Summary
초파리 애벌레는 그들의 반투명 표피와 강력한 유전학 라이브 영상을위한 매력적인 모델 시스템이다. 이 프로토콜은 3 차 령 초파리 유충의 신경 세포 내에서 세포 프로세스의 실시간 이미징을위한 '유충 칩'이라는 단일 층 PDMS 장치를 활용하는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
라이브 영상은 그러나이 살아있는 동물에 도전 할 수있는, 세포 생물학적 과정을 연구하기위한 중요한 기술이다. 초파리 유충의 반투명 표피는 라이브 영상 연구를위한 매력적인 모델 생물한다. 그러나 라이브 영상 기술을위한 중요한 과제는 비 침습적으로 고정화하고 현미경에 동물을 배치하는 것입니다. 이 프로토콜은 폴리 디메틸 실록산 우리가 '유충 칩을'호출 (PDMS) 마이크로 유체 장치에 초파리 유충을 고정 및 이미징을위한 간단하고 사용하기 쉬운 방법을 제공합니다. 유충 칩은 주사기를 통해 진공의 응용 프로그램에, 동물을 움직이게하고 신경 코드, 분절 신경과 몸으로 복부 구조를 제공, 얇은 유리 커버 슬립에 부착되어 아늑한 맞는 PDMS의 microchamber으로 구성되어 있습니다 커버 슬립에 가까운 거리에 벽의 근육. 이것은 고해상도 이미징을 허용하고, 중요한 ANE의 사용을 피한다생리적 과정의 광범위한 연구를 용이 sthetics 가꾸. 유충 고정화로부터 쉽게 회복 때문에, 그들은 좀처럼 체류 촬상 세션을 실시 할 수있다. 이 시간까지 일에 이르기까지 시간 과정을 통해 종 방향 연구 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 단계별 칩과 방법을 3 차 령 유충의 신경 이벤트의 라이브 영상을위한 칩을 활용하는 방법을 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 이러한 이벤트는 축삭 손상에 칼슘 응답 및 긴 거리와 시간 규모에 광 변환 단백질의 매매 시간 경과 연구에서 세포 내 소기관의 빠른 전송을 포함한다. 칩의 또 다른 응용 프로그램이 재생 축삭 손상에 퇴행성 반응을 연구하는 것입니다, 그래서이 프로토콜의 두 번째 부분은 분절 신경 호감에 의해 말초 신경 내의 축삭 손상에 대한 새로운 간단한 절차를 설명합니다.
Introduction
과일 파리, 초파리 melanogaster의는, 100 년 이상을위한 모델 생물로 활용하고 있으며, 기본 신호 및 무척추 동물에서 인간으로 보존되어 발달 경로를 정의하는 수단이 입증되었습니다. 특정 세포 유형에 찬란 태그 단백질을 표현하는 수 많은 유전 적 도구가 특히 있기 때문에, 라이브 영상은 세포 메커니즘을 연구에 중요한 접근 방법, 그리고 간단한 몸 계획과 초파리 유충의 반투명 표피는 라이브 영상을위한 매력적인 시스템이 있습니다.
라이브 영상 기술의 중요한 과제는 비 침습적으로 고정화 및 현미경 동물을 배치하는 것입니다. 기존의 고정화 방법은 동물을 죽이고 둘, 해부, 2 또는 클로로포름의 사용을 포함한다. 마취제는 에테르 (4)과 이소 플루오 란 5-8도 사용되어왔다. 마취제는 많은 장점을 제공하지만, 그들은 또한 따라서 연구 과정에 영향을 동물에 스트레스를 만들 수 있습니다, 신경 활동과 (하트 비트 포함) 중요한 생리 9-11 억제한다. 에테르, 이소 플루오 란 작업을위한 인간의 안전에 대한 우려도 있습니다.
우리는 우리가 '유충 칩'(12)를 호출 한 층 PDMS 마이크로 유체 장치에 초파리 애벌레를 고정화 할 수있는 약 자유로운 방법을 개발했습니다. 이 프로토콜은 구하거나 유충 칩을 만드는 방법을 설명하고, 조기 개최 3 차 령 유충의 라이브 영상에 활용하는 방법에 대해 설명합니다. 이 칩은 주사기를 통해 진공의 응용 프로그램에, 부드러운 기계적 힘을 통해 동물을 고정화, 아늑한 맞는 microchamber,로 구성되어 있습니다. 고정화 방법은 유리 커버 슬립에 가까운 거리에 신경 코드, 분절 신경 및 신체 벽 근육, 복부와 같은 구조를 제공합니다. 이것은 높은 수치 APER와 같은 구조의 고해상도 영상을 허용진짜야 (고배율) 목표.
(I) 유충 칩의 사용이 unanesthetized 동물의 생체 내 이미징을 허용, 화학 물질의 사용을 대체 기존의 다른 기술을 통해 유충 칩의 장점은 다음과 같습니다. (II)의 유충은 즉시 (이소 플루오 란 8,13에 대한 2 시간의 회복 기간에 대비하여) 칩에서 출시 후 복구 할 수 있습니다. 이것은 시간과 일, 밀리 초에서 분에 이르기까지 다양한 시간 규모, 이상 이미징 할 수 있습니다. (ⅲ) 가스 투과 재료 인 PDMS,의 사용은 유충 본체로 환경에서 산소 / 공기의 연속 확산 가능. (iv) 칩은 사용하기 쉽고 안전한, 그리고 (v)는 재사용 가능하며, 최소한의 비용으로 제조 할 수있다.
유충 칩을 사용에 대한 지침뿐만 아니라,이 프로토콜은 3 차 령 유충의 신경 세포 사건을 연구하는 그것의 사용의 몇 가지 예를 제공 할 것입니다. 이들은 axona의 라이브 영상을 포함L 전송, 부상으로 칼슘 응답 및 긴 거리와 시간 규모에 광 변환 단백질의 매매 시간 경과 연구.
칩의 또 다른 응용 프로그램은 축삭 손상에 대한 신경 세포의 반응을 연구하는 것입니다. 이를 위해 추가 절차는 분절 신경 호감에 의해 말초 신경 내의 축삭 손상에 대해 (제 3의) 설명되어 있습니다. 이 간단한 분석은 동시에 처리 될 많은 동물을 허용 표준 해부 실체 현미경 하에서 모두 신속하고 재현 가능하게 수행 될 수있다. 부상에 대한 세포 반응은 유충 칩의 라이브 영상으로 공부하실 수 있습니다.
Protocol
1. PDMS 칩 만들기
SU-8 몰드에서 PDMS 칩을 만들려면 단계 1.1-1.7를 따릅니다. 칩에 손이지만, 사용을위한 조립해야하는 경우, 1.8 단계로 이동합니다.
- PDMS 기반의 45g과 작은 일회용 플라스틱 용기에 PDMS 키트에서 에이전트 (10시 1분 비율) 경화 4.5 g을 혼합하고 철저 플라스틱 볶음 스틱을 사용하여 혼합.
- 모든 거품을 제거하기 위해 10 분 동안 진공 용기 (예를 들면 데시 케이 터)에 컨테이너를 배치합니다.
