Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

عزل الخلايا الدبقية الصغيرة القشرية مع نمط ظاهري مناعي المحفوظة وظيفة من الفئران حديثي الولادة

Published: January 30, 2014 doi: 10.3791/51005

Summary

مفتاح واحد لتحقيق النجاح في البيولوجيا دبقية هو الحفاظ على immunofunction دبقية فيفو السابقين خلال العزلة من أنسجة الجهاز العصبي المركزي. عزل الخلايا الدبقية الصغيرة عبر نتائج تهز الدوارة في مزارع الخلايا نقية للغاية وفقا لتقييم immunofunctional التصوير الفلورسنت، كيمياء سيتولوجية مناعية، وتفعيل الخلايا الدبقية الصغيرة ELISA التالية مع عديد السكاريد الشحمي المحفزات proinflammatory (LPS) وبام 3 CSK 4 (بام).

Abstract

عزل الخلايا الدبقية الصغيرة من الأنسجة CNS هو أداة قوية التحقيق تستخدم لدراسة البيولوجيا دبقية فيفو السابقين. تفاصيل هذا الأسلوب إجراء لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة من القشور الفئران حديثي الولادة عن طريق الانفعالات الميكانيكية مع شاكر دوارة. هذه العزلة الخلايا الدبقية الصغيرة غلة طريقة الخلايا الدبقية الصغيرة القشرية نقية للغاية التي تظهر الخصائص المورفولوجية والوظيفية يدل على الخلايا الدبقية الصغيرة هادئة في ظروف طبيعية nonpathological في الجسم الحي. كما يحفظ هذا الإجراء نمط ظاهري مناعي دبقية وظائف البيوكيميائية كما يتبين من استقراء التغيرات المورفولوجية، إزفاء النووية من الوحيدات P65 من NF كيلوبايت (P65)، وإفراز خلوى proinflammatory السمة المميزة، عامل نخر الورم-α (TNF-α )، بناء على عديد السكاريد الشحمي (LPS) وبام 3 CSK 4 (بام) التحديات. وبالتالي فإن إجراء العزل الحاضر يحافظ على نمط ظاهري مناعي من كلا هادئة وموارد الوراثية الحيوانيةالخلايا الدبقية الصغيرة vated، وتوفير المنهج التجريبي من التحقيق البيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة في فيفو السابقين الظروف.

Introduction

خلايا دبقية، الضامة مراقبة لحمة الجهاز العصبي المركزي، تشكل حوالي 12٪ من السكان الخلية الكلي للدماغ الثدييات الكبار. وتستمد الخلايا الدبقية الصغيرة من الكيس المحي النخاعي السلائف الخلايا وتختلف في كثافة الخلايا والتشكل في مناطق مختلفة داخل cytoarchitectural الكبار CNS 1-5. في البالغين الأصحاء الدماغ، الخلايا الدبقية الصغيرة هي خلايا صغيرة، أو القطبية متشعبة مع العمليات الحيوية غرامة. وعلى النقيض من الطرفية التشكل بلعم، يبرهن على وجود الخلايا الدبقية الصغيرة هادئة، النمط الظاهري الأضواء في أدمغة الصحية التي قد تظهر الخمول الخلوية، ولكن التظاهر في الدراسات المجراة أن عمليات التصوير دبقية تمديد حيوي وسحب لمراقبة المكروية بهم بطريقة تذكرنا " أخذ العينات والمسح "6،7.

الخلايا الدبقية الصغيرة هي غاية وبشكل مختلف تستجيب لتغيرات البيئية والفيزيولوجية المرضية في الدماغ، والتحولمن surveillant إلى الدول تعتبر يستريح وتنشيط عادة الدولة المستجيب، على التوالي. هذا التبديل في تنشيط يمكن بوساطة إشراك مستقبلات غشاء محدد والتعرف على نمط (خنازير)، مثل مستقبلات تول مثل (TLRs)، التي تستجيب لأنماط الجزيئية المرتبطة الممرض (PAMPs)، وهي البروتينات الدهنية البكتيرية والفيروسية مشتقة والأحماض النووية، والكربوهيدرات 8-11. بالإضافة إلى PAMPs، وأيضا ثبت خنازير للحث على تفعيل دبقية ضد العقيمة، والجزيئات غير إمراضية المعروفة باسم أنماط الجزيئية الخطر / الضرر المصاحب (DAMPs)، والتي تمثل اضطراب في الجهاز العصبي المركزي التوازن، مثل تلف الخلايا 12-16. مرة واحدة تعمل، خنازير الشروع في داخل الخلايا مما يشير إلى أن النتائج في سلسلة تغييرات في التشكل دبقية الخلية والجينات التعبير، على وجه التحديد، الخلايا الدبقية الصغيرة تنشيط التكيف مع النمط الظاهري مثل أميبية، ونقل من P65 NF كيلوبايت الوحيدات (P65) إلى نواة الخلية، وupregulate و الم Ùكشن وإفراز السيتوكينات proinflammatory، مثل عامل نخر الورم-α (TNF-α)، انترلوكين 1 β (IL-1β)، جنبا إلى جنب مع أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) 16-24. على الرغم من أن يتجزأ في الاستجابة المناعية الفطرية للجهاز العصبي المركزي، كما تم العثور على هذه الجزيئات يفرز لزيادة الاكسدة العصبية، مما يحفز وتفاقم تنكس عصبي في الدول المريضة مثل الشلل الرعاش ومرض الزهايمر 25-29.

