Summary
Een sleutel tot succesvolle onderzoek van microglia biologie is het behoud van microglia immunofunction ex vivo tijdens isolatie van CZS-weefsel. Isoleren microglia via roterende schudden resulteert in zeer zuivere en immunofunctional celculturen zoals beoordeeld door fluorescerende beeldvorming, immunocytochemie, en ELISA na microglia-activatie met de pro-inflammatoire stimuli lipopolysaccharide (LPS) en Pam 3 CSK 4 (Pam).
Abstract
Isolatie van microglia van CZS-weefsel is een krachtig onderzoeksinstrument gebruikt om microglia biologie studeren ex vivo. De huidige methode Gegevens van een procedure voor de isolatie van microglia van neonatale muizen cortex door mechanisch roeren met een roterende schudder. Dit microglia isolatie methode levert zeer zuiver corticale microglia dat morfologische en functionele kenmerken wijzen op latente microglia in normale, nonpathological condities in vivo vertonen. Deze procedure bewaart ook de microgliale immunofenotype en biochemische functies zoals blijkt uit de inductie van morfologische veranderingen, nucleaire translocatie van de p65 subeenheid van NF-kB (p65), en secretie van de pro-inflammatoire cytokine kenmerk, tumornecrosefactor-α (TNF-α ), na lipopolysaccharide (LPS) en Pam 3 CSK 4 (Pam) uitdagingen. Daarom is de huidige isolatie procedure behoudt de immunofenotype van zowel latente en actikeld microglia, die een experimentele methode van onderzoek microglia biologie in ex vivo omstandigheden.
Introduction
Microgliacellen, het toezicht macrofagen van het CZS parenchym, omvatten ongeveer 12% van de totale celpopulatie van de volwassen hersenen van zoogdieren. Microglia zijn afgeleid uit dooierzak myeloïde voorlopercellen en variëren in celdichtheid en morfologie in verschillende cytoarchitectural gebieden binnen de volwassen CZS 1-5. In een gezonde volwassen brein, microglia zijn kleine, vertakte of polaire cellen met fijne, dynamische processen. In tegenstelling tot perifere macrofagen morfologie, microglia tonen een rustige, low-profile fenotype in gezonde hersenen die kunnen worden weergegeven als cellulaire inactiviteit, maar in vivo imaging studies tonen aan dat microglia processen dynamisch en uitschuiven om hun micro-omgeving te controleren op een manier die doet denken aan " bemonstering en landmeetkundige "6,7.
Microglia en zijn zeer verschillend reageren op milieu en pathofysiologische veranderingen in de hersenen, switchingeen toezichthouder van een effector-staat algemeen beschouwd als de rustende en geactiveerde toestanden, respectievelijk. Deze schakelaar activering kan worden gemedieerd door aangrijping van membraangebonden patroonherkenning receptoren (PRRS), zoals toll-like receptoren (TLR's), die beantwoorden aan pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs), namelijk bacteriële-en virale afgeleide lipoproteïnen , nucleïnezuren en koolhydraten 8-11. Naast PAMPs zijn PRRS ook aangetoond dat microglia activatie induceren tegen steriel, niet-pathogene moleculen, bekend als gevaar / beschadiging geassocieerde moleculaire patronen (gedempt), die een verstoring in CZS homeostase vertegenwoordigen, zoals cellulaire schade 12-16. Eenmaal geactiveerd, PRRS initiëren een intracellulaire signalerende cascade die leidt tot veranderingen in microgliale cel morfologie en genexpressie, specifiek geactiveerde microglia aan een amoeboid fenotype, verplaatsen de P65 subeenheid NF-kB (p65) naar de celkern, en de upregulate productie en secretie van pro-inflammatoire cytokinen zoals tumornecrosefactor-α (TNF-α), interleukine-1 β (IL-1β), samen met reactieve zuurstof species (ROS) 16-24. Hoewel integraal in de aangeboren immuunrespons van het CZS, zijn deze afgescheiden moleculen ook gevonden neuronale oxidatieve stress te vergroten, waardoor het induceren en verergeren neurodegeneratie in zieke toestanden zoals Parkinson en Alzheimer 25-29.
