TDC2-GAL4 24،25 السائق. الهيئات خلية لهذه الخلايا العصبية تقع في الحبل البطني العصب 24. ويمكن رؤية ثلاثة محاور الفردية داخل العصب قطعي واحد، ويتم حلها بسهولة عن بعضها البعض. هذا هو الوضع المثالي لدراسة الأحداث الخلوية الفردية، مثل تجزئة المحاور المنحطة، وهي كاملة في غضون 15 ساعة لهذه الخلايا العصبية. تم الحصول على الصور من الحيوانات الحية باستخدام رقاقة يرقة في 63X التكبير على المجهر متحد البؤر القرص الغزل. أشرطة النطاق = 10 ميكرومتر لوحات اليسار (جذوعها الداني) و 20 ميكرون لوحات اليمين (جذوعها البعيدة). اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 7. باستخدام يرقةرقاقة لتتبع البروتينات الفلورية photoconverted أكثر من مرة، ومسافات طويلة في الحيوانات الحية.
في هذا المثال، وهو بروتين الانصهار من البروتين الفلوري photoconvertible Dendra2 19، تنصهر لα-تويولين، يتم التعبير من التحوير UAS-Dendra2-α-تويولين في الفئة الرابعة تشجر شجيري (C4da) الخلايا العصبية الحسية، باستخدام برنامج تشغيل PPK-GAL4 26. (A) تخطيطي للتجربة photoconversion. تكمن الهيئات خلية من الخلايا العصبية C4da في محيط وتوسيع محاور عصبية من خلال الأعصاب قطعي لتشكيل المحطات متشابك في الحبل العصبية. تتعرض Dendra2-α-تويولين ضمن مجموعة فرعية من أجسام الخلايا في النصف الخلفي من الحيوان إلى photoconversion بواسطة الإضاءة فوق البنفسجية لمدة 6 ثانية باستخدام فلتر دابي القياسية مع الزئبق مصباح (الكرتون الأيسر). بعد مرة، ويمكن الكشف عن photoconverted Dendra2-α-تويولين في المحطات متشابك في الحبل البطني العصب. هذا يشير إلى أن البروتين تويولين تم ترانلبس على مسافة طويلة (من 1-2 مم ~). الصور مقياس شريط = 1 مم (B) مثال Dendra2-α-تويولين الحسية في جسم الخلية العصبية من الدرجة الرابعة قبل وبعد photoconversion. شريط النطاق = 5 ميكرون (C) مثل الصور من المحطات متشابك لفئة IV الخلايا العصبية الحسية في إما 0 ساعة أو 48 ساعة بعد photoconversion من أجسام الخلايا. مظهر معين من photoconverted Dendra2-α-تويولين في المحطات متشابك بعد الوقت يعني أن البروتين سافر من خلايا الجسم إلى محوار محطة. وقد أجريت Photoconversion والتصوير في كل نقطة زمنية في رقاقة اليرقة. مقياس بار = 15 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الفيلم S1. المجهرية الليزر والتصوير الكالسيوم من الخلايا العصبية C4da. تم استخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية نابض إلى القطع ومتزمتفرع شجيري آرى. transection الليزر التي يسببها زيادة سريعة في شدة GCaMP، التي بدأت في موقع الإصابة وسافر إلى خلايا الجسم. وأعرب UAS-18 GCaMP3.0 باستخدام C4da محددة سائق PPK-GAL4 26. كانت الأفلام كاذبة الملونة للدلالة على مستويات الكثافة النسبية للGCaMP3.0. أجري الوقت الفاصل بين التصوير مع القرص الغزل المجهري متحد البؤر في 5 لقطة / ثانية.
فيلم S2. النقل محور عصبي سريع من ANF-GFP في العصبونات الحركية.
وأعرب عن الفئران الببتيد الأذيني الناتريوتريك الموسومة ANF مع GFP، UAS GFP-ANF-21، داخل العصبونات الحركية محددة باستخدام برنامج تشغيل عشية-RRA-GAL4 22. تم تصوير نقل هذه الحويصلات ببتيدي المفعول داخل الأعصاب قطعي اليرقات على رقاقة يرقة في 300 ميللي ثانية / الإطار باستخدام المجهر متحد البؤر القرص الغزل.
