Summary
在这里，我们证明了我们的实验室如何冻结色调人类胚胎干细胞系。
Abstract
在这里，我们证明了我们的实验室如何冻结色调人类胚胎干细胞系。一个健康，成倍扩大培养，用PBS洗，以去除残留的媒体，否则可能淬火胰蛋白酶反应。回暖的0.05％胰蛋白酶EDTA，然后添加到覆盖细胞，板允许在室温下5分钟孵化。在这段时间内可以观察细胞四舍五入，和殖民地抬离板面。温和的反复吹打将删除从钢板表面的细胞和殖民地。放置在一个标准的锥形管，包含预热的胚胎干细胞媒体淬火剩下的胰蛋白酶，胰酶消化细胞，然后纺制。细胞悬浮在大约一百万个细胞的浓度生长介质，在一个媒体毫升，浓度等，一个冻结等分足够的复活一种文化上10厘米板。充分重悬细胞后，冰冷的冻结媒体是在同等体积增加。细胞悬浮液充分混合，分装成冷冻小瓶，允许慢慢冻结超过24小时- 80C。冷冻细胞可以长期贮存的液氮转移到气相，或约6个月保持在-80。
Protocol
- 一个健康，成倍扩大培养，用PBS洗，以去除残留的媒体，否则可能淬火胰蛋白酶反应。
- 回暖的0.05％胰蛋白酶EDTA，然后添加到覆盖细胞，板允许在室温下5分钟孵化。在这段时间内可以观察细胞四舍五入，和殖民地抬离板面。
- 温和的反复吹打将删除从钢板表面的细胞和殖民地。
- 放置在一个标准的锥形管，包含预热的胚胎干细胞媒体淬火剩下的胰蛋白酶，胰酶消化细胞，然后纺制。
- 细胞悬浮在大约一百万个细胞的浓度在媒体中的生长介质。
- 充分重悬细胞后，冰冷的冻结媒体在相同体积的增加。
- 细胞悬浮液充分混合，分装成冷冻小瓶，允许慢慢冻结超过24小时- 80C。
- 冷冻细胞可以长期贮存的液氮转移到气相，或约6个月保持在-80。
注：在106细胞/ ml的浓度冷冻等分足够的复活一种文化上10厘米板。
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Discussion
冻结色调细胞株中描述的技术，我们有效地存储和复活的色调细胞株和利益的任何哺乳动物细胞。工作时，与胚胎干细胞系，染色体核型异常，可能会出现不正常的细胞可以迅速接管该行，冷冻的细胞在每一个通道的一小部分是一个重要的考虑因素。因此，有冷冻分割在某些段落中除了大银行，在每一个通道是非常可取的。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| HuES Medium | medium | For a total of 651.5 mL, add: 500 mL KO-DMEM + 6.5 mL PenStrep + 6.5 mL L-Glut + 6.5 mL NEAA 6.5 mL + beta-mercapt–thanol 0.6 µL (14.3 M stock) + 65 mL Serum Replacement + 65 mL Plasmanate + 0.65 mL bFGF2 (~10 ng/mL final) | ||
| Freezing Medium | medium | 80% FCS (fetal calf serum) + 20% DMSO (dimethyl sulfoxide). Stored at 4 °C. |
References
- , Forthcoming.