ومع ذلك، لا يفهم تماما آليات تفعيل دبقية في الحالات المرضية. لذلك، عزل الخلايا الدبقية الصغيرة هو أداة قوية التحقيق في هذه العمليات البيولوجية، والعديد من الميزات في الجسم الحي من تفعيل دبقية يمكن تلخيصها في الثقافة. العديد من الطرق المتاحة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة، بما في ذلك العزلة عن طريق التدرج Percoll التالية الهضم الأنزيمي من الأنسجة CNS 30،31. ومع ذلك، يمكن تغيير الهضم الأنزيميعلى نمط ظاهري مناعي للخلايا عن طريق الحد من سطح الخلية مستضد التعبير 32، والنتائج في انخفاض العائد خلية لكل حيوان من الطريقة الموضحة في هذه الوثيقة. على وجه التحديد، ونحن التقرير متوسط ​​العائد الخلايا الدبقية الصغيرة في القشرة الجرو من 7.5 × 10 5 خلايا، في حين ذكرت سابقا أساليب بمعزل عن كامل الجهاز العصبي المركزي عن طريق التدرج العائد Percoll 3-5 × 10 5 خلايا 30،33،34. تلتف الإجراء الحاضر استخدام إنزيمات الهضم من خلال عزل الخلايا الدبقية الصغيرة استنادا إلى خصائص المنخفض تمسكهم، وبالتالي الحفاظ على نمط ظاهري مناعي دبقية وظيفة.

في هذه الدراسة، ونحن تصف عزل خلايا دبقية من ثقافات مختلطة الدبقية مشتقة من حديثي الولادة متخالف CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -)، وC57BL / 6 قشرات الفئران عن طريق التحريض على شاكر الميكانيكية الدوارة، امتدادا من السابق طريقة نشر 24،35. نحن الاستفادة من سلالة الماوس السابق لتصور سهل من الخلايا الدبقية الصغيرة، وهذه الفئران التعبير عن GFP تحت سيطرة CX3CR1 موضع الذاتية - مروج الوحيدات محددة 36-38. وتنتج هذه الطريقة الثقافات دبقية نقية للغاية مع الحفاظ على نمط ظاهري مناعي فيفو السابقين كما يتضح من تغيرات شكلية، إزفاء النووية من P65، وإفراز TNF-α عندما تحدى مع عديد السكاريد الشحمي البكتيرية (LPS) أو بام 3 CSK TLR4 وTLR1 / 2 منبهات ، على التوالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

قبل البدء في هذا البروتوكول، وجمع الفئران حديثي الولادة في أيام ما بعد الولادة 1-3 (P1-3) في وعاء معقم متداخلة مع الفراش القفص الأصلي للحماية والدفء. من المهم أن تعمل بسرعة وكفاءة من خلال هذا البروتوكول لتحسين العائد دبقية. يرجى الاطلاع على الجدول 1 لائحة كاشف كاملة.

1. إعداد الصكوك والثقافة وسائل الإعلام، وأطباق

  1. تحضير 10 مل / الجرو الخلايا الدبقية الصغيرة وسائل الإعلام كاملة (MCM؛ 1X الحد الأدنى الضروري متوسط ​​ايرل [MEM] تستكمل مع: 1 مم L-الجلوتامين، 1 ملي البيروفات الصوديوم، و 0.6٪ V / V-D (+) الجلوكوز، 100 ميكروجرام / مل البنسلين / الستربتوميسين (P / S)، و 4٪ ت / ت مصل بقري جنيني (FBS)، و 6٪ ت / ت الحصان مصل)، وإضافة إلى كل T-75 قارورة (1 قارورة / الجرو)؛ كأب والمكان أفقيا إلى حاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2) لكي تتوازن لمدة 1 ساعة. ومن الضروري أن تتوازن هذه الوسائط في قارورة (ق) قبل البدء في تشريح.
  2. استعداداتإعادة، قسامة، ودافئة في 37 ° C حمام الماء MCM للتشريح (6 مل / الجرو) وMCM في أنبوب مخروطي منفصل لخلية إعادة تعليق (2 مل / الجرو). إعداد وقسامة، والبرد على الجليد الثرم وسائل الإعلام (MM؛ تستكمل مع HBSS: 100 ميكروغرام / لتر P / S، M 0.01 HEPES؛ 3 مل / الجرو)، وتشريح وسائل الاعلام (DM؛ MEM تستكمل مع 100 ميكروغرام / لتر P / S؛ 2 مل / الجرو).
  3. تعقيم الأدوات الجراحية التالية الانغمار في الإيثانول 70٪ لمدة 10 دقيقة: مقص # 1 (1؛ لقطع رأس)، forcep رقم 1 (2؛ لتأمين الأنف وإزالة القشور)، مقص # 2 (1؛ nonangled؛ لفتح فروة الرأس )، forcep رقم 2 (1؛ لإزالة فروة الرأس)، forcep التصنيف رقم 3 (1؛ لإزالة الجمجمة)، forcep رقم 4 (2؛ لإزالة السحايا)، مقص التصنيف رقم 3 (1؛ لتخطر على أنسجة المخ). السماح للهواء الجاف على وسادة العقيمة.
  4. مسح أسفل الأفقي، تدفق الهواء محطة وتشريح المجهر مع الايثانول 70٪.
  5. الاستغناء DM إلى 2 العقيمة، و 100 ملم أطباق بتري لالتقاط الرأس (3 مل، 1 طبق / 3 الجراء) وتشريح (1 مل؛1 صحن / الجرو؛ المبردة على الجليد قبل تشريح). الاستغناء MM إلى 1 معقمة، 100 مم طبق بتري لتنميق أنسجة المخ (1 مل، 1 طبق / الجرو).