- 직경의 플라스틱 접시에 150 ㎜의 아래쪽에있는 SU-8 몰드를 삽입하고 천천히 금형에 PDMS 혼합물을 부어. PDMS를 붓는 동안 기포가 발생하지 않도록주의하라.
- 4 시간 동안 650 ° C의 오븐 (또는 인큐베이터)에 PDMS를 치료.
- 오븐에서 경화 PDMS/SU-8 곰팡이를 제거하고 몇 분 동안 냉각 할 수 있습니다.
- 면도날을 사용하여, SU-8 몰드의 가장자리를 따라 경화 된 PDMS 잘라 SU-8 몰드에서 분리.
- PDMS의 슬래브를 분할면도날을 사용하여 개개의 칩으로 PDMS.
- 21 G 분배 바늘을 사용하여, PDMS 칩 (도 1a에 도시 된)의 진공 포트에 구멍을 찌를.
- 23 G 분배 바늘을 가지고 바늘이 잠금 허브에서 밀고 휴식의 기지에서 몇 번 바늘 끝을 트위스트.
- 튜브 바늘의 적어도 밀리미터를 덮도록 폴리에틸렌 튜브의 작은 조각에 23 G 바늘 끝을 삽입합니다. 그리곤 바늘의 여분의 튜브를 잘라 면도날을 사용합니다. 이 진공 흡기 포트에 삽입 할 때 인감을 만듭니다 바늘의 한쪽 끝의 주위에 플라스틱 링을 만듭니다.
- 거꾸로 현미경 (그림 1B와 2A-B)와 함께 사용 : 진공 포트의 구멍에 23 G 바늘 끝을 삽입합니다. 직립 현미경 (그림 1C 및 2C-D)와 함께 사용할 경우 : 21 G의 dispe와 PDMS 칩의 측면에 두 번째 구멍을 찌를바늘을 nsing,이 구멍은 측면에서 첫 번째 구멍에 대한 액세스를 제공합니다. 그런 측면 구멍에 튜브 링 23 G 바늘 끝을 삽입합니다. 상단 구멍 (그림 1C)를 밀봉하는 PDMS 칩의 맨 위에 양면 테이프의 조각을 놓습니다.
- 길이 약 20 cm입니다 폴리에틸렌 배관의 조각을 가져 가라. 진공 포트에 삽입 된 니들 팁을 튜브의 한 쪽을 연결한다.
- (재료의 목록에서 '3 웨이 스톱 콕을 참조) 3 - 웨이 밸브의 포트 중 하나에 튜브의 다른 쪽을 연결
- 나머지 두 개의 포트 중 하나에 20 ML의 주사기를 연결합니다. 마지막 포트는 환경에 열려 있습니다.
2. 라이브 영상의 유충 칩을 사용하여
- 투명 접착 테이프로 PDMS 칩을 청소합니다. 칩의 바닥에 테이프의 조각을 연결합니다. 테이프가 전체 PDMS 표면을 손으로 만져되어 있는지 확인하고 테이프를 벗겨.
- 확인이 만드는 위의 2 단계 - 반복 배PDMS 칩의 표면에 (이전의 실험에서 유지)에는 입자 또는 오일이 없습니다. PDMS 칩 재사용하기 때문에, 그것이 유리에 PDMS의 접착력에 영향을 불충분 밀봉 초래할 수 있으므로 오일 잔류 물을 제거하는 것이 매우 중요하다.
- 물이 들어있는 페트리 접시에 3 차 령 유충을 조기 (즉 꼴)를 전송합니다. (꼴 3 차 령 단계 유충은 오히려 문화 유리 병의 측면보다, 음식에). 배지를 제거하기 위해 물에 유충 목욕.
- 깨끗한 유리 커버 슬립을 가지고 그 중심에 할로 카본 700 기름의 작은 방울을 배치합니다.
- 집게를 사용하여 부드럽게 집어 깨끗하고 (유충의 길이가 ~ 3.5-4 mm이어야 함) 물에서 3 차 령 유충을 조기 개최. 과잉의 물을 제거하고 기름 하락에 배치하는 경량 닦아 또는 종이 수건에 간략하게 동물을 놓습니다. 드롭은 충분히 작은 애벌레의 기관이 코팅되지 않은 것이어야한다. 유충 역에게하자10 초 동안 기름 하락에 y를 입력합니다.
- 오일 드롭 유충을 제거하고 깨끗한 유리 커버 슬립에 놓습니다.
- 다른 깨끗한 유리 커버 슬립에 유충을 전송합니다. 이 단계는 여분의 기름을 제거합니다.
- 유충 방향에주의를 기울이십시오. 신경 코드와 분절 신경 이미징의 경우, 유충의 복부 측면은 커버 슬립에 앉아 있어야합니다. 세로 두 기관 튜브 특징은 몸 윗면이 위쪽을 향해야합니다. 참고 :이 유충 자연스럽게 선호하는 방향이다.
- 부드럽게 애벌레 위에 PDMS 칩을 놓습니다. 유충은 진공 포트 지향의 꼬리, microchamber의 중심 가운데로 정렬되어야합니다. 유충은 실의 가장자리에 닿지 않도록주의하십시오. 이는 전방과 후방 기관 단자에 특히 중요합니다. 참고 :이 단계는 가장 좋은 실체 현미경을 수행합니다.
- 좋은 밀봉을 위해 유리 coverslip에 대한 PDMS 칩을 밀어 넣습니다. 유충이 완전히 있는지 확인PDMS 칩은 유리 coverslip에 닿는 microchamber으로 둘러싸인.
- 주사기 진공을 만들 수 (튜브를 통해) PDMS의 microchamber에서 공기를 그릴 수 있도록에서 3 방향 밸브를 전환합니다.
- 한 손으로 단단히 PDMS 칩 / 유리 커버 슬립을 개최합니다. 주사기 플런저를 잡아 다른 손을 사용합니다. 저항이 진공을 만들려면 주사기 손잡이에 느껴질 때까지, 공기의 2 ~ 2.5 ㎖를 철회. 진공 PDMS 칩, 기름, 및 커버 슬립 인터페이스 단단히 밀착 생산 및 유충의 이동성을 제한합니다.
- PDMS 칩은 주사기에서 환경으로부터 격리되도록 오프 밸브를 전환합니다. 결과적으로, 비교적 안정된 진공도는 주사기 플런저를 유지하기위한 필요없이 microchamber 유지된다.
- 전체 동물의 몸 microchamber 내부에 배치하고, 동물이 움직일 수 있다는 것을 확인하기 위해 입체경에서 유충을 확인합니다. 기관은 볼 수 있어야합니다. 나머지PDMS 칩은 커버 슬립과 접촉해야한다. 참고 : 올바르게 칩에 고정 동물의 예는도 2E 및 2 층을 참조하십시오. 일부 잘못된 방향은 그림 2G 하반기에 표시됩니다.
- 현미경의 유충 칩 (PDMS 칩 + 유리 커버 슬립)를 놓습니다. 유충 칩, 튜브 및 주사기의 coverslip에서 PDMS 칩의 분리를 방지하기 위해주의 깊게 취급해야한다. 직립 현미경의 경우, 양면 테이프 (그림 1C)로 현미경 단계로 칩의 '최고'면을 고정합니다.