Echter, de mechanismen van microgliale activering in pathologische toestanden niet volledig begrepen. Daarom isolatie van microglia is een krachtig onderzoeksinstrument in deze biologische processen, zoals velen in vivo functies van microglia activatie kan worden samengevat in de cultuur. Verschillende methoden beschikbaar voor het isoleren van microglia, waaronder isolatie via een Percoll gradiënt na enzymatische afbraak van CZS weefsel 30,31. Echter, enzymatische digestie veranderenhet immunofenotype van de cellen door het verminderen celoppervlak antigeen-expressie 32 en resulteert in lagere cel opbrengst per dier dan de hierin beschreven werkwijze. Specifiek, melden wij een gemiddelde microglia opbrengst per pup cortex van 7,5 x 10 5 cellen, terwijl eerder gemeld isolatie methoden uit geheel CNS via een Percoll gradiënt opbrengst 3-5 x 10 5 cellen 30,33,34. De huidige procedure omzeilt het gebruik van de spijsvertering enzymen door het isoleren van microglia op basis van hun lage-aanhankelijkheid eigenschappen, waardoor de microglia immunofenotype en functionaliteit behoud.
In deze studie beschrijven we de isolatie van microgliale cellen uit gemengde gliale kweken afgeleid van neonatale heterozygote CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -) en C57BL / 6 muizen cortex door mechanische agitatie op een roterende schudder, een uitbreiding van eerder gepubliceerd methode 24,35. We maken gebruik van de voormalige muizenstam voor eenvoudige visualisatie van microglia, zoalsDeze muizen brengen GFP onder de controle van de endogene locus CX3CR1 - een monocyt-specifieke promotor 36-38. Deze werkwijze levert zeer zuiver microgliale kweken met een behouden immunofe ex vivo zoals blijkt uit morfologische veranderingen, nucleaire translocatie van p65 en uitscheiding van TNF-α bij provocatie met bacteriële lipopolysaccharide (LPS) of Pam 3 CSK 4, TLR4 en TLR1 / 2 agonisten respectievelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voorafgaand aan de start van dit protocol, verzamelen neonatale muizen op postnatale dagen 1-3 (P1-3) in een steriele container genest met originele kooi beddengoed voor bescherming en warmte. Het is belangrijk om snel en efficiënt te werken door middel van dit protocol om microglia opbrengst te optimaliseren. Zie tabel 1 voor volledige reagenslijst.
1. Voorbereiding van de instrumenten, Cultuur Media en Gerechten
- Bereid 10 ml / pup Microglia compleet medium (MCM; 1x Minimal Essential Medium Earle's [MEM], aangevuld met 1 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, 0,6% v / v D-(+)-glucose, 100 ug / ml penicilline / streptomycine (P / S), 4% v / v foetaal runderserum (FBS), 6% v / v paardenserum) en aan elke T-75 kolf (kolf 1 / pup), cap en plaats horizontaal in een incubator (37 ° C, 5% CO2) om de temperatuur gedurende 1 uur. Essentieel is dit media equilibreren kolf (s) voordat de dissectie.
- Prepare, hoeveelheid, en warm in de 37 ° C waterbad MCM voor dissectie (6 ml / pup) en in een aparte conische buis MCM voor mobiele resuspensie (2 ml / pup). Bereiden, portie, en chillen op het ijs Mincing Media (MM; HBSS aangevuld met: 100 ug / ml P / S, 0,01 M HEPES, 3 ml / pup), en ontleden Media (DM; MEM aangevuld met 100 ug / ml P / S, 2 ml / pup).
- Steriliseer de volgende chirurgische instrumenten door onderdompeling in 70% ethanol gedurende 10 min: schaar # 1 (1, tot onthoofden), pincet # 1 (2, te beveiligen neus en verwijder cortices), schaar # 2 (1, nonangled, open hoofdhuid ), pincet # 2 (1, om de hoofdhuid te verwijderen), pincet # 3 (1, om de schedel te verwijderen), pincet # 4 (2; tot hersenvliezen te verwijderen), schaar # 3 (1; om hersenweefsel blad voor de mond). Laat aan de lucht drogen op een steriel gaasje.
- Veeg de horizontale luchtstroom werkstation en dissectie microscoop met 70% ethanol.
- Doseer DM in 2 steriele, 100 mm petrischalen voor het vastleggen van het hoofd (3 ml; 1 schotel / 3 pups) en dissectie (1 ml;1 schotel / pup; gekoeld op ijs voorafgaand aan dissectie). Doseer MM in 1 steriel, 100 mm petrischaal voor hakken hersenweefsel (1 ml; 1 schotel / pup).