2. الدماغ الأنسجة تشريح

  1. قبل القتل الرحيم، تطهير بلطف الرقبة والرأس من الجرو مع الايثانول 70٪ باستخدام الأنسجة المختبر. مع مقص # 1، الموت ببطء بسرعة الجرو عن طريق إزالة الرأس؛ القبض على الرأس في معدة مسبقا طبق بيتري. الموت ببطء واستكمال تشريح الجرو واحدة قبل الشروع في الحيوان المقبل.
  2. نقل الرأس إلى طبق تشريح المبردة؛ تحت المجهر تشريح تأمين رأسه معسر الأنف باستخدام forcep رقم 1 (بدلا من ذلك، يمكن تأمينها عن طريق ثقب الرأس ملقط من خلال محجر العين)؛ فروة الرأس المفتوحة باستخدام مقص رقم 2 عن طريق إنشاء Y قطع: تبدأ من قاعدة الرأس وعند زاوية نحو العينين. استخدام forcep # 3 لإزالة بلطف فروة الرأس عن طريق تقشير أفقيا، وفضح الجمجمة.
  3. باستخدام forcep # 3، وإزالة بلطف النسيج الضام في قاعدةالرأس. عندما يتعرض قاعدة الجمجمة الجمجمة، وفتح بعناية من قبل خيوط ذراع واحدة من forcep في ما بين الدماغ والجمجمة (بعد الشق بين نصفي المخ)؛ قبضة؛ برفق الجمجمة صعودا لتمزيق مفتوحة.
  4. تعطيل النسيج الضام تحت الجانب البطنية من الدماغ باستخدام forcep رقم 1، وبعد إزالة الدماغ باستخدام نفس الأداة. رفع الدماغ من الجمجمة باستخدام القوة التصاعدي تحت الجانب البطني من الدماغ.
  5. إبقاء المخ في موقفها التشريحية: الجانب الظهري متجهة لأعلى لتصور القشور تحت المجهر تشريح؛ تأمين الدماغ في المكان عن طريق إدراج نصائح من الملقط في تقاطع الدماغ المتوسط ​​والقشرة، وإزالة السحايا القشرية تماما مع forcep رقم 4، ثم الشروع في إزالة السحايا بطني. مرة واحدة وقد تم السحايا إزالتها تماما، فصل القشور عن بقية الدماغ باستخدام forcep رقم 4. ومن الضروري إزالة الأنسجة السحائي لتعظيم نقاء الخلايا الدبقية الصغيرة وyielد.

3. نسيج الدماغ الثرم

  1. القشور نقل إلى معدة مسبقا تنميق الطبق، ومواصلة تنميق خطوة باستخدام تقنية معقمة في الدرجة الثانية السلامة البيولوجية مجلس الوزراء.
  2. اللحم المفروم أنسجة المخ باستخدام مقص # 3، ونقل الأنسجة المفروم إلى 15 مل أنبوب مخروطي؛ شطف مقص وتنميق الطبق مع 1 مل من كل MM، وجمع والاستغناء يشطف في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على الأنسجة المفروم وهذه الخطوة شطف تعظيم العائد من الخلايا الدبقية الصغيرة عن طريق ضمان أن يتم نقل جميع الأنسجة المتبقية لأنبوب مخروطي. ترك التعليق الأنسجة دون عائق لمدة 1-2 دقيقة، مما يسمح الأنسجة المفروم ليغلق على مستوى الجزء السفلي من الأنبوب. لا تتجاوز 2 دقيقة كما MM لا يحتوي على العناصر الغذائية الأساسية.
  3. إزالة بعناية وتجاهل 2 مل من طاف مع عام 1000 ميكرولتر micropipettor مع طرف ماصة القياسية، والتأكد من عدم تعطيل استقر الأنسجة المفروم. إضافة 3 مل من MCM إلى الأنسجة المفروم؛ يسحن الأنسجة بكل قوة باستخدام عام 1000 ميكرولتر micropipettor مع طرف ماصة القياسية لا ملحوظ الأنسجة الصلبة ينبغي أن يظل عند سحن كاملة. إضافة 3 مل أخرى من MCM مع نفس ماصة، وجمع عينة المسحوقة المتبقية من غيض ماصة.

4. تزايد الخلايا القشرية

  1. الطرد المركزي الأنسجة المفروم لتكوير الخلايا (215 x ج؛ 5 دقائق؛ RT؛ الطرد المركزي السريرية مع يتأرجح دلو الدوار). العودة الخلايا مكعبات لمجلس الوزراء السلامة البيولوجية، وإزالة وتجاهل طاف؛ resuspend بلطف بيليه الخلية (2 مل / أنبوب؛ MCM)؛ إضافة إعادة تعليق الخلية إلى معدة مسبقا T-75 قارورة؛ قبعة القارورة ووضعه أفقيا إلى ترطيب، ومعيار نسيج الثقافة الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2). تسمح للخلايا لاحتضان لمدة 24 ساعة.
  2. بعد 24 ساعة، اضغط برفق القارورة ضد كف اليد لتعطيلالحطام الأنسجة. تحقق الخلايا قبل وبعد التنصت لضمان إزالة كاملة من الحطام. مجموعة قارورة العمودي، وإزالة وتجاهل وسائل الإعلام، إضافة MCM جديدة إلى الجزء السفلي من القارورة (12 مل و 37 درجة مئوية)؛ قبعة ووضع مرة أخرى في الحاضنة، أفقيا.
  3. تحقق الخلايا اليومية للتلوث ورصد النمو.
  4. في حوالي 17-21 أيام في المختبر (DIV)، وخلايا دبقية تكون جاهزة للحصاد من ثقافة الدبقية مختلطة. لتحديد ما إذا الخلايا جاهزة، ودراسة الخلايا تحت المجهر المرحلة على النقيض المقلوب. الخلايا الدبقية الصغيرة هي جاهزة للحصاد عندما في ~ 40٪ confluency. كما تظهر خلايا كروية صغيرة، ومشرق، وتزايد كما أحادي الطبقة على رأس الدبقية الأخرى.