Figure1 التكميلية (ملف DXF)
ملف DXF للسيليكون العفن تلفيق. تم تصميم الملف لالسلبية قناع مقاومة للضوء (قناع يودع الظلام لSU-8) على رقاقة السيليكون 4 بوصة. يحتوي الصف الثاني 5 قوالب لصنع رقائق اليرقة المستخدمة في هذا البروتوكول. كل من هذه الرقائق (في الصف 2) تحتوي على 5.4 ~ مم × 1.5 مم غرفة مصممة لتناسب مرحلة مبكرة 3 يرقة طور مرحلي الثالثة. الصف الأول (صف 1) يحتوي على غرفة أكبر (5.4 ملم ~ × 2 ملم)، في حين أن الصف الثالث (الصف 3) يحتوي على غرفة أصغر (~ 4.4MM 1.5mm س). هذه يمكن استخدامها مع يرقات أحجام أكبر وأصغر، على التوالي. شريط النطاق = 2 مم.
Discussion
صنع أو الحصول على رقاقة اليرقة:
يتكون رقاقة يرقة كتلة PDMS (يسمى 'رقاقة PDMS') تعلق على ساترة الزجاج. البروتوكول في الخطوة 1 يصف الإجراء لصنع واستخدام رقائق يرقة، على افتراض العفن SU-8 هو متاح. وmicrofabricated العفن SU-8 عن طريق الزخرفة photolithographically سميكة SU-8 طبقة مقاومة للضوء 140 ميكرون على رقاقة السيليكون (لمزيد من التفاصيل انظر Ghannad-رضائي وآخرون 12). كما التصنيع الدقيق من العفن SU-8 يتطلب الوصول إلى المعدات المتخصصة، نوصي تأمرها من منشأة التصنيع الدقيق (على سبيل المثال. مرفق LNF في جامعة ميشيغان 14)، أو من مسبك بإرسالهم تصميم رقاقة التي يتم توفيرها كملف التكميلية. إذا كان أحد يرغب في تغيير تصميم رقاقة PDMS (على سبيل المثال للاستخدام مع اليرقات من مختلف الأحجام)، وهو برنامج CAD الذي يعالج ملفات DXF (مثل أوتوكاد) يمكن استخدامها. وSU-يمكن أيضا أن تكون مصنوعة 8 العفن في المنزل باتباع إرشادات في موندال وآخرون قد تجد العديد من القراء 27 فإنه ملاءمة لمجرد الحصول على PDMS رقاقة عينة لمحاولة الخروج هذه التقنية قبل افتعال رقائق الخاصة بهم. وستتاح هذه متاحة بحرية عند الطلب.
استخدام ميكروفلويديك 'رقاقة اليرقة' للتصوير الحي:
طريقة الشلل في رقاقة يرقة يتجنب استخدام التخدير، وبدلا من ذلك ينطوي على الضغط، عبر تطبيق فراغ، لتقييد حركة الحيوان. بينما الحيوانات يمكن البقاء على قيد الحياة الشلل في رقاقة لساعات متعددة 12، وهي فترة أقصر الشلل (5-15 دقيقة) ويوصى. وهذا هو ما يكفي من الوقت لتصوير العديد من الأحداث الخلوية في المصالح، بما في ذلك التغيرات في الكالسيوم داخل الخلايا، أو نقل محور عصبي سريع. وهذا هو أيضا وقتا كافيا للتلاعب المطلوب في الحيوانات الحية، مثل ليزر مقرها المجهرية، photobleaching من وphotoconverسيون.