2. Brain Tissue Dissection
- Voorafgaand aan euthanasie, zachtjes ontsmetten nek en hoofd van de pup met 70% ethanol met behulp van een lab weefsel. Met een schaar # 1, snel euthanaseren pup door het verwijderen van de kop; capture hoofd in vooraf bereide petrischaal. Euthanaseren en voltooiing van de dissectie van een pup voordat u verder gaat naar het volgende dier.
- Breng het hoofd naar de gekoelde dissectie schotel; onder dissectie microscoop veilig het hoofd door te knijpen de neus met behulp van pincet # 1 (als alternatief, kan het hoofd worden bevestigd door het doorboren van de tang door de oogkas), open hoofdhuid met behulp van schaar # 2 door het creëren van een Y-snede: begin van de basis van het hoofd en schuin naar de ogen. Gebruik pincet # 3 verwijdert op milde wijze de hoofdhuid met het schillen van lateraal, waardoor de schedel.
- Met behulp van pincet # 3, verwijder voorzichtig bindweefsel aan de basis vanhoofd. Als basis van de schedel wordt blootgesteld, zorgvuldig geopend schedel door te rijgen een arm van de tang tussen de hersenen en de schedel (na de interhemisferische spleet), grip, trek de schedel omhoog om openscheuren.
- Verstoren bindweefsel onder ventrale zijde van de hersenen met behulp van pincet # 1, en verwijder vervolgens de hersenen met behulp van dezelfde tool. Til de hersenen uit de schedel door een opwaartse kracht onder de ventrale zijde van de hersenen.
- Bewaar de hersenen in zijn anatomische positie: rugzijde naar boven naar de cortex visualiseren onder de dissectie microscoop, zet de hersenen plaats door het invoegen tips pincetten op de doorsnede van de middenhersenen en de cortex, corticale hersenvliezen volledig te verwijderen met pincet # 4, ga dan naar de ventrale hersenvliezen verwijderen. Zodra de hersenvliezen volledig zijn verwijderd, scheid de cortices van de rest van de hersenen met behulp pincet # 4. Essentieel volledig verwijderen meningeale weefsel microglia zuiverheid en yiel maximaliserend.
3. Brain Tissue Fijnhakken
- Transfer cortex om eerder bereid gehakt schotel; blijven hakken stap met behulp van steriele techniek in de klasse II biologische veiligheid kabinet.
- Hak hersenweefsel met schaar # 3; overdracht gehakt weefsel een 15 ml conische buis;. Spoel schaar en fijnhakken schotel met 1 ml MM elk verzamelen en afzien spoelen in de 15 ml conische buis met gehakt weefsel Deze spoelstap maximaliseert de opbrengst van microglia doordat alle overblijvende weefsel wordt overgebracht naar conische buis. Verlaat weefselsuspensie ongestoord voor 1-2 min, waardoor gehakt weefsel om zich te vestigen aan de onderkant van de buis. Neem niet meer dan 2 min als MM geen essentiële voedingsstoffen bevatten.
- Verwijderen en gooi 2 ml van de bovenstaande met generieke 1000 pi micropipettor met een standaard pipet tip, het maken van bepaalde vaste gehakt-weefsel niet te verstoren zorgvuldig. Voeg 3 ml van MCM de gehakt-weefsel; vermaal het weefsel met volle kracht met behulp van een generieke 1000 ul micropipettor met een standaard pipettip geen waarneembare vast weefsel moet blijven wanneer fijnwrijving is voltooid.. Voeg nog een 3 ml van MCM met dezelfde pipet tip, verzamelen resterende aangewreven monster uit de pipet tip.
4. Groeiende Corticale Cellen
- Centrifugeer het gehakt weefsel cellen (215 xg, 5 min; RT; klinische centrifuge met swingende emmer rotor) neer te slaan. Terug afgedraaid cellen naar de biologische veiligheid kabinet, te verwijderen en gooi het supernatant; voorzichtig resuspendeer de cel pellet (2 ml / buis; MCM), voeg de cel resuspensie aan de eerder bereide T-75 kolf; dop op de fles en plaats het horizontaal in een bevochtigde standaard weefselkweek incubator (37 ° C, 5% CO2). Laat de cellen geïncubeerd gedurende 24 uur.
- Na 24 uur, tik dan zachtjes kolf tegen de palm van de hand te verstorenweefselafval. Controleer cellen voor en na tikken om volledige verwijdering van afval te waarborgen. Set fles verticaal, te verwijderen en gooi media, voeg verse MCM aan de bodem van de kolf (12 ml, 37 ° C); dop en plaats terug in de incubator, horizontaal.