- 그 동물의 구조 (들)을 찾아 영상을 수행하는 고배율 목적 (석유 침수, 40-63X 권장)를 사용합니다. 어떤 경우에는, 낮은 배율이 고배율로 전환하기 전에 이미징 원하는 영역을 식별하기 위해 필요할 수있다.
- 촬상이 완료되면 위치 전환 밸브에 의해 진공을 해제즉, 환경에 열려 있습니다.
- 커버 슬립의 PDMS 칩을 분리합니다. 유충은 즉시 운동성이 있어야한다.
- microchamber에서 유충을 제거하고 부드럽게 복구를위한 포도 주스 한천 플레이트에 유충을 배치 집게를 사용합니다.
3. 애벌레 부위 별 신경에 신경 압박 손상을 유도
- 분리하기 위해 위의 단계 2.3에 따라 조기 원하는 유전자형의 3 차 령 애벌레를 개최. 단계 2.3에서 설명한 바와 같이 음식을 제거하기 위해 물에 유충 목욕.
- CO와 함께, 표준 비행 CO 2 마취 스테이션을 사용하여 2 패드는 애벌레를 정복하기 위해 해부 실체 현미경을 유지했다. 유충은 1 ~ 2 분 동안 CO 2 패드에 배치 한 후 immotile 될 것이다.
- 이제 실체 현미경을 이용하여 포도 주스 한천 플레이트에 하나의 마취 유충을 배치합니다. 복부 신경 코드를 시각화하고 (표피를 통해 신경 분절까지 동물의 복부 측면을 돌려
- Dumostar 수 - 5 집게를 사용하여 단단하게 5 ~ 10 초 동안 표피를 통해 분절 신경을 꼬집어. 이것이 제대로되면 표피는 그대로 유지하고 체벽는 관통되지 않는다. 참고 : 부상, 전후방 몸의 축을 따라 서로 다른 위치에서 수행 할 수는 한 복부 신경 코드, 침샘, 창자 등의 손상되지 않습니다. 도 3d에 도시 된 바와 같이 가장 효과적인 부상 위치는 3 차 복부 세그먼트의 끝 부분이다. 이 위치에 손상을 가장 신경의 손상과 동물을 죽이지 않고 재현 할 수있는 가장 쉬운 방법입니다.
- 부상 후, 동물을 돌려 아래로 포도 접시에 자사의 복부 측면이있다. 그것은 머리를 이동하고 먹을 수 있어야합니다. 부상이 성공하면, 그 유충의 후반부는 마비 될 것입니다.
- 25에 포도 주스 한천 플레이트에 부상당한 동물을 유지 및# 176; C 실험 목적에 따라 원하는 시간. 운동 신경원의 경우, 근위 그루터기는 부상 14 ~ 10 시간 이내에 싹이 트기 시작하고, 말초 그루터기는 6 ~ 8 시간 (15) 내에 퇴화하기 시작합니다. 클래스 IV 다 감각 신경의 경우, 근위 그루터기는 부상 후 3 ~ 4 시간 이내에 변질 4-6 시간, 및 말초 그루터기 시작에서 새싹을 시작합니다. 참고 : 해당 인 Gal4 드라이버와 형광 기자와 함께, 발아 및 변성 (예를 들어, 그림 6 참조) 유충 칩에 관찰 할 수있다.
Representative Results
유충 칩은 누구의 디자인 그림 1에 개략적으로 설명하는 단일 층의 PDMS 블록 (PDMS 칩)으로 구성되어 있습니다. (또한 자신의 금형 설계를위한 보조 DXF 파일을 참조하십시오). 유충 microchamber, 진공 포트 및 경계 채널 (그림 1A)는 PDMS 칩에 140 μm의 들여 쓰기입니다. 칩의 상단에 위치하는 초기 오일 (그림 1B 및 1 C)와 커버 슬립의 상단에 달려있다 3 차 령 유충을 벌였다. 커버 슬립과 PDMS 칩 사이의 오일 유리 인터페이스는 가벼운 진공의 응용 프로그램에 생성 할 수있는 밀봉 할 수 있습니다. 이 씰은 챔버 내에서 애벌레를 트랩 및 조기 개최 이후 3 차 령 유충은 챔버가 어떤 물리적 동물에 수축, 효율적으로 고정화와 이동을 제한을 만들어 밀봉, 실보다 약간 두껍다. 이 고정화 된 상태에서, 어떤 복부이러한 복부 신경 코드와 분절과 같은 신체 구조는, 커버 슬립에 가까운 푸시됩니다. 고정 된 상태에서 이러한 구조가 40X 및 63X 목표의 작동 거리 내에 있어야 할 수 있기 때문에 이것은, 영상 유리하다. 진공이 해제 된 후, 유충 쉽게 추가적인 실험이 수행 될 수 있도록 microchamber로부터 제거 될 수있다. 이 순수하게 기계적인 고정 방식은 최대 1 시간 (12)의 연속 고정 기간 후에 살아있는 애벌레의 90 %를 유지할 수 있습니다.
진공 간단한 20 ML의 주사기, 따라서 전체 단위 챔버의 위치가 라이브 영상이 수행되는 공 초점 또는 표면 형광 현미경으로 수행되는 입체에서 수송하기 쉽게 만들어집니다. 1.6-1.14 단계에서 설명한대로 주사기 (제거 잠금 허브)와 폴리에틸렌 배관 및 23 G 분배 바늘을 통해 진공 포트에 접속된다. 거꾸로 현미경, 튜브에게 들어주사기는 칩 (그림 1B, 2A, 2 B)의 상단을 통해 연결되어있다. 직립 현미경, 이들은 칩의 측면에 포트 (도 1C, 2C, D 및 2)를 통해 접속된다. 거꾸로 현미경의 구성은 다소 사용하기 쉽습니다. 주사기 트래핑 챔버 내에서 유충을 고정, 커버 슬립과 PDMS 장치에 단단히 밀착을 형성하는 오일 유리 PDMS 인터페이스를 결합하는 부드러운 진공 (약 10 PSI)을 만들 당겨진다.
microchamber에 유충의 배치 (프로토콜 2.7 - 2.10 단계) 고정 효과와 생존 (그림 2E-H)에 대한 중요합니다. 동물도 (도 2G), 챔버 대형 또는이면 머리 나 기관이 챔버의 에지와 덮개 사이에 걸리면립 (그림 1H)는, 다음 절차를 살아남을 가능성이있다.
다음은 신경 세포의 다양한 세포 반응을 연구하는 애벌레 칩 (4-7, 영화 S1과 S2 영화 피규어)의 사용의 몇 가지 예입니다.
빠른 축삭 수송의 영상 : 유충 칩은 이미지를 각각의 주변 축삭 내에서 시냅스 소포의 키네신 - 매개 전송 (그림 4와 영화 S1)에 사용 된 선행 성 (~ 1.0 μm의 / 초)과 역행 (~ 0.8 μm의 / 초. 이 소포의) 움직임은 쉽게 회전 디스크 공 초점 현미경에 수집 된 영화에서 공부하실 수 있습니다.