5. عزل الخلايا الدبقية الصغيرة المختلطة من الدبقية الثقافة

  1. لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة، اضغط بقوة ضد قارورة مقاعد البدلاء المختبر. هذا التحريض يساعد الخلايا الدبقية الصغيرة منفصلة من الخلايا الدبقية الأخرى ويرجع ذلك إلى خصائص منخفضة تمسك الخلايا الدبقية الصغيرة.
  2. لا تسمح للخلايا أن يهز لمدة أطول من 5 ساعة تفقد البصر. رفعت أن الخلايا الدبقية الصغيرة قبالة سطح القارورة بعد 5 ساعة، وذلك باستخدام المجهر المرحلة على النقيض المقلوب. الخلايا الدبقية الصغيرة مشرقة، كروية، التعويم الحر الخلايا. وسوف يكون هناك طبقة من الخلايا النجمية المتبقية و oligodendrocytes التمسك السفلي من القارورة.
  3. جمع وسائل الإعلام التي تحتوي على الخلايا الدبقية الصغيرة طاف في أنبوب الطرد المركزي المخروطية العقيمة؛ بيليه الخلايا الدبقية الصغيرة (215 x ج؛ 5 دقائق؛ يتأرجح دلو الدوار).
  4. resuspend الكرية دبقية في الحارة دبقية متوسطة النمو (MGM؛ MEM تستكمل مع: 1 ملي البيروفات الصوديوم، و 0.6٪ ت / vglucose، 1 ملم L-الجلوتامين، و 100 ميكروغرام / مل P / S، 5٪ ت / ت FBS؛ ~ 2 مل / قارورة)، تحديد تركيز خلية باستخدام عدادة الكريات، وطبق 1 × 10 5 خلية / جيدا في شكل 24 لوحة جيدا علىالبلاستيك أو العقيمة زلات غطاء زجاجي (500 ميكرولتر / جيد؛ MGM). عن طريق هذا الإجراء ومتوسط ​​العائد الخلايا الدبقية الصغيرة هو 7.5 × 10 5 خلية / الجرو القشرة.
  5. 24 ساعة بعد الطلاء، وإزالة كافة وسائل الإعلام والخلايا refeed مع MGM الطازجة (37 درجة مئوية) لإزالة الخلايا العائمة والحطام. هذه الخطوة حاسمة لبقاء الخلايا والحفاظ على الخلايا الدبقية الصغيرة هادئة. يمكن استخدام الخلايا لإجراء التجارب فورا بعد إعادة التغذية.

6. العلاجات سبيل المثال

  1. تعرض الخلايا إلى 10 نانوغرام / مل من بام 3 CSK 4 (بام)، و 10 نانوغرام / مل عديد السكاريد الشحمي (LPS) أو السيطرة على السيارة؛ احتضان لمدة 2 أو 24 ساعة في حاضنة ترطيب (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2).

7. تحليل الخلايا الدبقية الصغيرة لوظائف خارج الحي عبر مناعي التصوير وكيمياء سيتولوجية مناعية

  1. بعد العلاج، وسائل الإعلام والثقافة الخلية الحصاد في أنابيب microfuge (1.5 مل) والمركifuge باستخدام ميكروسنتريفوج الطاولة (2 دقيقة؛ 900 x ج) لمسح وسائل الإعلام. نقل طاف لأنبوب microfuge النظيفة؛ مقايسة على الفور، أو تخزينها في -20 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام. تحليل تركيز TNF-α في خلية ثقافة طاف عبر المتاحة تجاريا الماوس α TNF ELISA عدة.
  2. غسل الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، وإصلاح الخلايا مع 4٪ (ث / ت) بارافورمالدهيد / 4٪ (ث / ت) السكروز / PBS درجة الحموضة 7.4 (4٪ PFA؛ 15 دقيقة؛ RT). بعد التثبيت، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق مع طيف والهز على شاكر المداري.
    1. المناعي / كيمياء سيتولوجية مناعية. بعد التثبيت وPBS يغسل، عملية الخلايا الدبقية الصغيرة للكيمياء سيتولوجية مناعية. جميع الخطوات التي أجريت مع الهز لطيف. Permeabilize الخلايا في PBS/0.1٪ تريتون X-100؛ خلايا كتلة في PBS/10٪ مصل الماعز العادي لمدة ساعة واحدة. احتضان الخلايا O / N عند 4 درجة مئوية مع أرنب المضادة للNF كيلوبايت الأجسام المضادة (P65 الوحيدات؛ 1/1، 250) أو أرنب المضادة للإيبا-1 الأضداد (1/750) في عرقلة العازلة. مرئيإيزي مستضد: مجمع الأضداد التالية الحضانة مع الماعز مترافق fluorescently المضادة للأرنب مفتش الأضداد الثانوية (1 ساعة؛ 1/1، 000). إزالة الأجسام المضادة الثانوية غير منضم عن طريق الغسيل مع PBS/0.1٪ تريتون X-100 (3X 5 دقائق).
    2. خلايا مكافحة وصمة عار مع 4 '،6-Diamidino-2-Phenylindole / برنامج تلفزيوني (دابي؛ 0.1 ميكروغرام / مل). لتصور كل نواة الخلية المستمدة من الخلايا الدبقية الصغيرة CX3CR1-GFP + / - الفئران التعبير عن GFP. الاستفادة من الطول الموجي 350 نانومتر مرشح لتصور دابي؛ 488 نانومتر مرشح الطول الموجي لتصور GFP؛ و594 نانومتر الطول الموجي مرشح لتصور وP65-1 إيبا immunocomplexes.
  3. جبل غطاء ينزلق باستخدام محلول مائي التركيب وتصور الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام المجهر الفلورسنت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الإبقاء على نمط ظاهري مناعي وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة فيفو السابقين خلال العزلة أمر بالغ الأهمية لتكون قادرة على الاستفادة من هذه الخلايا لتكون نموذجا للبيولوجيا دبقية التحقيق. من أجل إظهار المحافظة الناجح الخلايا الدبقية الصغيرة immunofunctionality باستخدام طريقة الحاضر، ونحن عزل الخلايا الدبقية الصغيرة القشرية من حديثي الولادة P3 (CX3CR1-GFP + / - وC57BL / 6) وتعامل مع الثقافات إما LPS أو بام.