- Controleer cellen dagelijks op vervuiling en groei te volgen.
- Op ongeveer 17-21 dagen in vitro (DIV), zal microgliacellen klaar voor de oogst van de gemengde gliale cultuur. Om te bepalen of cellen zijn klaar, onderzoekt cellen onder een omgekeerde fase-contrast microscoop. Microglia zijn klaar voor de oogst als bij ~ 40% confluentie. Ze verschijnen als kleine, lichte, bolvormige cellen, groeit als een monolaag bovenop andere glia.
5. Isolatie van Microglia van Mixed Gliale Cultuur
- Om microglia isoleren, krachtig tik kolf tegen laboratorium bank. Deze agitatie helpt gescheiden microglia uit andere gliacellen te wijten aan de lage hechting eigenschappen van microglia.
- Verzamel supernatant media die microglia in een steriele conische centrifugebuis; pellet microglia (215 xg, 5 min; swingende emmer rotor).
- Resuspendeer de pellet in microgliale warme Microglial groeimedium (MGM, MEM aangevuld met 1 mM natriumpyruvaat, 0,6% v / vglucose, 1 mM L-glutamine, 100 ug / ml P / S, 5% v / v FBS, 2 ~ ml / kolf) Bepaal de celconcentratie met een hemocytometer en plaat 1 x 10 5 cellen / putje in een 24-well plaat formaat opplastic of steriele glazen dekglaasjes (500 ul / putje; MGM). Met deze procedure wordt de gemiddelde microglia opbrengst is 7,5 x 10 5 cellen / pup cortex.
- 24-uur na plating, verwijder alle van de media en opnieuw ingevoerd cellen met verse MGM (37 ° C) tot drijvende cellen en vuil te verwijderen. Deze stap is cruciaal voor de overleving cel en latente microglia handhaven. Cellen kunnen worden gebruikt voor experimenten direct na bijvoeding.
6. Voorbeeld Behandelingen
- Expose cellen tot 10 ng / ml Pam 3 CSK 4 (Pam), 10 ng / ml lipopolysaccharide (LPS) of het voertuig, incubeer gedurende 2 tot 24 uur in bevochtigde incubator (37 ° C, 5% CO2).
7. Het analyseren Microglia voor Functionaliteit Ex vivo via Immunofluorescente Imaging en Immunocytochemie
- Na behandeling oogst celkweekmedium in microfuge buizen (1,5 ml) en centrifuge behulp van een tafelblad microcentrifuge (2 min; 900 xg) om media te wissen. Breng de bovenstaande om een schone microfugebuis; onmiddellijk assay, of bewaar bij -20 ° C tot gebruik. Analyseer TNF-α-concentratie in celcultuur supernatant via handel verkrijgbare muis-TNF α ELISA kit.
- Was de cellen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), en bevestig cellen met 4% (w / v) paraformaldehyde / 4% (w / v) sucrose / PBS pH 7,4 (4% PFA, 15 min, RT). Na fixatie, wassen cellen met PBS gedurende 5 minuten onder zacht schudden op een rondschudapparaat.
- Immuunfluorescentie / Immunocytochemie. Na fixatie en PBS wassen, proces microglia voor immunocytochemie. Alle stappen met zacht schudden uitgevoerd. Permeabilize cellen in PBS/0.1% Triton X-100; blok cellen in PBS/10% normaal geit serum gedurende een uur. Incubeer cellen O / N bij 4 ° C met konijnen anti-NF-KB-antilichaam (p65 subeenheid, 1/1, 250) of konijn anti-Iba-1-antilichaam (1/750) in blockingbuffer. Zichtbaarize antigeen-antilichaam-complex na incubatie met fluorescent geconjugeerd geit anti-konijn IgG secundair antilichaam (1 hr, 1/1, 000). Verwijder ongebonden tweede antilichaam door wassen met PBS/0.1% triton X-100 (3x 5 min).
- Teller vlek cellen met 4 ',6-diamidino-2-fenylindool / PBS (DAPI, 0,1 ug / ml). De celkern te visualiseren Alle microglia afgeleid van CX3CR1-GFP + / - muizen brengen GFP. Maken gebruik van een 350 nm golflengte filter te visualiseren DAPI, een 488 nm golflengte filter om GFP te visualiseren, en een 594 nm golflengte filter om p65 en Iba-1 immunocomplexen visualiseren.