لدراسة الأحداث طوليا على مدى فترة زمنية أطول في حيوان واحد، ويمكن أن توضع الحيوانات في رقاقة وتصويرها عدة مرات، مفصولة فترات من الراحة. لوحات أجار عصير العنب هي مثالية للراحة بين جلسات التصوير، لأنها توفر مصدرا غذائيا سهلة والرطوبة. جلسات التصوير متعددة تفعل تؤثر على بقاء اليرقات إلى حد ما، لأن كل دورة يحمل بعض المخاطر بالنسبة لإتلاف الحيوان (انظر الجزء 2 في استكشاف الأخطاء وإصلاحها، أدناه). ولا يمكن تصوير الحيوانات بشكل روتيني> 5 مرات على مدى يومين مع معدل البقاء على قيد الحياة أكبر من 50٪. لأنه لا يتم تخدير الحيوانات، وأنهم يتمتعون بصحة جيدة ومتحركة على الفور بعد الافراج عن فراغ في رقاقة. هناك بالتالي حاجة لوقت الانتعاش بين جلسات التصوير، وبالتالي فإن التباعد الزمني بين الدورات مرنة ويمكن تعديلها لأهداف التجربة.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها:
التقنية الأكثر شيوعا هويقاضي مع رقاقة اليرقة والحلول الموصى بها ما يلي:
(1) هو الحيوان تتحرك كثيرا. الكثير من التنقل يمكن أن تتداخل مع الأهداف التصوير. الأسباب الأكثر شيوعا لهذا في رقاقة اليرقة هي) للحيوان صغير جدا لرقاقة، أو ب) للخطر الضغط فراغ تطبيقها خلال الخطوة الشلل. تم تصميم رقاقة يرقة الموصوفة في هذا البروتوكول للنظموا في وقت مبكر 3 اليرقات طور مرحلي الثالثة. الحجم الأمثل للحيوان هو 3.5-4 ملم في الطول (طول المحور الأمامي الخلفي). للتأكد من أن الضغط فراغ كاف، وسحب الحقنة 2-2.5 مل، أو حتى يشعر المقاومة في التعامل معها. واحد يدل على أن الفراغ هو العمل هو أن فقاعات صغيرة في محيط القناة يمكن أن ينظر إليها تتحرك ببطء نحو مصدر فراغ. مؤشر آخر هو أن ساترة يجب دائما مع رقاقة عندما يتم رفع شريحة من أعلى (وهذا هو الأسلوب المستحسن لنقل الغرفةبمجرد أن يتم وضع يرقات والفراغ هو على). الفراغ قد تتعرض للخطر إذا كان هناك تصدعات في أنابيب، أو إذا كان هناك النفط في الأنبوب. يمكن معالجة هذه الحالة بسهولة عن طريق استبدال 23 G الاستغناء طرف الإبرة وأنابيب البولي اثيلين-50 (من الخطوات 1،6-1،14).
(2) يموت الحيوان بعد التصوير في رقاقة. ويهدف هذا الإجراء إلى الحد الأدنى من الإجهاد يتسبب على الحيوان، والحيوانات البرية من نوع النمط الجيني لديهم معدل البقاء على قيد الحياة> 90٪، حتى بعد ساعة من الشلل على رقاقة 12. منذ بعض التراكيب الوراثية قد تكون أقل قدرة على التكيف مع الإجهاد في رقاقة، أولا التحقق من هذا النوع من الحيوانات البرية (على سبيل المثال، كانتون S) البقاء على قيد الحياة تقنية الشلل. أ) إن السبب الأكثر شيوعا لتحديد المواقع الفتك هو غير صحيح من يرقة (انظر الأرقام 2G-H). إذا أجزاء من بشرة، الرأس أو القصبة الهوائية ليست بالكامل داخل الغرفة، ثم أنها يمكن أن تتلف خلال الشلل، واليرقة التي هي كبيرة جدا لرقاقة (> 4 مم) هو أقل عرضة للبقاء على قيد الحياة. ب) سبب أقل شيوعا للفتك هو استخدام الكثير من الضغط أو الفراغ عند تحميل رقاقة. عند وضعه بشكل صحيح في الشريحة، والضغط المتولدة عن الفراغ هو جيد التحمل. ولكن الضغط المفرط، إما من فراغ أو في المرحلة الأولية لتحديد المواقع الحيوان يمكن أن يكون مسألة. فمن الأفضل لمعرفة مدى الضغط اللازم تجريبيا عن طريق التجارب مع نوع البرية يرقات الحجم الصحيح. ج) إذا كان يغطي الكثير من النفط الهالوكربون القصبة الهوائية الحيوان الحيوان قد يحتمل أن تكون القضايا مع البقاء على المدى الطويل. النفط يلعب عدة أدوار مهمة في رقاقة: من المهم لخلق الفراغ، والبصريات أثناء التصوير، وأنه يصد جفاف في رقاقة. وينبغي تجنب النفط لكن المفرط. (وهذا يمكن أن يؤدي أيضا إلى النفط في الأنابيب والمحاقن، والمساس الفراغ). المعاطف بروتوكول اقترح فقط الجانب البطنية من يرقة مع النفط، ثم removes النفط الزائد عن طريق وضع اليرقة على ساترة نظيفة قبل أن ينتقل إلى ساترة النهائي للتصوير. د) يمكن أن يكونوا من ذوي الخبرة الضيائية من الدورة التصوير. كما هو الحال مع أي تطبيق التصوير الحي، وهو مثالي للاستخدام مرات التعرض القصير مع انخفاض شدة ضوء الليزر، والذي هو أفضل تحقيق ذلك باستخدام كاميرا حساسة للغاية أو كاشف. محاولة تقليل الإضاءة مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية، بما في ذلك الضوء واسعة الطيف التي أنشأتها مصادر الزئبق ضوء.