كما هو موضح في الشكل 1A، عزل الخلايا الدبقية الصغيرة عبر التحريض من خلال الهز الدوارة يحافظ على النمط الظاهري هادئة تنسب إلى الخلايا الدبقية الصغيرة في الحالات العادية في الجسم الحي الظروف. لتقييم نقاء دبقية، CX3CR1-GFP + / - كانت ملطخة الثقافات خلية للمستضد بلعم إيبا-1 ومكافحة ملطخة دابي من أجل تصور نواة الخلية. كما هو مبين في أرقام 1A و 1B، في ظل تضخم منخفضة، والخلايا الدبقية الصغيرة العزلة عبر بريسيوصف ntly نتائج الأسلوب في خلية ثقافة نقية للغاية، وأكبر من 95٪ من الخلايا تظهر colocalization من GFP، إيبا-1، ودابي.

سعينا المقبل لتأكيد استجابة الخلايا الدبقية الصغيرة فيفو السابقين من خلال تحدي الخلايا مع LPS. بالمقارنة مع العلاج السيارة، LPS المعاملة CX3CR1-GFP + / - الخلايا الدبقية الصغيرة تكييفها تغيير المورفولوجية صارخ من، النمط الظاهري القطبين الصغيرة إلى شكل يشبه أميبية، كما هو مبين في الشكل 1B ولخص هذا التغيير الصرفي أيضا في الخلايا الدبقية الصغيرة القشرية معزولة من C57BL / 6 الولدان تعامل مع بام (الشكل 2). هذا الرد المورفولوجية حفظها بين الخلايا الدبقية الصغيرة متميزة وراثيا، وتفعيلها مع محفزات مختلفة، تؤكد على التكاثر وتطبيق هذا البروتوكول في ما يخص نماذج تجريبية مختلفة.

على الرغم من هذا التغيير في التشكل يدل على التنشيط 39، فمن الضروري أن دetermine إذا الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة من قبل الدوارة تهز الاحتفاظ قدرتها على نقل من P65 على تفعيل، مما يدل على الحفاظ على وظيفية TLR بوساطة الإشارات بين الخلايا. لتأكيد هذا تتالي إشارات، كنا نعامل والخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة من C57BL / 6 الولدان المصابين بام. كما هو موضح في الشكل 2، وتلطيخ immunocytochemical لP65 يتضح أنه في ظل الظروف العادية، يكون موضعيا P65 منتشرة في جميع أنحاء السيتوبلازم، بينما بعد التحفيز 2 ساعة مع بام، P65 مناعية تحول بشكل كبير التعريب إلى نواة الخلية.

بعد أن ثبت أن الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة عن طريق الطريقة المعروضة هنا الحفاظ على الآليات الجزيئية للنقل من P65 إلى النواة، أردنا المقبل للتأكد من أن الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة الاحتفاظ بهم immunofunctionality البيوكيميائية عن طريق اختبار قدرتها على إفراز proinflammatory سايتوكاين السمة المميزة، TNF-α، بناء على التنشيط . كما هو موضح في الشكل (3)، فيبالمقارنة مع المعالجة السيارة الخلايا الدبقية الصغيرة، وخلايا تتعرض لبام أو LPS زيادة إفراز TNF-α في وسائل الإعلام والثقافة (P <0.0001؛ في اتجاه واحد أنوفا)، مما يدل على وظيفية TLR1 / 2 andTLR4 مسارات الإشارات، على التوالي.

لذا أخذت معا، وهذه البيانات تثبت أن عزل الخلايا الدبقية الصغيرة عبر نتائج تهز الدوارة في مزارع الخلايا نقية للغاية مع الحفاظ على نمط ظاهري مناعي وظائف، فيفو السابقين.