- Mount dekglaasjes met behulp van waterige montage oplossing en visualiseren microglia met fluorescerende microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Behoud van immunofenotype en functionaliteit van microglia ex vivo tijdens isolatie kritisch kunnen deze cellen te gebruiken als onderzoeks model voor microgliale biologie. Om de succesvolle behoud van microglia immunofunctionality volgens de onderhavige werkwijze demonstreren, isoleerden wij corticale microglia van P3 pasgeborenen (CX3CR1-GFP + / - en C57BL / 6) en behandelde kweken met ofwel LPS of Pam.
Zoals getoond in figuur 1A, isolatie van microglia via agitatie door rondschudapparaat behoudt de ruststroom fenotype toegeschreven aan microglia normale in vivo omstandigheden. Om microglia zuiverheid, CX3CR1-GFP + / - werden celkweken gekleurd voor de macrofaag antigen Iba-1 en gekleurd met DAPI om de celkern visualiseren teller. Zoals getoond in figuren 1A en 1B, onder lage vergroting, microglia isolatie via de presently beschreven werkwijze resulteert in een zeer zuivere celcultuur, zoals meer dan 95% van de cellen vertonen colocalization van GFP, Iba-1 en DAPI.
We naast getracht de responsiviteit van microglia ex vivo te bevestigen door uitdagende cellen met LPS. In vergelijking met behandeling voertuig, LPS-behandelde CX3CR1-GFP + / -. Microglia aangepast schril morfologische verandering van een kleine, bipolair fenotype naar een amoeboid-achtige vorm, zoals getoond in figuur 1B Deze morfologische verandering is ook samengevat in corticale geïsoleerde microglia van C57BL / 6 pasgeborenen behandeld met Pam (figuur 2). Dit geconserveerd morfologische respons tussen genetisch verschillende microglia, geactiveerd met verschillende stimuli, onderstreept de reproduceerbaarheid en de toepasbaarheid van het huidige protocol met betrekking tot verschillende experimentele modellen.
Hoewel deze verandering in morfologie wijst op activering 39, het noodzakelijk is determine als microglia geïsoleerd door roterende schudden behouden hun vermogen om p65 translokeren bij activering, met vermelding van het behoud van de functionele TLR-gemedieerde intracellulaire signalering. Om deze signalerende cascade bevestigen, behandelden wij microglia geïsoleerd van C57BL / 6 pasgeborenen met Pam. Zoals geïllustreerd in figuur 2, immunocytochemische kleuring voor p65 blijkt dat, onder normale omstandigheden, p65 is diffuus gelokaliseerd in het hele cytoplasma, terwijl na een 2 uur stimulatie met Pam, p65 immunoreactiviteit dramatisch verschoven lokalisatie naar de celkern.
Nu is vastgesteld dat microglia geïsoleerd via de gepresenteerde methode hierin behouden de moleculaire mechanismen P65 transloceren naar de kern, naast we wilden bevestigen dat geïsoleerde microglia behouden hun biochemische immunofunctionality door het testen van hun vermogen om een kenmerk pro-inflammatoire cytokine TNF-α, bij activering scheiden . Zoals aangetoond in Figuur 3, invergelijking met draagstof behandelde microglia cellen blootgesteld aan Pam of LPS verhogen de uitscheiding van TNF-α in het kweekmedium (p <0,0001, eenzijdige ANOVA), indicatief functionele TLR1 / 2 andTLR4 signaalwegen, respectievelijk.
Daarom samen genomen, deze gegevens vaststellen dat isolatie van microglia via roterende schudden resulteert in zeer zuivere celkweken met gekonfijte immunofenotype en functionaliteit, ex vivo.