레이저 미세 위해 동물을 위치 :. 감각 뉴런의 수지상은 (도 5 및 무비 S2) 펄스 UV 염료 레이저를 사용하여 가로로 하였다 t의 사용을위한 프로토콜미세 그의 방법은 다른 곳에서 16, 17 찾을 수 있습니다. 효율적으로 고정화 기술은 감지 및 측정 할 (유전자 인코딩 칼슘 2 + 표시 GCamp3.0 (18)에 의해 감지) 세포 내 칼슘의 변화와 손상 신경 세포 빠른 시간 단위 변경 (그림 5)를 할 수 있습니다.
부상으로 재생과 퇴행성 반응의 연구 : 동물이 영상 세션 사이에 휴식을 허용하는 경우, 유충 칩은 다음 시간 규모의 넓은 범위에 걸쳐 발생하는 세포 사건을 연구하는 데 사용할 수. 예를 들어, '재생'과 15 시간의 시간 간격에 걸쳐 수행 축삭 손상에 퇴행성 반응 모두, 유충 칩 (그림 6)에 몇 군데 있습니다. 이 예에서, octopaminergic 운동 신경원의 축삭은 프로토콜의 3 부에서 설명하는 분절 신경 호감 (그림 3)을 통해 부상을 당했다. 근위 축삭 그루터기,새로운 싹을 거쳐, 그리고 정맥류를 형성하고 Wallerian 변성의 과정을 통해 단편화 원위 축삭은 부상 후 몇 군데 다른 시간 간격으로 연구 될 수있다.
생체 내에서 시간이 지남에 photoconvertible 형광 단백질 추적 : 형광 UV 빛에 노출시 비가 역적으로 변경 photoconvertible 형광 단백질)의 개발은 하나의 특정 세포 내에서 단백질의 일부를 라벨, 시간 19 분에 걸쳐 표지 단백질의 운명을 추적 할 수 있습니다 20. 이 기술은 일반적으로 하나가 생체 내에서 세포 내에 정의 된 유전자에 의해 코딩 photoconvertible 단백질을 추적 할 수 유충 칩 그러나, 세포 배양에서 수행된다. 예를 들어 우리가 Denda2-α-tubulin의 융합 단백질은, 클래스 IV 다 감각 뉴런에서 발현한다는 것을 보여,도 7a (세포 기관에 photoconverted 될 수있다
설명 모든 예 (그림 4-7과 영화 S1과 S2가) Nipkow CSU10 스캐너 및 C9100-50 EMCCD 카메라, 디지털 카메라, 회전 디스크 공 촛점 시스템을 사용하여 몇 군데 있었다, 63X (1.5 NA)과의 Axio 옵저버에 장착 오일 목적 및 Volocity 수집 소프트웨어를 이용하여 구동.
그림 1. 유충 칩을 사용하여 강한> 회로도 만화.
(A) 유충 칩은 유리 커버 슬립에 부착 된 하늘색으로 표시된 PDMS 칩으로 구성되어있다. 이 칩은 흰색으로 표시 140 μm의 두께 미세 유체 채널을 포함하고 있습니다. 중앙 microchamber은 아늑 조기 (밝은 녹색에 cartooned) 3 차 령 초파리 유충을 무대에 맞게 설계되었습니다. 금형을 설계하는 데 사용될 수있는 정확한 치수를 포함 DXF 파일은 보조 데이터로서 제공된다. 스케일 바 = 1.5 mm. 유충 칩에 유충을로드하기위한 회로도 (BC) 사이드 뷰. 유충은 아래의 coverslip에 복부 측면을 앉아, 그 몸은 140 μm의 깊은 microchamber 내에 자리 잡고 있습니다. 20 ㎖ 주사기 진공 흡기 포트에 연결되어 있고 온화한 진공을 유도하는데 사용된다. 할로 카본 오일 PDMS 유리 인터페이스는 microchamber의 유충을 제한하는 단단한 물개로 진공에 의해 구속된다. 이 씰은 쉽게 되돌릴 수주사기의 압력을 방출하여, 그 후 동물은 즉시 운동을 되 찾는다. 직립 현미경 (B)의 경우, 주사기 진공이 칩의 상부로부터 50 폴리에틸렌 튜브를 통해 접속된다. 칩의 '정상'이 양면 테이프를 통해 현미경 스테이지에 부착되어있는 동안 반전 현미경 (C)의 경우, 이러한 연결은 칩의 측면으로부터 만들어진다.
그림 2. PDMS 칩과 유충의 정확한 위치의 이미지.
(AD). 반전 똑바로 현미경을위한 PDMS 칩을 보여주는 사진. 23 G 분배 바늘 끝은 진공 (주사기)에 튜브를 통해 연결을 가능하게하는, 진공 포트에 삽입되었습니다. 스케일 바 = 1.5 mm. (EH). 초파리 애벌레의 시야 이미지. E 제대로 고정 동물의 F의 예를 보여줍니다. 긴 시간 규모 (> 12 시간)을 통해 여러 이미지가 실시 될 경우 F의 작은 동물이 바람직하다. G가 너무 큰 동물을 보여주고, H 잘못 위치하는 작은 동물을 보여줍니다. 스케일 바 = 1.5 mm. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
초파리 유충의 분절 신경의 그림 3. 신경 압박 손상.
(A) 신경 호감 분석의 만화. 3 차 내의 분절 신경 (B)보기 신경 호감 후 20 시간을 해부. 안티 HRP 항체 (적색)과 신경 세포막에 대한 면역 염색을하면 두뇌 엽 (叶), 복부 신경 코드 및 motoneuron 및 감각 신경 세포의 축삭을 포함 긴 분절 신경을 강조한다. 각각의 운동 신경원의 서브 세트 M12-인 Gal4 드라이버와 UAS-mCD8-GFP (녹색)의 발현을 구동하여 표시되어 있습니다. 축색 돌기가 분절 신경을 통해 신체 벽 근육에 투사하는 동안 휴대 몸과 뉴런의 수상 돌기는 복부 신경 코드에 거짓말. (이 드라이버는 함께 동물의 양쪽에 전후방 줄무늬로 볼 수있는, 각각의 애벌레 hemisegment에 근육 12 GFP 발현을 구동). 호감에 의해 손상 영역은 파란색 점선으로 강조 표시됩니다. 스케일 바 = 70 μm의. (C) 손상된 축삭 손상 후 20 시간의 전망을 닫습니다. 왼쪽 :근위 축삭이 돋아 거쳐 새로운 성장했다. 오른쪽 : 말초 축삭은 작은 GFP 인해 Wallerian 변성 및 파편의 정리에, 남은, 조각입니다. 스케일 바 = 초기 3 차 령 유충의 신경 호감의 10 ㎛. (D) 이미지. 복부 신경 코드에 빨간색 화살표가. 프로토콜 텍스트 (프로토콜 3)에 설명 된대로 호감의 위치는, 3 세그먼트의 아래쪽에 있습니다. D의 이미지는 원래 J.에 게시 된 휴대 BIOL 191, 211-223, 간접 :.. 10.1083 (2010) 보다 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. peptidergic 시냅스 소포의 축삭 수송의 시간 경과 영상.ANF는 GFP, UAS - ANF-GFP (21) 태그 심방 나트륨 이뇨 펩티드를 쥐, EVE-RRA-인 Gal4 드라이버 (22)를 사용하여 특정 운동 신경원 내에서 표현되었다. 분절 신경의 라이브 영상은 축삭에 peptidergic 소포를 표시 ANF-GFP의 빠른 전송을 보여준다. 또한 영화 S1을 참조하십시오. 라이브 시간 경과 영상에서 motoneuron 축삭의 (A) 단일 프레임. 녹색, 빨강 및 파랑 화살표가 선행 성 예, 고정 및 역행 소포를 표시였다. 스케일 바 = 5 μm의. (A ') 영화에서 개별 시간 프레임 ImageJ에를 사용하여 통합 하였다. (B) ANF-GFP 교통의 시간 경과 영상에서 발생 kymograph은 1 분에 걸쳐 단일 프레임의 컬렉션에서 생성 된 kymographs에서 분할 된 흔적의 경사면에서 계산 된 평균 분절 속도의 ImageJ에 23 일 '다중 Kymograph'플러그인을 사용하여 영상의 시간. (C) 부량. 프리젠 녹색 막대TS의 선행 성 분절 속도 (N = 543)과 파란색 막대는 10 kymographs에서 소포의 역행 분절 속도 (N = 548)를 제공한다. 입자 밀도 (D) 부량. 입자 밀도 (녹색 표시 줄에 표시) 선행 성 수, 10 kymographs에서 축삭 길이 100 μm의 당 고정 (빨간색 표시 줄에 표시)와 (파란색 표시 줄에 표시) 역행 입자에 의해 측정 하였다. 이 그림의 데이터도 등 Ghannad-Rezaie 이전에 발표 된, PLoS 하나 7 (1), e29869, 간접 :. 0.1371/journal.pone.0029869 (2012).