الشكل 1
تم عزل الرقم 1 الروتاري تهز عوائد عالية النقاء الثقافات دبقية مع نمط ظاهري مناعي الحفاظ على خلايا دبقية من CX3CR1-GFP + / - الفئران المواليد في P3 وتعامل مع السيارة إما (A)، أو LPS البكتيرية (B) لمدة 24 ساعة.تم إصلاح الخلايا مع PFA 4٪، ملطخة immunocytochemically للإيبا-1، ومكافحة ملطخة دابي. (أ) الخلايا الدبقية الصغيرة التعامل مع برنامج تلفزيوني المعرض على القطبين، النمط الظاهري هادئة. (ب) عند التحدي LPS، الخلايا الدبقية الصغيرة التكيف مع النمط الظاهري مثل أميبية، مما يدل على التنشيط. قناة اندمجت في لوحات (A) و (B) تحت 10X التكبير إثبات أن> 95٪ من الخلايا هي الخلايا إيجابية GFP/Iba-1. 10X نطاق شريط: 100 ميكرومتر؛ 40X نطاق شريط: 20 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 2
الشكل 2. الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة عبر الدوارة تهز نقل من NF كيلوبايت إلى الخلية نواة عليه بام تشاllenge. تم عزل خلايا دبقية من C57BL / 6 حديثي الولادة في P3 وتعامل مع السيارة أو بام لمدة 2 ساعة. تم إصلاح الخلايا مع PFA 4٪ والملون لP65 عبر مناعية. كانت ملطخة الخلايا مواجهة مع دابي لتصور نواة الخلية. في السيارة تعامل الخلايا الدبقية الصغيرة، المترجمة P65 في جميع أنحاء السيتوبلازم، في حين أن التحفيز مع بام الحث على إزفاء النووية من P65. 40X نطاق شريط: 20 ميكرون اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 3
الرقم 3. الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة مع دوارة تهز الإفراج TNF-α عند التعرض للبام أو LPS. تم عزل خلايا دبقية من C57BL / 6 الفئران حديثي الولادة في P3 وتعامل مع السيارة، بام، أو LPS لمدة 2 ساعة. تم جمع supernatants ثقافة الخلية وتحليلها عن طريق ELISA لاطلاق TNF-α. *** P <0.0001 (ن = 2؛ في اتجاه واحد أنوفا). يتم عرض البيانات كما يعني ± SD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوفر الإجراء الحالي وسيلة فعالة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة القشرية من الفئران حديثي الولادة. هذا الإجراء له فائدة شقين من 1) الحفاظ على نمط ظاهري مناعي الخلايا الدبقية الصغيرة وظيفة، على النحو الذي يحدده التصوير الفلورسنت، كيمياء سيتولوجية مناعية، وإليسا، و، 2) السماح الخلايا الدبقية الصغيرة إلى أن تنضج في وجود خلايا الدبقية الأخرى (الخلايا النجمية وoligodentrocytes) قبل العزلة، التي قد تسهل مهمة التفاعلات خلية خلية أثناء فترة نضوج الثقافة الدبقية. الأهم من ذلك، أظهرت الخلايا المعزولة قابلية عالية والتوحيد مع الحفاظ على وظيفة ونمط ظاهري مناعي فيفو السابقين.

هناك العديد من الخطوات التي يجب القيام بها مع الاهتمام والعناية خاصة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة الناجح مع أعلى نقاء والمحصول. هذه الخطوات هي: 1) الحفاظ على عقيمة، والثقافة الصحية في جميع أنحاء الداخلي التجريب كامل؛ 2) إزالة جميع السحايا من مجلس النواباملمارسات أثناء تسليخ مجهري؛ 3) غسل الصحيح من تنميق لوحة ومقص بعد تنميق القشور؛ 4) مليون متر مكعب في توازنه T-75 قوارير في حاضنة قبل البدء تسليخ مجهري؛ 5) إعادة التغذية 24 ساعة بعد العزلة.

منذ الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية مقيم في الجهاز العصبي المركزي، فهي تستجيب للغاية إلى الشتائم البيئية. وبالتالي، وتجنب التلوث الثقافة مع وكلاء المسببة للأمراض أمر بالغ الأهمية للحفاظ على سمات immunophenotypic والوظيفية للخلايا دبقية هادئة. التفتيش اليومي من الخلايا لرصد التلوث والنمو جزء لا يتجزأ من تجنب الثقافات خلية للخطر واكتساب فهم أفضل لمعدل النمو دبقية. وعلاوة على ذلك، فمن الضروري لتحديث MGM-24 ساعة آخر الطلاء من الخلايا الدبقية الصغيرة من أجل الحفاظ على بقاء الخلية وظيفة.

والعقبة الرئيسية في التغلب على عزل الخلايا الدبقية الصغيرة هو التأكد من أن الأنسجة CNS مفروم خالية من الخلايا البطانية، والتي،إذا كان موجودا، يمكن أن تعوق انتشار دبقية من خلال تشكيل مستعمرات كثيفة في الثقافات الدبقية. لهذا السبب، من المهم جدا لإزالة تماما السحايا CNS أثناء تسليخ مجهري من الدماغ. في تجربتنا، يتم إزالة السحايا من حديثي الولادة P3 مع سهولة أكبر من حديثي الولادة P1، والأنسجة أكثر تطورا وأسهل للتصور تحت المجهر تشريح. بالإضافة إلى ذلك، فمن المهم تجنب ترطيب الجانب الظهري من المخ مع DM بعد إزالة الدماغ من الجمجمة. ويمكن أن يتم ذلك من خلال الحفاظ على الدماغ في موقف التشريحية (حتى الجانب الظهري) عند نقلها إلى DM. الحفاظ على الجانب الظهري للجفاف الدماغ يسمح لتحسين التصور وإزالة أسهل من السحايا.