.. Figuur 1 rondschudapparaat levert hoge zuiverheid microgliale culturen bewaarde immunofe Microgliale cellen werden geïsoleerd uit CX3CR1-GFP + / - neonatale muizen P3 en behandeld met ofwel drager (A), of bacteriële LPS (B) voor 24 uur.Cellen werden gefixeerd met 4% PFA, immunocytochemisch gekleurd voor Iba-1 en gekleurd met DAPI teller. (A) Microglia behandeld met PBS vertonen een bipolaire, rustige fenotype. (B) Bij LPS challenge, microglia passen een amoeboid-achtige fenotype, een indicatie van de activering. Samengevoegd kanaal panelen (A) en (B) onder 10x vergroting tonen dat> 95% van cellen GFP/Iba-1 positieve cellen. 10X schaal bar: 100 micrometer; 40X schaal bar: 20 micrometer. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. Microglia geïsoleerd via roterende schudden translokeren NF-kB te nucleus cel op Pam challenge. Microgliale cellen werden geïsoleerd uit C57BL / 6 pasgeborenen P3 en behandeld met drager of Pam gedurende 2 uur. Cellen werden gefixeerd met 4% PFA en gekleurd voor p65 via immunocytochemie. Cellen werden tegengekleurd met DAPI de celkern visualiseren. In het voertuig behandeld microglia, is p65 gelokaliseerd in het hele cytoplasma, terwijl stimulatie met Pam induceert de nucleaire translocatie van p65. 40X schaal bar:. 20 pm Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 3. Microglia geïsoleerd met rondschudapparaat afgifte TNF-α bij blootstelling aan Pam of LPS. Microgliale cellen werden geïsoleerd uit C57BL / 6 neonatale muizen P3 en behandeld met vehiculum, Pam of LPS gedurende 2 uur. Celkweeksupernatanten werden verzameld en geanalyseerd via ELISA voor TNF-α release. *** P <0,0001 (n = 2, eenzijdige ANOVA). Gegevens zijn weergegeven als gemiddelden ± SD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De huidige procedure biedt een effectieve methode voor het isoleren van de corticale microglia van pasgeboren muizen. Deze procedure heeft een dubbel voordeel 1) behoud microglia immunophenotype en functionaliteit, zoals bepaald door fluorescentie beeldvorming, immunocytochemie en ELISA, en 2) zodat microglia rijpen in aanwezigheid van andere gliacellen (astrocyten en oligodentrocytes) vóór isolatie, die belangrijke cel-cel interacties tijdens de gliale cultuur rijpingsduur kan vergemakkelijken. Belangrijk, geïsoleerde cellen vertoonden hoge levensvatbaarheid en uniformiteit met gekonfijte functionaliteit en immunofenotype ex vivo.
Er zijn verschillende stappen die moeten worden uitgevoerd met speciale aandacht en toewijding voor succesvolle isolatie van microglia met de hoogste zuiverheid en opbrengst. Deze stappen zijn: 1) behoud van een steriele, gezonde kweek gedurende de gehele procedure experimenten, 2) verwijderen van alle hersenvliezen van de cortijken tijdens microdissection; 3) goede wassen van hakken bord en schaar na het fijnhakken cortex; 4) in evenwicht brengen van MCM in T-75 kolven in incubator voor het begin microdissection; 5) bijvoeding 24 uur na-isolatie.
Aangezien microglia zijn de bewoner immuuncellen van het CZS, ze zijn zeer ontvankelijk voor het milieu beledigingen. Daarom is het vermijden van cultuur verontreiniging met ziekteverwekkers is cruciaal voor het behoud van de immunophenotypic en functionele eigenschappen van latente microgliacellen. Dagelijkse inspectie van cellen om verontreiniging en groei te volgen is integraal vermijden gecompromitteerd celculturen en een beter begrip van microgliale groeisnelheid krijgen. Voorts moet MGM 24-uur na plating van microglia vernieuwen om de levensvatbaarheid en functionaliteit mobiele handhaven.
Een belangrijk obstakel overwinnen isoleren microglia is dat gehakt CZS is vrij van endotheelcellen, dieindien aanwezig, microgliale proliferatie belemmeren door vorming van dichte kolonies in de gliale culturen. Daarom is het essentieel om het CZS hersenvliezen tijdens microdissectie van de hersenen grondig te verwijderen. In onze ervaring, worden de hersenvliezen van P3 pasgeborenen verwijderd met meer gemak dan P1 pasgeborenen, als het weefsel is meer ontwikkeld en makkelijker te visualiseren onder de dissectie microscoop. Daarnaast is het belangrijk te voorkomen natmaken van de dorsale zijde van de hersenen met DM na verwijdering van de hersenen van de schedel. Dit kan geschieden door de hersenen anatomische positie (dorsale zijde naar boven) bij te dragen tot DM. Houd de dorsale zijde van de hersenen droge zorgt voor een betere visualisatie en gemakkelijker verwijderen van de hersenvliezen.
We hebben gevonden dat de meest effectieve manier om de hersenvliezen te verwijderen is om in te voegen de kracht # 4 in de meest achterste deel van de interhemi spleet, en schil hersenvliezen af, lateraal. Zodra de dorsale hersenvliezen zijn gewist, dan remo weve de ventrale hersenvliezen door omkeren van de hersenen (ventrale naar boven) en voorzichtig grijpen de reukkwabben en peeling terug naar het achterste gedeelte van de hersenen. Verwijderen we vervolgens het resterende ventrale meningeale weefsel door voorzichtig peeling en een pincet in een zijwaartse beweging. Daaropvolgende scheiding van de cortex van de rest van de hersenen is cruciaal voor het isoleren van alleen corticale microglia. De werkwijze hierin beschreven is ook flexibel in zoverre dat het gebruikt kan worden om microglia isoleren van subcorticale gebieden, ook. Hoewel, het is van belang dat celopbrengst lager zijn vanwege de variabiliteit van microglia dichtheid onverschillig cytoarchitectural hersengebieden 40.
Wij hebben gevonden dat de uiteindelijke opbrengst van microglia is het belangrijk te spoelen en verzamel de spoeling van de bij het hakken hulpstoffen maximaliseren. Deze spoelen zorgen voor de volledige verzameling van alle overblijvende weefsel dat op de hakken schaar kunnen zijn gebleven, petrischaal, en de pipettip gebruikt om het gehakt weefsel aliquot in de conische buis. Het is belangrijk dat deze spoelingen plaatsvindt direct na het overbrengen van het gehakte CZS de conische buis, levensvatbaarheid van de cellen te optimaliseren. Het is ook van cruciaal belang voor de levensvatbaarheid van cellen dat de cellen blijven niet in MM langer dan 2 min sinds MM is verstoken van essentiële voedingsstoffen.
Ten slotte is het cruciaal om de T-75 kolven met MCM bereiden en plaats ze in de bevochtigde incubator (37 ° C, 5% CO 2) voorafgaand aan het starten van de microdissection protocol. Thet-75 kolf heeft een poreuze bekleding onder de dop dat zorgt voor de uitwisseling van gassen, media evenwichtsinstelling vergemakkelijken vóór de toevoeging van gemengde gliale culturen. We hebben gevonden dat niet doen resulteert in een suboptimale microglia oogst. Het is ook belangrijk om de T-75 kolf dop met Parafilm afdichting voor het plaatsen van de kolf in de roterende schudder om gasuitwisseling minimaliseren en uit de kolf tijdens het roteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd in de afwezigheid van alle commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIEHS R01ES014470 (KMZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose | Sigma | G8270 | Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 °C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM. |
| Sodium pyruvate 100 mM (100x) | Hyclone | SH30239.01 | Store at 4 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM. |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Fetal Bovine Serum (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Minimum Essential Medium Earle's (MEM) | Cellgro | 15-010-CV | Without L-glutamine. Contains Earle's salts. Used to make MCM, MGM, and DM. |
| Horse Serum | Gibco | 16050 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Cellgro | 21-021-CV | Without calcium and magnesium. Store at 4 °C. Used to make MM. |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-031 | Store at 4 °C. Used to make MM. |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | Used to stain cell nucleus. |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1. |
| Rabbit anti-NFκB (p65) | Abcam | 7970 | Used at 1/1,250 dilution for ICC staining for p65. |
| Alexa Fluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11012 | Used at 1/1,000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC. |
| 10 ml Disposable Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 50 ml Disposable Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| 15 ml Disposible Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Sterile Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1) | Roboz Surgical | RS-6010 | 1; 5 in; used for removing head |
| Scissor: Vannas (scissor #2) |
Fine Science Tools | 15000-08 | 1; nonangled; 2.5 mm cutting edge; used to open scalp |
| Scissor: Student Vannas (scissor #3) | Fine Science Tools | 91501-09 | 1; curved; used to mince brain tissue |
| Forcep: Dumont #7 (forcep #1) |
Fine Science Tools | 91197-00 | 2; used to secure nose and remove cortices |
| Forcep: Dumont #2 (forcep #2) |
Fine Science Tools | 11223-20 | 1; used to remove scalp |
| Forcep: Dumont #3 (forcep #3) |
Fine Science Tools | 11231-30 | 1; used to remove skull |
| Forcep: Dumont #5a (forcep #4) |
Fine Science Tools | 11253-21 | 1; used to remove meninges |
| Table of Specific Equipment | |||
| Zoom Stereo Dissection Microscope | Olympus | SZ4060 | Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet |
| Laminar-Horizontal Flow Cabinet | Nuaire | NU-201-330 | |
| Biological Safety Cabinet | Labconco | 3440001 | Class II |
| Water-Jacketed CO2 Incubator | VWR | 97025-836 | Set to 37 °C, 5% CO2 |
| Swing-out buckets | Fisher Scientific | 75006441 | To be used with Swing-out rotor |
| Swing-out Rotor | Fisher Scientific | 75006445 | Max Radius: 19.2 (cm) |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge (clinical centrifuge) |
Fisher Scientific | 75-004-377 | With swing-out rotor |
| AccuSpin Micro 17 microcentrifuge (tabletop microcentrifuge) |
Fisher Scientific | S98645 | With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524) |
References
- Ranshoff, R. M. P. V. H. Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39, 151-170 (1990).
- Gomez Perdiguero, E., Schulz, C., Geissmann, F. Development and homeostasis of "resident" myeloid cells: The case of the microglia. Glia. 61, 112-120 (2013).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat. Neurosci. 16, 273-280 (2013).
- Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nature reviews. Immunology. , 11-775 (2011).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Hu, S., et al. Cytokine and free radical production by porcine microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 78, 93-96 (1996).
- Muzio, M., Polentarutti, N., Bosisio, D., Prahladan, M. K., Mantovani, A. Toll-like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially expressed and regulated by different leukocytes. J. Leukocyte Biol. 67, 450-456 (2000).
- Lee, S. J., Lee, S. Toll-like receptors and inflammation in the CNS. Curr. Drug Targets. Inflamm. Allergy. 1, 181-191 (2002).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8, 57-69 (2007).
- Halle, A., et al. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta. Nat. Immunol. 9, 857-865 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Duewell, P., et al. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals. Nature. 464, 1357-1361 (2010).
- Stewart, C. R., et al. CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4. 11, 155-161 (2010).
- Beraud, D., et al. alpha-Synuclein Alters Toll-Like Receptor Expression. Front. Neurosci. 5, 80 (2011).
- Banati, R. B., Gehrmann, J., Schubert, P., Kreutzberg, G. W. Cytotoxicity of microglia. Glia. 7, 111-118 (1993).
- Combs, C. K., Karlo, J. C., Kao, S. C., Landreth, G. E. beta-Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNF alpha-dependent expression of induciblenitric oxide synthase and neuronal apoptosis. J. Neurosci. 21, 1179-1188 (2001).
- Kim, Y. S., Joh, T. H. Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the pathogenesis of Parkinson's disease. Exp. Mol. Med. 38, 333-347 (2006).
- Colton, C., Wilcock, D. M. Assessing activation states in microglia. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 174-191 (2010).
- Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Ceramide activates microglia to enhance the production/secretion of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) without induction of deleterious factors in vitro. J. Neurochem. 80, 697-705 (2002).
- Uesugi, M., Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Nonparticipation of nuclear factor kappa B (NFkappaB) in the signaling cascade of c-JunN-terminal kinase (JNK)- and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)-dependent tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) induction in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated microglia. Brain Res. , 1073-1074 (2006).
- Beraud, D., et al. Microglial Activation and Antioxidant Responses Induced by the Parkinson's Disease Protein alpha-Synuclein. J. Neuroimmun. Pharmacol. 8, 94-117 (2013).
- Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease. Neurobiol. Aging. 29, 1690-1701 (2008).
- Minghetti, L., Levi, G. Microglia as effector cells in brain damage and repair: focus on prostanoids and nitric oxide. Prog. Neurobiol. 54, 99-125 (1998).
- Hirsch, E. C. Glial cells and Parkinson's disease. J. Neurol.. 247 (2), 58-62 (2000).
- Liu, B., et al. Role of nitric oxide in inflammation-mediated neurodegeneration. Ann. NY Acad. Sci. 962, 318-331 (2002).
- Shie, F. S., Nivison, M., Hsu, P. C., Montine, T. J. Modulation of microglialinnate immunity in Alzheimer's disease by activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Curr. Med. Chem. 16, 643-651 (2009).
- Rogers, J., Mastroeni, D., Leonard, B., Joyce, J., Grover, A. Neuroinflammation in Alzheimer's disease and Parkinson's disease: are microglia pathogenic in either disorder. Int. Rev. Neurobiol. 82, 235-246 (2007).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murinemicroglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
- Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression. J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).
- Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J. Vis. Exp. , (2011).
- Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation. J. Vis. Exp. , (2012).
- Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity. Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Imai, T., et al. Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion. Cell. 91, 521-530 (1997).
- Cardona, A. E., et al. Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor. Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).
- Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