قضايا أخرى والاتجاهات المستقبلية:
لأن هذا الأسلوب لا يستخدم التخدير، لا يزال قلب الحيوان للفوز. هذا يخلق بعض التنقل لا مفر منه، مما يؤثر التصوير في بعض المواقع أكثر من غيرهم. توضح الأمثلة هنا أن الحبل البطني العصب والأعصاب قطعي، وجدار الجسم يمكن تصويرها بسهولة دون تدخل من ضربات القلب. في الحالات التي يؤثر على ضربات القلب والتصوير، والحركات العادية يمكن في بعض الأحيان أن تصحح لمعفي برامج التحليل (على سبيل المثال، تثبيت الصورة المساعد ليماغيج). هذا يعمل بشكل جيد عندما تتحرك الأجسام الفردية على نطاق ووقت سريع (على سبيل المثال ~ 1 ميكرون / ثانية لنقل محور عصبي سريع) أو على نطاق الوقت بطيئا جدا (دقائق إلى ساعة). ومع ذلك، عند الكائن (ق) من الخطوة الفائدة مع مجموعة من السرعات والاتجاهات، ويمكن أن يكون من الصعب تصحيح لضربات القلب التي يسببها الحركات.
قضية أخرى هي تقلب طفيف في البصريات من الحيوان الى الحيوان، أو بين جلسات التصوير متعددة من نفس الحيوان في رقاقة. أعمق موضع اهتمام ضمن الحيوانية، وزيادة هذا الاختلاف سيكون. الأعصاب قطعي والحبل البطني العصب عادة ما تكون عميقة جدا داخل ثم الحيوان المراد تصويره على المجهر العادي. ولكن ضغط خفيف من ذوي الخبرة في رقاقة يرقة يدفع هذه الهياكل قريبة جدا للبشرة وساترة. فإن المسافة بالضبط من هذه الهياكل من ساترة لديها اختلافات صغيرة من TRالاتحاد العالمي للتعليم للمحاكمة. الاختلاف لكائنات إغلاق بشرة، مثل الهيئات خلية من الخلايا العصبية الحسية، هو أقل من ذلك. ولذلك فمن المهم، ولا سيما لجعل قياسات كثافة، للاستفادة من عدد كبير من الحيوانات والتجارب المستقلة لحساب التغير في البصريات.
في حين ركزت الأمثلة المعروضة هنا على العمليات داخل الخلايا العصبية، وينبغي أن يكون النهج قابلة للتصوير في أي هيكل الحيوان الذي لا يمكن أن تتحقق داخل العمق مع التركيز على الهدف المجهر. وهذا يشمل بشرة، عضلات جدار الجسم، ولل NMJs بهم. القصبة الهوائية على الجانب البطني للحيوان وربما أجزاء من الجهاز الهضمي ويمكن أيضا تصويرها. ويمكن أيضا وضع الحيوان مع الجانب الظهري تجاه ساترة للتصوير على المدى القصير من الهياكل بالقرب من السطح الظهري. القدرة على هياكل صورة عميقة داخل الحيوان محدودة بسبب المسافة عمل الهدف المجهر المستخدمة. هياكل مثل ايمأقراص aginal لا يمكن الوصول إليها لتضخم عالية (على سبيل المثال 40X) الأهداف.
تم تصميم رقائق يرقة الموصوفة في هذا البروتوكول لليرقات في وقت مبكر 3 المرحلة الثالثة الطور (تتراوح في حجمها 3،5-4 ملم). ولكن العديد من الأسئلة المثيرة للاهتمام تتطلب التصوير في مراحل اليرقات مختلفة. رقائق أصغر لاستيعاب 2 الثانية الطور اليرقات، أو رقائق أكبر لاستيعاب أواخر الطور الثالث 3 ويمكن تصميم بسهولة باستخدام نفس المبدأ. (يحتوي على الشكل التكميلية 1 ملف DXF تعديل بسهولة لصنع قوالب السيليكون مع أحجام غرفة المتغيرة). بل يمكن تطبيق مبدأ بسيط الختم عكسها للكائنات أخرى مثل C. ايليجانس أو الزرد، مع المتغير الرئيسي هو حجم الغرفة. وثمة اتجاه المستقبل هو مفيد لتصميم رقاقة يمكن أن شل العديد من الحيوانات في وقت واحد، لاستخدامها لأغراض الفحص. ومع ذلك، لهذا، فإن التصميم يجب أن يكون مختلفا بشكل ملحوظمن الجهاز الحالي، حيث القضايا لتحديد المواقع الحيوان في رقاقة يحتاج إلى أن تعالج بشكل مستقل لكل حيوان.
سحق فحص الأعصاب لدراسة الاستجابات إصابة في الأعصاب الطرفية اليرقات:
مقايسة سحق العصبية وصفها هنا للأعصاب قطعي اليرقات هي طريقة بسيطة لإدخال اصابة في المحاور الطرفية في ذبابة الفاكهة. مزايا هذه الطريقة ما يلي: أ) أنها بسيطة للقيام مع الأدوات القياسية وجدت في مختبر ذبابة الفاكهة (أ stereomicroscope CO 2 المصدر وملقط)؛ ب) ويمكن إجراء ذلك بسرعة لكثير من الحيوانات، مما يجعل تحليل الكيمياء الحيوية من الحبال العصبية بعد الإصابة 14 ممكنا؛ ج) الاستجابات الجزيئية والخلوية لهذه الاصابة هي تكرار للغاية 14،15،28، ويمكن استخدامها لاكتشاف العمليات التي تعتبر مهمة أيضا في الخلايا العصبية الفقاريات 29،30.
الطرق البديلة لاصابة الخلايا العصبية هو focuسا ليزر عالية الطاقة، على سبيل المثال للأشعة فوق البنفسجية أو نابض ليزر الفيمتو ثانية، بقطع محور عصبي عبر الليزر المجهرية 17،31-33. رقاقة اليرقة هو الأسلوب الأمثل لتحديد المواقع الحيوان لمثل هذه المجهرية. ومع ذلك، وذلك بسبب الاختلافات الطفيفة في البصريات بين التجارب، التي نوقشت أعلاه، يمكن أن الأسلوب القائم على الليزر يكون أكثر صعوبة لإعادة إنتاج اليرقات في، وبخاصة في الأعصاب قطعي اليرقات. أيضا، ليزر مقرها إصابة محور عصبي يتطلب المزيد من الوقت لوضع كل حيوان، وبالتالي هو أكثر صعوبة لإجراء على نطاق واسع (مع وجود عدد كبير من الحيوانات).
استكشاف الأخطاء وإصلاحها:
قضية التقنية واجه الأكثر شيوعا من سحق العصب هو الموت من الأضرار التي لحقت الأجهزة الداخلية. عند إجراء سحق، فمن المهم ألا قرصة الحبل البطني العصب، والغدد اللعابية، أو الأمعاء. من المهم أيضا عدم ثقب بشرة. من الأفضل تجنب هذه القضايا من خلال جلب ملقط في زاوية 45 درجة إلى السطحية بشرةه (انظر الشكل 3).
نوعية ملقط لديه تأثير كبير على فعالية سحق والبقاء على قيد الحياة بعد ذلك. نوصي Dumostar عدد 5 ملقط. للاحتفاظ الحدة، ويجب التعامل مع ملقط الرعاية، لا تستخدم لأغراض أخرى، واستبدالها بمجرد أن تصبح حادة أو عازمة.
يمكن أن حجم الحيوان أيضا التأثير على فعالية سحق. الحيوانات الصغيرة (أقل من 3 ملم في الطول) هي أقل بكثير من المرجح أن تنجو من الاصابة. مع الحيوانات الكبيرة، (3 تجول الطور الثالث)، هو أكثر صعوبة لتحديد موقع الأعصاب وتجنب الأضرار التي لحقت الغدد اللعابية أكبر والأمعاء، وهناك متسع من الوقت لدراسة استجابات أقل إصابة قبل التشرنق. ويجري سحق العصب الأكثر فعالية في وقت مبكر 3 اليرقات طور مرحلي الثالثة (والتي هي 3-4.5 ~ ملم في الطول على طول المحور الأمامي الخلفي).