وقد وجدنا أن الطريقة الأكثر فعالية لإزالة السحايا هو لادخال قوة # 4 في الجزء الخلفي من معظم الشق بين نصفي المخ، وقشر السحايا قبالة، أفقيا. مرة واحدة وقد تم تطهير السحايا الظهرية، ونحن ثم ريمولقد السحايا البطني بواسطة قلب الدماغ (الجانب البطني متابعة)، واستيعاب بلطف بصيلات الشم وتقشير مرة أخرى نحو الجزء الخلفي من الدماغ. نحن ثم إزالة أي نوع من الأنسجة المتبقية السحائي البطني عن طريق تقشير بلطف ونتف الريش في الحركة الجانبية. فصل لاحق من القشرة عن بقية الدماغ أمر حاسم لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة فقط القشرية. الإجراء المفصلة هنا هو أيضا مرنة من حيث أنه يمكن استخدامها لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة من المناطق تحت القشرية، كذلك. رغم ذلك، من المهم أن نلاحظ أن العائد الخلية قد تكون أقل نظرا لتباين كثافة الخلايا الدبقية الصغيرة غير مبال مناطق الدماغ cytoarchitectural 40.

لقد وجدنا أن لتعظيم العائد النهائي من الخلايا الدبقية الصغيرة من المهم لشطف وجمع شطف من المواد المستخدمة في العملية تنميق. هذه يشطف ضمان مجموعة كاملة من جميع الأنسجة المتبقية قد ظلت على مقص تنميق، طبق بيتري، وماصةتلميح تستخدم لقسامة الأنسجة المفروم في أنبوب مخروطي. فمن المهم أن هذه يشطف تجري مباشرة بعد نقل الأنسجة CNS المفروم إلى أنبوب مخروطي الشكل، لتحسين بقاء الخلية. فمن الأهمية بمكان أن بقاء الخلية أن الخلايا لا البقاء في MM لفترة أطول من 2 دقيقة منذ MM يخلو من المواد الغذائية الأساسية أيضا.

أخيرا، لا بد من إعداد T-75 قوارير مع MCM ووضعها في حاضنة ترطيب (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2) قبل البدء في بروتوكول تسليخ مجهري. ثيت-75 قارورة لديه بطانة مسامية تحت غطاء من أن يسمح لتبادل الغازات، وتسهيل موازنة وسائل الإعلام قبل إضافة الثقافات الدبقية مختلطة. وقد وجدنا أن عدم القيام بذلك يؤدي إلى الحصاد دبقية الأمثل. من المهم أيضا لختم غطاء قارورة T-75 مع parafilm قبل وضع القارورة على شاكر دوارة من أجل تقليل تبادل الغازات داخل وخارج القارورة في حين تناوب.