그림 5. 레이저 미세 칼슘 이미징을위한 유충 칩의 사용.
클래스 IV 감각 신경 세포의 수상 돌기는 펄스 자외선 색소 레이저의 고출력 레이저 펄스로하여 가로로되어. 미세이 방법의 사용에 대한 프로토콜은 다른 16 찾을 수 있습니다. 유충 칩의 효과적인 고정 라이브 영상으로 공부하는 세포 내 칼슘 농도의 빠른 변화를 할 수 있습니다. 이 예에서, 유전자 인코딩 칼슘 지표 GCaMP3.0은 PPK-인 Gal4 드라이버를 사용하여 클래스 IV의 돌기의 arborization (C4da) 감각 뉴런에서 발현되었다. GCaMP3.0 강도 (A) 시간 경과 이미지의 색상에 따라 색깔 허위 시간이 지남에 따라 강도의 변화를 나타내는 강도 규모. 각각의 프레임은 5 프레임 / 초에 회전 디스크 공 초점 현미경에 몇 군데 시간 경과 동영상 (영화 S2)에서 추출 하였다. 칼슘 역학 (B) 정량 레이저 미세에 대한 응답. 개별 뉴런의 소마 GCaMP3.0의 형광 강도 (ΔF/F0)의 정규화 된 배의 변경 (회색으로 표시, N = 7) 시간에 대해 도시 하였다. 평균 ΔF/F0은 주황색으로 표시되었다. GCaMP3.0 강도의 피크 증가는 상해 후에 1-2 초 사이에서 관찰되었다. 배경은 원시 G-CaMP3.0의 형광 강도에서 제외되었다. 이 그림의 데이터도 등 Ghannad-Rezaie 이전에 출판되었다 (2012) PLoS 하나 7 (1) :. e29869. 도이 : 10.1371/journal.pone.0029869 12.
유충 칩을 사용하여 그림 6. 이미징 축삭 발아 및 변성. 근위 그루터기 (왼쪽)과 신경 호감 후 다른 시간 지점에서 octopaminergic motoneuron 축삭의 말단 그루터기 (오른쪽) 대표 공 촛점 이미지. 도 3c에 도시 된 바와 같이 이미지가 유사한 위치에서 촬영했다. 이 신경 세포는 TDC를 사용하여 UAS-mCD8-RFP 형질 전환 유전자의 발현을 구동하여 표시되어 있습니다2 인 Gal4 드라이버 (24, 25). 이러한 뉴런의 세포 기관은 복부 신경 코드 (24)에 거짓말. 세 개인 축삭은 단일 분절 신경 내에서 볼 수 있고, 쉽게 서로 해결됩니다. 이는 뉴런 15 시간 내에 완료 퇴화 축삭의 분열, 개별 세포 사건의 연구를위한 이상적인 상황이다. 이미지는 회전 디스크 공 초점 현미경에 63X 배율에서 유충 칩을 사용하여 살아있는 동물에서 얻어졌다. 스케일 바 오른쪽 패널 (말초 그루터기) 10 왼쪽 패널 μm의 (근위 그루터기)와 20 μm의 =. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7. 유충을 사용하여살아있는 동물의 긴 시간과 거리에 photoconverted 형광 단백질을 추적 할 수있는 칩.
이 예에서,-튜 불린을 α 융합 photoconvertible 형광 단백질 Dendra2 19 일의 융합 단백질, PPK-인 Gal4 드라이버를 사용하는 클래스 IV 돌기 arborization (C4da) 감각 뉴런의 UAS-Dendra2-α-튜 불린 유전자로부터 발현된다 광 변환 실험 26. (A) 도식. C4da 뉴런의 세포 기관은 주변에 거짓말을하고 신경 코드 시냅스 터미널을 형성하기 위해 분절 신경을 통해 축삭을 확장합니다. 동물의 후방 절반 세포 기관의 부분 집합 내의 Dendra2-α-튜 불린은 수은 램프 (왼쪽 만화)와 표준 DAPI 필터를 사용하여 6 초 동안 UV 조명에 의해 광 변환을 실시한다. 시간 후, photoconverted Dendra2-α-튜 불린은 복부 신경 코드의 시냅스 터미널에서 검출 할 수있다. 이것은 튜 불린 단백질 트란되었음을 의미(~ 1~2밀리미터의) 긴 거리를 통해 자랑 해 보였다. 클래스 IV 감각 신경 세포의 세포체에서 Dendra2-α - 튜 불린의 스케일 바 = 1mm (B) 예 이미지 이전과 광 변환 후. 스케일 바 = 5 μm의. (C) 세포 기관의 광 변환 후 0 시간 또는 48 시간 중 하나의 클래스 IV 감각 뉴런 시냅스 터미널의 예 이미지. 시간 후 시냅스 터미널에서 photoconverted Dendra2-α-튜 불린의 구체적인 모양은 단백질이 축삭의 말단 세포의 몸에서 여행을 의미합니다. 모든 시간 지점에서 광 변환 및 이미지는 유충 칩에 실시되었다. 스케일 바 = 15 μm의. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 S1. 레이저 미세하고 C4da 신경 세포의 칼슘 이미징. 펄스 UV 레이저는 꼼꼼한를 절개하는 데 사용되었다진 돌기 지점. 레이저 절개 부상의 위치에서 시작하여 전지 본체에 여행 GCaMP 강도의 급격한 증가를 유도. UAS-GCaMP3.0 18 C4da 특정 PPK-인 Gal4 드라이버 (26)를 사용하여 표현 하였다. 영화는 GCaMP3.0의 상대 강도의 레벨을 표시하는 색 허위. 시간 경과 이미징 / 초 5 프레임에서 회전하는 디스크 공 촛점 현미경으로 실시되었다.
영화 S2. 운동 신경원의 ANF-GFP의 빠른 축삭 수송.
ANF는 GFP, UAS - ANF-GFP 21, 태그 쥐 심방 나트륨 이뇨 펩티드 EVE-RRA-인 Gal4 드라이버 (22)를 사용하여 특정 운동 신경원 내에서 표현되었다. 애벌레 분절 신경 이내에 peptidergic 소포의 운송은 회전 디스크 공 촛점 현미경을 사용하여 300 밀리 초 / 프레임의 유충 칩에 몇 군데 있었다.
보충 그림 1 (DXF 파일)
실리콘 몰드 제작을위한 DXF 파일. 이 파일은 4 인치 실리콘 웨이퍼에 부정적인 포토 레지스트 마스크 (SU-8에 대한 어두운 제기 마스크)를 위해 설계되었습니다. 두 번째 행은이 프로토콜에 사용되는 유충 칩을 만들기위한 5 금형을 포함하고 있습니다. 이 칩 (행 2) 각각의 초기 단계 3 차 령 유충에 맞게 설계 ~ 5.4 mm × 1.5 mm 챔버를 포함합니다. 세 번째 행 (행 3) 작은 챔버 (~ 4.4 X 1.5)를 포함하는 동안 첫 번째 행 (행 1), 큰 챔버 (~ 5.4 mm × 2 mm)를 포함하고 있습니다. 이들은 각각, 크고 작은 크기의 애벌레로 이용 될 수있다. = 2mm 스케일 바.
Discussion
만들기 또는 유충 칩을 획득 :
유충 칩은 유리 커버 슬립에 부착 된 PDMS 블록 ( 'PDMS 칩'라고)로 구성되어 있습니다. 1 단계에서 프로토콜을 만들고 유충 칩을 사용, SU-8 몰드를 사용할 가정을위한 절차를 설명합니다. SU-8 주형은 포토 리소그래피 (자세한 Ghannad-Rezaie 외. 12 참조) 실리콘 웨이퍼 상에 140 ㎛의 두께의 SU-8 포토 레지스트 층을 패터닝하여 마이크로 제조된다. SU-8 몰드의 미세가 전문 장비에 액세스 할 수 있어야합니다, 우리는 미세 시설에서 주문하는 것이 좋습니다 (예. 미시간 (14)의 대학에서 LNF 시설), 또는 그들에게 제공되는 칩 설계를 전송하여 파운드리 보조 파일로 저장됩니다. 하나는 (다른 크기의 애벌레와 함께 사용 예) PDMS 칩의 디자인, DXF 파일 (예 :의 AutoCAD) 처리 CAD 소프트웨어를 변경하고자하는 경우에 사용될 수있다. SU-8 금형도 Mondal의 지침에 따라 자체적으로 할 수있다 등. 27 많은 독자가 편리 단순히 자신의 칩을 제조하기 전에 기술을 사용해 샘플 PDMS 칩을 얻기 위해 찾을 수 있습니다. 이 요청에 따라 자유롭게 사용할 수 있습니다.
라이브 영상을위한 미세 유체 '유충 칩'의 사용 :
유충 칩에 고정화 방법은 마취제의 사용을 피하고, 대신 동물의 이동을 규제하기 위해, 진공의인가를 통해, 압력을 포함한다. 동물이 여러 시간 12 짧은 고정 기간 (5 ~ 15 분)의 칩에 고정 살아남을 수 있지만 권장합니다. 이 세포 내 칼슘의 변화, 또는 빠른 축삭 수송 등의 관심이 많은 세포 사건을, 이미징을위한 충분한 시간이다. 이것은 또한 레이저 기반 미세, 광표백 및 photoconver으로 살아있는 동물에서 원하는 조작을위한 충분한 시간입니다시온.
길이 방향으로 하나의 동물에 더 긴 시간 동안의 이벤트를 연구하기 위해, 동물은 휴식의 기간으로 구분하여 여러 번 칩에 넣고 몇 군데 있습니다. 그들은 쉬운 음식 소스와 습도를 제공하기 때문에 포도 주스 한천 플레이트는 영상 세션 사이에 휴식에 이상적입니다. 각 세션 (아래 문제 해결에 2 부 참조) 동물을 손상에 대한 몇 가지 모험을 수반하기 때문에 여러 이미지 세션은, 정도의 애벌레의 생존에 영향을 미치지 않습니다. 동물은 정기적으로 50 % 이상 생존율 이틀에 걸쳐> 5 배를 이미지 할 수 있습니다. 동물이 마취되지 않기 때문에, 그들은 즉시 칩에 진공을 방출 한 후 건강 및 운동성. 이 촬상 세션 사이 복구 시간에 대한 필요성이 없기 때문에 세션 사이의 시간 간격은, 유연하고 실험의 목적으로 조정될 수있다.
문제 해결 :
가장 일반적인 기술은유충 칩 및 권장 해결 방법은 다음과 같습니다에 고소 :
(1) 동물을 너무 많이 움직이고있다. 너무 많은 이동성 촬상 목표를 방해 할 수있다. 유충 칩이 가장 일반적인 이유는 a) 동물의 칩이 너무 작고, 또는 b) 고정화 공정 중에 적용 진공 압력이 저하되어있다. 초기 3 차 령 애벌레를 개최를 위해이 프로토콜에 설명 된 유충 칩 설계되었습니다. 동물에 대한 최적의 크기는 (전후 축 방향) 길이 3.5-4 ㎜이다. 저항이 핸들에 느껴질 때까지 진공 압력이 충분하다는 것을 보장하기 위해, 주사기 ~ 2.5 ML를 잡아 당기거나. 진공이 작동하는지 하나의 표시는 경계 채널에서 작은 기포가 진공 원쪽으로 천천히 이동 볼 수있는 것입니다. 또 다른 표시는 칩 (상단에서 해제 될 때 커버 슬립은 항상 칩과 함께 가야한다는 것입니다 이것은 챔버를 전송하기위한 권장되는 방법입니다유충은 위치와 진공)에 한 번. 튜브에 균열이 존재하는 경우, 진공이 저하되거나, 오일 호스에서 존재하는 경우. 이것은 쉽게 (단계 1.6-1.14부터) 바늘 끝과 폴리에틸렌-50 튜브 분배 23 G를 대체하여 해결할 수 있습니다.
(2) 동물들은 칩의 촬상 후 죽는다. 절차는 동물에 최소 스트레스를 야기하기위한, 그리고 야생형 유전자형의 동물에서도 칩 (12)에 고정의 시간 후에,> 90 % 생존율을 가지고있다. 어떤 유전자형이 칩의 응력에 덜 탄력적 수 있기 때문에, 제 야생형 동물 (예를 들어, 부르 S) 고정화 기술을 생존 확인. ) 치사의 가장 일반적인 원인은 유충의 잘못된 위치 (그림 2G-H 참조). 표피, 머리 또는 기관의 일부가 챔버 내에 완전히없는 경우, 그들은 고정하는 동안 손상되고, 수칩 (> 4mm)에 비해 너무 큰 애벌레는 생존 가능성이 적습니다. B) 치사에 대한 덜 흔한 원인은 너무 많은 압력 또는 진공 칩을로드를 사용하는 것입니다. 적절 칩에 위치하면 진공에 의해 생성 된 압력은 내약성이다. 그러나 진공에서 또는 동물의 위치의 초기에 하나 과도한 압력이 문제가 될 수있다. 그것은 올바른 크기의 야생형 애벌레와 시험에 의해 경험적으로 필요한 압력의 정도를 학습하는 것이 가장 좋습니다. 너무 많은 할로 카본 오일은 동물의 기관을 포함 할 경우 C) 동물은 잠재적으로 장기 생존에 문제가있을 수 있습니다. 이는 진공 생성, 촬상시 광학 위해 중요하고, 그 칩을 건조 중화 : 오일 칩에 여러 가지 중요한 역할을한다. 그러나 과도한 오일은 피해야한다. (이것은 또한 진공 저하, 튜브 및 주사기에 오일로 이어질 수 있습니다.) 기름 유충의 단지 복부 측면 제안 된 프로토콜 코트 후, r영상의 최종 커버 슬립에 전송하기 전에 깨끗한 커버 슬립에 유충의 배치로 여분의 기름을 emoves. d) 광독성이 촬상 세션에서 경험 될 수있다. 모든 실시간 이미징 애플리케이션과 같이, 가장 고감도 카메라 또는 검출기를 이용하여 달성되는 저 강도의 레이저 광, 짧은 노출 시간을 사용하는 것이 이상적이다. 수은 광원에 의해 생성 광범위한 스펙트럼 빛을 포함, 자외선 조명을 최소화하려고합니다.
다른 문제와 미래의 방향 :
이 방법은 마취를 사용하지 않기 때문에, 동물의 심장이 이길을 계속하고 있습니다. 이것은 더 다른 사람보다 일부 지역의 이미지에 영향을주는 피할 수없는 이동성을 만듭니다. 여기에 예는 복부 신경 코드, 분절 신경 및 신체 벽을 쉽게 하트 비트의 간섭없이 이미지가 될 수 있다는 것을 보여줍니다. 하트 비트가 영상에 영향을 미치는 경우에, 일정한 움직임 때로는 함께 보정 할 수있다분석 소프트웨어 (예를 들어, ImageJ에 대한 손떨림 보정 플러그인). 개별 개체를 (시간 분) 빠른 시간 척도 (빠른 축삭 수송을위한 예를 들어 ~ 1 μm의 / 초) 또는 매우 느린 시간 규모에 이동하는 경우에 잘 작동합니다. 그러나, 객체 (들)의 속도와 방향의 범위와 관심의 이동, 그것은 심장 박동에 의한 움직임을 보정하기 위해 더 열심히 할 수 있습니다.
또 다른 문제는 동물에서 동물로, 또는 칩에 같은 동물의 여러 이미징 세션 사이에 광학에 약간의 변화입니다. 깊은 관심의 대상이 동물 안에, 더 큰이 변화 될 것입니다. 부위 별 신경 및 복부 신경 코드가 너무 깊이 일반 현미경 이미지에 표시 할 다음 동물에서 일반적입니다. 그러나 유충 칩에 경험이 가벼운 압력은 매우 가까운 표피와 coverslip에 이러한 구조를 푸시합니다. 커버 슬립에서 이러한 구조의 정확한 거리는 TR에서 작은 변화를해야합니다재판에 IAL. 개체의 변화는 감각 신경의 세포 기관으로, 표피를 닫고, 이하입니다. 그것은 광학의 다양성을 고려하여 동물과 독립 시행의 큰 숫자를 활용, 특히 강도의 측정을 만들기위한 것이 중요하다.
여기에 표시된 예는 신경 세포 내에서 프로세스에 초점을 맞추고 있지만, 방법은 현미경의 대물 렌즈의 초점 깊이 이내에 제기 할 수있는 동물의 모든 구조를 이미징 할 의무가 있어야한다. 이 표피, 신체 벽 근육, 그들의 NMJs가 포함되어 있습니다. 동물의 복부 측면에서 기관과 잠재적으로 소화 기관의 일부 이미지를 만들 수 있습니다. 동물도 등의 표면에 가까운 구조의 단기 이미징 coverslip을 향해 몸 윗면에 위치 될 수있다. 깊은 동물 내의 화상 구조와 기능은 사용 현미경 대물의 작동 거리에 의해 제한된다. 이러한 메신저와 같은 구조aginal 디스크는 높은 배율 (예 : 40 배) 목표에 액세스 할 수 없습니다.
이 프로토콜에 설명 된 유충 칩 (3.5-4 mm의 크기에 이르기까지) 초기 3 차 령 단계에서 유충을 위해 설계되었습니다. 그러나 많은 흥미로운 질문은 다른 유생 단계에서 영상을 필요로합니다. 후반 3 차 령충을 수용하기 위해 2 차 령 유충, 또는 더 큰 칩들을 수용하기 위해 더 작은 칩으로 간단 동일한 원리를 이용하여 설계 될 수있다. (보충 그림 1은 변형 된 챔버의 크기에 실리콘 형을 만들기위한 쉽게 수정 DXF 파일이 포함되어 있습니다). 가역 씰의 간단한 원리는 심지어 C.와 같은 다른 생물에 적용 할 수있는 주요 변형 챔버의 크기되고있는 엘레 또는 제브라 피쉬. 유용한 미래의 방향은 검사 목적으로 사용하는, 한 번에 많은 동물을 무력화 할 수있는 칩을 설계하는 것입니다. 그러나,이를 위해, 설계는 상당히 상이 할 필요가있을 것이다칩에 동물의 위치의 문제가 독립적으로 각각의 동물에 대해 처리 할 필요가 현재 장치로부터.
유충의 말초 신경에 손상 반응을 연구하는 신경 호감 분석 :
애벌레 분절 신경에 여기에서 설명하는 신경 호감 분석은 초파리 주변 축삭에 부상을 도입하는 간단한 방법입니다. 이 방법의 장점은 다음과 같습니다)는 초파리 실험실 (실체의 CO 2 소스와 집게)에있는 표준 도구를 사용하여 수행 할 수 간단합니다 B)는 손상 후 신경 코드의 생화학 적 분석을하고, 많은 동물에 대해 신속하게 수행 할 수있다 14 가능, C)이 부상으로 분자 및 세포 반응은 14,15,28 높은 재현성과 척추 동물의 신경 세포 (29, 30)도 중요한 프로세스를 발견 할 수 있습니다.
신경 손상의 대체 방법은 focu하는 것입니다SA 고출력 레이저, 예를 들어 레이저 미세 17,31-33 통해 축삭을 절단하는 펄스-UV 또는 펨토초 레이저. 유충 칩은 미세 수술에 대한 동물의 위치를위한 이상적인 방법입니다. 그러나, 전술 한 바와 시험 사이의 광학, 사소한 차이, 레이저 기반의 방법은 특히 유충의 분절 신경에, 유충에서 재현하는 것이 더 어려울 수 있습니다. 또한, 레이저 기반 축삭 손상은, 각각의 동물을 배치하는 시간을 더 필요로하므로 (동물의 다수) 대규모로 실시하는 것이 더 어렵다.
문제 해결 :
신경 호감에서 가장 일반적으로 발생하는 기술적 인 문제는 내부 장기 손상으로 인한 사망이다. 호감을 수행 할 때, 복부 신경 코드, 침샘, 또는 내장을 꼬집어하지 않는 것이 중요합니다. 그것은 표피에 구멍을하지 않는 것도 중요합니다. 이러한 문제는 가장 표피의 계면에 45 ° 각도로 집게를 가져 와서 피할 수있다E (도 3 참조).
집게의 품질은 그 후 호감과 생존의 효과에 따라 큰 영향을 미치고 있습니다. 우리는 Dumostar 번호에게 5 개의 집게를 추천합니다. 자신의 선명도를 유지하려면, 집게, 취급시주의가 다른 목적으로 이용되지, 그들은 무딘 또는 굴곡이되면 교체해야합니다.
동물의 크기는 또한 분쇄의 효과에 영향을 미칠 수있다. 작은 동물 (길이 3 mm 이하)를 훨씬 덜 가능성이 부상에서 살아남을 수 있습니다. 큰 동물로, (3 차 령충 방황), 그것은 신경을 찾아 큰 침샘과 내장의 손상을 방지하는 것이 더 어렵고, 용화 전에 부상의 반응을 연구하는 데 시간이 덜이있다. 신경 호감을 가장 효율적으로 초기 3 차 령 유충 실시합니다 (이 있습니다 ~ 전후 축을 따라 길이 3-4.5 mm).
동물이 때 발생하는 음식 소스에 영향을 줄 수 있습니다분쇄 후 표피와 생존의 힘. 그것은 표준 효모 포도당 레시피로 만든 음식 동물을 마련하는 것이 좋습니다.
효과적으로 분쇄 작업을 수행하는 방법을 배우기위한 가장 좋은 방법은 먼저 기본 생존을 달성 목표 (그리고 용화) 분쇄 후 24 시간과 많은 동물에 연습하는 것입니다. 초보자는 일반적으로 낮은 생존율 (예 : 10 %)을 가지고 있지만, 기술이 알게되면, 생존율 ~ 90 %에 도달 할 수 있습니다.
다른 문제와 미래의 방향 :
호감 분석은 부상 사이트와 축삭 손상 사이트에 말단 시냅스의 변성 축삭의 근위의 싹을 연구 할 수있는 강력한 방법을 제공한다. 변성의 비율이 다른 신경 세포의 종류에 따라 다릅니다 있지만, 그들은 부상 분석의 재현성에 증거를 제공, 특정 신경 세포 유형에서 높은 재현성 있습니다.
반대로, '재생'은 돋근위 축삭에서 관찰 응답은 연구에 더 많은 도전입니다. 분절 신경의 모든 축삭 (예를 들어, 그림 6과 그림 3 참조) 부상 사이트 부근에 돋아 광범위한 시작합니다. 그러나 발아의 정도는 신경 세포에서 신경 세포로 변화하고, 정량화하기 어려운 수 있습니다. 발아에 유사한 정도의 변화는 UV 펄스 색소 레이저를 사용하여 도입 분절 신경의 하나의 운동 신경원의 더 많은 초점 병변 후 관찰 할 수있다. 우리는 발아의 nondiscriminate 방향성 분절 신경의지도 단서의 부재 때문이라고 해석한다. 반면에 가까운 자신의 세포 기관에 레이저로 부상 감각 신경 세포의 축삭은 손실 축삭 (34)과 동일한 방향으로 새로운 축삭의 성장을 받고있다. 동물의이 지역의 축삭은 가능성이 재생 된 축삭의 지침에 대한보다 구체적인 위치 정보에 노출되어 있습니다. 분절 신경 내의 환경은 많은 resemblan을하지 않을 수 있습니다원래 배아에서의 지침 동안 탐색 축삭이, 따라서 재생 축삭을 안내하는 정보를 가질 것으로 예상되지 않는 환경에 CE.
분절 신경 호감 분석을 사용하여 재생을 연구의 또 다른 한계는 부상 감각과 motoneuron 축삭은 여전히 동물 겪습 전에 자신의 목표에 도달하는 (0.25-1 mm), 그리고 제한된 시간 프레임 (<3 일)를 충당하기 위해 상당한 거리를 가지고있다 용화. 최근의 연구는 3 차 령 애벌레 단계 (35)의 지속 시간을 세배 prothoraciotropic 호르몬 수용체의 유전자 조작을 확인했습니다. 이 조작은 9 대신에 3 일, 크게 손상 후 신경 세포의 복구 및 변성을 공부하는 시간 프레임을 확장 할 것입니다. 이 부상이 시냅스 끝 부근에 유도 특히, 이러한 시냅스의 대상에 부상 축삭의 재 연결과 같은 새로운 이벤트를 관찰 충분히 할 수있다.
Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 (CAC에 의해 R00MH080599, 노스 캐롤라이나에 R21 NS062313 및 NS069844) 국립 과학 재단 (National Science Foundation), (허가 번호 CAC에 IOS-0842701), 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다. 우리는 기술 지원을 제임스 SCHUTT, 에밀리 한, 그리고 레니 트루 옹을 인정, 그리고 플라이 라인에 대한 블루밍턴 증권 센터 것이다. 모든 칩은 미시간 대학의 루리 나노 제조 시설에서 제조 하였다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Polyethylene tubing | Fisher Scientific | 14-170-11B | Polyethylene tubing, I.D. = 0.023 in O.D. = 0.038 in |
| 1 mm Polyurethane tubing | Fisher Scientific | BB521-63 | Polyurethane tubing, I.D. = 0.063 in O.D. = 0.125 in |
| Barb to barb connector | Bio Rad | 732-8300 | 0.8 mm barb to barb connector |
| 3-way Stopcock valve | Bio Rad | 732-8104 | Screw on valve for the syringe |
| Syringe (20 ml) | Fisher Scientific | 14-817-33 | Screw on 20 ml syringe for generating vacuum |
| Dispensing needles, 23 G (0.4 mm I.D., 0.6 mm O.D.) | McMaster-Carr | 75165A684 | Needle for outlet connection |
| Dispensing needles, 21 G, (0.6 mm I.D., 0.8 mm O.D.) | McMaster-Carr | 75165A679 | Needle for outlet connection |
| Halocarbon oil | Sigma | H8898 | Halocarbon oil 700 |
| Dumostar Number 5 Forceps | Roboz | RS-498 | For nerve crush |
| PDMS Kit (Base and curing agent) | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant 0.5 kg Kit Clear |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-544-C | 24 mm x 40 mm (thickness according to recommendation for your microscope objective) |
| Disposable Plastic Cup (9 oz) | |||
| Plastic coffee stirrer stick | |||
| Razor Blade | |||
| Grape juice agar plates | See http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925 for recipe |
References
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