مصدر الغذاء الذي يظهر على الحيوان قد تؤثر علىقوة بشرة والبقاء على قيد الحياة بعد سحق. فمن المستحسن لرفع الحيوانات في المواد الغذائية المصنوعة من معيار صفة الخميرة الجلوكوز.
أفضل طريقة لتعلم كيفية القيام سحق فعال هو ممارسة على العديد من الحيوانات، أولا مع الهدف الأساسي لتحقيق بقاء (وليس التشرنق) 24 ساعة بعد سحق. مبتدئين وعادة ما يكون معدل البقاء على قيد الحياة منخفض (على سبيل المثال 10٪)، ولكن مرة واحدة وعلم وتقنية، يمكن أن تصل معدلات البقاء على قيد الحياة ~ 90٪.
قضايا أخرى والاتجاهات المستقبلية:
يوفر الفحص سحق وسيلة قوية لدراسة تبرعم محوار الأقرب إلى موقع الإصابة وانحطاط محاور ونقاط الاشتباك العصبي القاصي إلى موقع الإصابة. في حين أن معدلات انحطاط تختلف بين أنواع الخلايا العصبية المختلفة، فهي تكرار للغاية داخل الخلايا العصبية نوع معين، وتوفير دليل على استنساخ لفحص الاصابة.
في المقابل، فإن "التجدد" تنتشراستجابة لوحظ في المحاور الداني هو أكثر تحديا للدراسة. جميع محاور عصبية في العصب قطعي بدء اسعة تنتشر على مقربة من موقع الإصابة (على سبيل المثال، انظر الشكل 6 والشكل 3). ولكن مدى تنتشر يمكن أن تختلف من الخلايا العصبية إلى الخلايا العصبية، ويصعب قياسها كميا. ويمكن ملاحظة درجة مماثلة وتقلبه في تبرعم بعد الآفات البؤرية أكثر من واحد في العصبونات الحركية الأعصاب قطعي قدم باستخدام الأشعة فوق البنفسجية نابض صبغة الليزر. لنا أن نفسر أن يكون الاتجاه nondiscriminate للتبرعم ويرجع ذلك إلى عدم وجود اشارات التوجيه في الأعصاب قطعي. في المقابل، الخلايا العصبية الحسية المحاور أصيب الليزر بالقرب من أجسام الخلايا الخاصة بهم الخضوع لنمو محور عصبي جديد في نفس اتجاه محور عصبي خسر 34. محاور في هذه المنطقة من الحيوان الممكن أن يتعرضوا لمزيد من المعلومات الموضعية محددة لتوجيه محاور تجديد. البيئة داخل الأعصاب قطعي غير المرجح أن يكون الكثير resemblanCE للبيئة أن محاور أبحر أصلا خلال توجيهاتهم في الجنين، وبالتالي ليس من المتوقع الحصول على معلومات لتوجيه محاور تجديد.
قيود أخرى لدراسة تجديد باستخدام قطعي سحق العصبية مقايسة هو أن المصاب محاور عصبية حسية والعصبون الحركي لا تزال لديها مسافة كبيرة لتغطية (0.25-1 ملم) للوصول إلى هدفهم، وإطار زمني محدود (<3 أيام) قبل يمر بها الحيوان التشرنق. وقد حددت دراسة حديثة التلاعب الجيني للمستقبلات هرمون prothoraciotropic التي يتضاعف ثلاث مرات مدة المرحلة 3 اليرقات طور مرحلي الثالثة 35. وهذا التلاعب تمديد الإطار الزمني لدراسة الانتعاش وتنكس الخلايا العصبية بعد الإصابة بشكل ملحوظ، إلى 9 بدلا من 3 أيام. قد يكون هذا لفترة كافية لمراقبة الأحداث الجديدة، مثل إعادة ربط محور عصبي المصابين هدفه بعد المشبكي، وخاصة إذا هو فعل إصابة مقربة من نهاية متشابك.
Disclosures
الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية، (منحة رقم 0842701 لIOS-CAC)، والمعهد الوطني للصحة (R00MH080599 لBY، R21 NS062313 إلى NC، وNS069844 إلى CAC). نود أن نعترف جيمس شوت، إميلي هان، ويني ترونج للدعم التقني، ومركز الأسهم بلومنجتون لخطوط الطيران. ملفقة جميع رقائق في مرفق Nanofabrication لوري في جامعة ميشيغان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Polyethylene tubing | Fisher Scientific | 14-170-11B | Polyethylene tubing, I.D. = 0.023 in O.D. = 0.038 in |
| 1 mm Polyurethane tubing | Fisher Scientific | BB521-63 | Polyurethane tubing, I.D. = 0.063 in O.D. = 0.125 in |
| Barb to barb connector | Bio Rad | 732-8300 | 0.8 mm barb to barb connector |
| 3-way Stopcock valve | Bio Rad | 732-8104 | Screw on valve for the syringe |
| Syringe (20 ml) | Fisher Scientific | 14-817-33 | Screw on 20 ml syringe for generating vacuum |
| Dispensing needles, 23 G (0.4 mm I.D., 0.6 mm O.D.) | McMaster-Carr | 75165A684 | Needle for outlet connection |
| Dispensing needles, 21 G, (0.6 mm I.D., 0.8 mm O.D.) | McMaster-Carr | 75165A679 | Needle for outlet connection |
| Halocarbon oil | Sigma | H8898 | Halocarbon oil 700 |
| Dumostar Number 5 Forceps | Roboz | RS-498 | For nerve crush |
| PDMS Kit (Base and curing agent) | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant 0.5 kg Kit Clear |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-544-C | 24 mm x 40 mm (thickness according to recommendation for your microscope objective) |
| Disposable Plastic Cup (9 oz) | |||
| Plastic coffee stirrer stick | |||
| Razor Blade | |||
| Grape juice agar plates | See http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925 for recipe |
References
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Gunawardena, S., et al. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
- Miller, K. E., et al. Direct observation demonstrates that Liprin-alpha is required for trafficking of synaptic vesicles. Curr. Biol. 15, 684-689 (2005).
- Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22, 719-729 (1999).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nat. Neurosci. 11, 659-666 (2008).
- Fuentes-Medel, Y., et al. Glia and muscle sculpt neuromuscular arbors by engulfing destabilized synaptic boutons and shed presynaptic debris. PLoS Biol. 7, (2009).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. , Cold Spring Harb. Protoc. 476-480 (2012).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108, 434-446 (2008).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. J. Physiol. 558, 489-502 (2004).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12, 372-385 (2011).
- Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. Microfluidic chips for in vivo imaging of cellular responses to neural injury in Drosophila larvae. PloS one. 7, (2012).
- Schmid, A., Sigrist, S. J. Analysis of neuromuscular junctions: histology and in vivo imaging. Methods Mol. Biol. 420, 239-251 (2008).
- Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
- Xiong, X., Collins, C. A. A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade. J. Neurosci. 32, 610-615 (2012).
- Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo Laser Axotomy in C. elegans. J. Vis. Exp. (51), (2011).
- Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans. J. Vis. Exp. (57), (2011).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2. 2, 2024-2032 (2007).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).
- Rao, S., Lang, C., Levitan, E. S., Deitcher, D. L. Visualization of neuropeptide expression, transport, and exocytosis in Drosophila melanogaster. J. Neurobiol. 49, 159-172 (2001).
- Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130, 5385-5400 (2003).
- Rietdorf, J., Steitz, A., Heidelberg, E. Linear unmixing macro for ImageJ. European Advanced Light Microscopy Network. , (2004).
- Koon, A. C., et al. Autoregulatory and paracrine control of synaptic and behavioral plasticity by octopaminergic signaling. Nat. Neurosci. 14, 190-199 (2011).
- Yarali, A., Gerber, B. A Neurogenetic Dissociation between Punishment-, Reward-, and Relief-Learning in Drosophila. Front. Behav. Neurosci. 4, (2010).
- Kuo, C. T., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Dendrite-specific remodeling of Drosophila sensory neurons requires matrix metalloproteases, ubiquitin-proteasome, and ecdysone signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15230-15235 (2005).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- Xiong, X., et al. The highwire ubiquitin ligase promotes axonal degeneration by tuning levels of nmnat protein. PLoS Biol. 10, (2012).
- Shin, J. E., et al. Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration. Neuron. 74, 1015-1022 (2012).
- Watkins, T. A., et al. DLK initiates a transcriptional program that couples apoptotic and regenerative responses to axonal injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 4039-4044 (2013).
- Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway. Science. 323, 802-806 (2009).
- Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).
- O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (24), (2009).
- Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Mol. Biol. Cell. 21, 767-777 (2010).
- Miller, D. L., Ballard, S. L., Ganetzky, B. Analysis of synaptic growth and function in Drosophila with an extended larval stage. J. Neurosci. 32, 13776-13786 (2012).