5 خلية / الجرو القشرة) من أساليب ذكرت سابقا باستخدام الإنزيمات الهضمية و / أو Percoll التدرج (CNS 3-5 × 10 5 خلية / كاملة) 30،33،34. كما يتضح من التصوير الفلورسنت، كيمياء سيتولوجية مناعية، وإليسا، والخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة عن طريق هذا الإجراء هي قادرة على تمر ردود المورفولوجية والبيوكيميائية عند تعرضها للمؤثرات المناعية مثل بام وLPS. وبالتالي، فإن الإجراء الموصوفة هنا يوفر المنهج التجريبي من التحقيق البيولوجيا دبقية في فيفو السابقين الظروف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب الذي أجري البحث في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن أن يفسر على أنه تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل معهد علوم الصحة البيئية R01ES014470 (KMZ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucose Sigma G8270 Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 °C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM.
Sodium pyruvate 100 mM (100x) Hyclone SH30239.01 Store at 4 °C. Used to make MCM and MGM.
Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x) Gibco 15140-122 Store at -20 °C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM.
L-Glutamine 200 mM (100x) Gibco 25030-081 Store at -20 °C. Used to make MCM and MGM.
Fetal Bovine Serum (Defined) Hyclone SH30070.03 Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM.
Minimum Essential Medium Earle's (MEM) Cellgro 15-010-CV Without L-glutamine. Contains Earle's salts. Used to make MCM, MGM, and DM.
Horse Serum Gibco 16050 Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM.
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Cellgro 21-021-CV Without calcium and magnesium. Store at 4 °C. Used to make MM.
HEPES 1 M Gibco 15630-031 Store at 4 °C. Used to make MM.
T-75 Flask Corning 430641
4',6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI) Invitrogen D3571 Used to stain cell nucleus.
Rabbit anti-Iba1 Wako 019-19741 Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1. 
Rabbit anti-NFκB (p65) Abcam 7970 Used at 1/1,250 dilution for ICC staining for p65.
Alexa Fluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Invitrogen A11012 Used at 1/1,000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC.
10 ml Disposable Serological Pipet Fisher Scientific 13-678-11E
50 ml Disposable Centrifuge Tube Fisher Scientific 05-539-8
15 ml Disposible Centrifuge Tube Fisher Scientific 05-539-12
Sterile Polystyrene Petri Dish Fisher Scientific 875713 100 mm x 15 mm
Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1) Roboz Surgical RS-6010 1; 5 in; used for removing head
Scissor: Vannas
(scissor #2)
Fine Science Tools 15000-08 1; nonangled; 2.5 mm cutting edge; used to open scalp
Scissor: Student Vannas (scissor #3) Fine Science Tools 91501-09 1; curved; used to mince brain tissue
Forcep: Dumont #7
(forcep #1)
Fine Science Tools 91197-00 2; used to secure nose and remove cortices 
Forcep: Dumont #2
(forcep #2)
Fine Science Tools 11223-20 1; used to remove scalp
Forcep: Dumont #3
(forcep #3)
Fine Science Tools 11231-30 1; used to remove skull
Forcep: Dumont #5a
(forcep #4)
Fine Science Tools 11253-21 1; used to remove meninges
Table of Specific Equipment
Zoom Stereo Dissection Microscope  Olympus SZ4060 Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet
Laminar-Horizontal Flow Cabinet Nuaire NU-201-330
Biological Safety Cabinet Labconco 3440001 Class II
Water-Jacketed CO2 Incubator VWR 97025-836 Set to 37 °C, 5% CO2
Swing-out buckets Fisher Scientific 75006441 To be used with Swing-out rotor
Swing-out Rotor Fisher Scientific 75006445 Max Radius: 19.2 (cm)
Sorvall Legend RT+ Centrifuge
(clinical centrifuge)
Fisher Scientific 75-004-377 With swing-out rotor
AccuSpin Micro 17 microcentrifuge
(tabletop microcentrifuge)
Fisher Scientific S98645 With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524)  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ranshoff, R. M. P. V. H. Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
  2. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39, 151-170 (1990).
  3. Gomez Perdiguero, E., Schulz, C., Geissmann, F. Development and homeostasis of "resident" myeloid cells: The case of the microglia. Glia. 61, 112-120 (2013).
  4. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat. Neurosci. 16, 273-280 (2013).
  5. Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nature reviews. Immunology. , 11-775 (2011).
  6. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
  7. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
  8. Hu, S., et al. Cytokine and free radical production by porcine microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 78, 93-96 (1996).
  9. Muzio, M., Polentarutti, N., Bosisio, D., Prahladan, M. K., Mantovani, A. Toll-like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially expressed and regulated by different leukocytes. J. Leukocyte Biol. 67, 450-456 (2000).
  10. Lee, S. J., Lee, S. Toll-like receptors and inflammation in the CNS. Curr. Drug Targets. Inflamm. Allergy. 1, 181-191 (2002).
  11. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8, 57-69 (2007).
  12. Halle, A., et al. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta. Nat. Immunol. 9, 857-865 (2008).
  13. Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
  14. Duewell, P., et al. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals. Nature. 464, 1357-1361 (2010).
  15. Stewart, C. R., et al. CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4. 11, 155-161 (2010).
  16. Beraud, D., et al. alpha-Synuclein Alters Toll-Like Receptor Expression. Front. Neurosci. 5, 80 (2011).
  17. Banati, R. B., Gehrmann, J., Schubert, P., Kreutzberg, G. W. Cytotoxicity of microglia. Glia. 7, 111-118 (1993).
  18. Combs, C. K., Karlo, J. C., Kao, S. C., Landreth, G. E. beta-Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNF alpha-dependent expression of induciblenitric oxide synthase and neuronal apoptosis. J. Neurosci. 21, 1179-1188 (2001).
  19. Kim, Y. S., Joh, T. H. Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the pathogenesis of Parkinson's disease. Exp. Mol. Med. 38, 333-347 (2006).
  20. Colton, C., Wilcock, D. M. Assessing activation states in microglia. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 174-191 (2010).
  21. Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Ceramide activates microglia to enhance the production/secretion of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) without induction of deleterious factors in vitro. J. Neurochem. 80, 697-705 (2002).
  22. Uesugi, M., Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Nonparticipation of nuclear factor kappa B (NFkappaB) in the signaling cascade of c-JunN-terminal kinase (JNK)- and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)-dependent tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) induction in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated microglia. Brain Res. , 1073-1074 (2006).
  23. Beraud, D., et al. Microglial Activation and Antioxidant Responses Induced by the Parkinson's Disease Protein alpha-Synuclein. J. Neuroimmun. Pharmacol. 8, 94-117 (2013).
  24. Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease. Neurobiol. Aging. 29, 1690-1701 (2008).
  25. Minghetti, L., Levi, G. Microglia as effector cells in brain damage and repair: focus on prostanoids and nitric oxide. Prog. Neurobiol. 54, 99-125 (1998).
  26. Hirsch, E. C. Glial cells and Parkinson's disease. J. Neurol.. 247 (2), 58-62 (2000).
  27. Liu, B., et al. Role of nitric oxide in inflammation-mediated neurodegeneration. Ann. NY Acad. Sci. 962, 318-331 (2002).
  28. Shie, F. S., Nivison, M., Hsu, P. C., Montine, T. J. Modulation of microglialinnate immunity in Alzheimer's disease by activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Curr. Med. Chem. 16, 643-651 (2009).
  29. Rogers, J., Mastroeni, D., Leonard, B., Joyce, J., Grover, A. Neuroinflammation in Alzheimer's disease and Parkinson's disease: are microglia pathogenic in either disorder. Int. Rev. Neurobiol. 82, 235-246 (2007).
  30. Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murinemicroglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
  31. Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
  32. Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression. J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).
  33. Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J. Vis. Exp. , (2011).
  34. Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation. J. Vis. Exp. , (2012).
  35. Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity. Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).
  36. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
  37. Imai, T., et al. Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion. Cell. 91, 521-530 (1997).
  38. Cardona, A. E., et al. Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor. Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).
  39. Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).
  40. Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).

Tags

علم المناعة، العدد 83، neuroinflammation، السيتوكينات، تنكس عصبي، LPS، Pam3CSK4، TLRs، PAMPs، DAMPs
عزل الخلايا الدبقية الصغيرة القشرية مع نمط ظاهري مناعي المحفوظة وظيفة من الفئران حديثي الولادة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Daniele, S. G., Edwards, A. A.,More

Daniele, S. G., Edwards, A. A., Maguire-Zeiss, K. A. Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates. J. Vis. Exp. (83), e51005, doi:10.3791/51005 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter