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Immunology and Infection

Murine नवजात शिशुओं से संरक्षित Immunophenotype और कार्यक्षमता के साथ Cortical Microglia का अलगाव

Published: January 30, 2014 doi: 10.3791/51005
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Neuroscience, Georgetown University Medical Center

Summary

Microglial जीव विज्ञान की सफल जांच करने के लिए एक प्रमुख सीएनएस ऊतक से अलगाव के दौरान पूर्व vivo microglial immunofunction का संरक्षण है. फ्लोरोसेंट इमेजिंग, immunocytochemistry, और proinflammatory उत्तेजनाओं (LPS) lipopolysaccharide और पाम 3 CSK 4 (पाम) के साथ एलिसा निम्नलिखित microglia सक्रियण द्वारा मूल्यांकन के रूप में अत्यधिक शुद्ध और immunofunctional सेल संस्कृतियों में रोटरी मिलाते हुए परिणामों के माध्यम से microglia अलग.

Abstract

सीएनएस ऊतक से microglia के अलगाव पूर्व vivo microglial जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल एक शक्तिशाली खोजी उपकरण है. वर्तमान विधि एक रोटरी प्रकार के बरतन के साथ यांत्रिक आंदोलन से नवजात murine cortices से microglia के अलगाव के लिए एक प्रक्रिया का विवरण. इस microglia अलगाव विधि पैदावार vivo में सामान्य, nonpathological स्थितियों में मौन microglia का संकेत रूपात्मक और कार्यात्मक लक्षण दिखा रहे हैं कि अत्यधिक शुद्ध cortical microglia. Morphological परिवर्तन, NF-κB (p65) की p65 सबयूनिट के परमाणु स्थानान्तरण, और बानगी proinflammatory साइटोकाइन का स्राव, ट्यूमर परिगलन कारक α (TNF-α के शामिल होने के द्वारा प्रदर्शन के रूप में इस प्रक्रिया का भी microglial immunophenotype और जैव रासायनिक कार्यक्षमता को बरकरार रखता है ), (LPS) lipopolysaccharide और पाम 3 CSK 4 (पाम) चुनौतियों पर. इसलिए, वर्तमान अलगाव प्रक्रिया मौन और acti दोनों की immunophenotype को बरकरार रखता हैपूर्व vivo परिस्थितियों में microglia जीव विज्ञान की जांच का एक प्रयोगात्मक विधि उपलब्ध कराने बढ़ा microglia,.

Introduction

Microglial कोशिकाओं, सीएनएस पैरेन्काइमा की निगरानी मैक्रोफेज, वयस्क स्तनधारी मस्तिष्क की कुल सेल की आबादी का लगभग 12% शामिल. Microglia जर्दी थैली माइलॉयड अग्रदूत साबित कोशिकाओं से व्युत्पन्न और वयस्क सीएनएस 1-5 भीतर विभिन्न कोशिकाओं की व्यवस्था से संबंधित क्षेत्रों में सेल घनत्व और आकारिकी में भिन्नता है. एक स्वस्थ वयस्क दिमाग में, microglia ठीक, गतिशील प्रक्रियाओं के साथ, छोटे डालियां फैला हुआ या ध्रुवीय कोशिकाओं रहे हैं. हालांकि, vivo इमेजिंग अध्ययन microglial प्रक्रियाओं को गतिशील "की याद ताजा तरीके से विस्तार करने और उनके microenvironment नजर रखने के लिए वापस लेना है कि प्रदर्शन, परिधीय बृहतभक्षककोशिका आकारिकी के विपरीत, microglia सेलुलर निष्क्रियता के रूप में प्रकट हो सकता है कि स्वस्थ दिमाग में एक मौन, कम प्रोफ़ाइल फेनोटाइप का प्रदर्शन नमूना और "6,7 सर्वेक्षण.

Microglia स्विचन, अत्यधिक और विभिन्न मस्तिष्क में पर्यावरण और pathophysiological परिवर्तन के लिए उत्तरदायी हैंक्रमश: एक प्रेरक राज्य सामान्यतः उनके आराम के रूप में माना गया है और सक्रिय राज्यों को surveillant से. सक्रियण में यह स्विच ऐसी रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न का जवाब जो टोल की तरह रिसेप्टर्स (TLRs), (PAMPs), अर्थात् बैक्टीरियल और वायरल व्युत्पन्न लिपो प्रोटीन के रूप में झिल्ली ही सीमित पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (PRRs), की सगाई द्वारा मध्यस्थता जा सकता है , न्यूक्लिक एसिड, और कार्बोहाइड्रेट 8-11. PAMPs के अलावा, PRRs भी ऐसे सेलुलर क्षति 12-16 के रूप में सीएनएस homeostasis में एक गड़बड़ी का प्रतिनिधित्व करते हैं जो खतरे / क्षति जुड़े आणविक पैटर्न (damps) के रूप में जाना जाता है बाँझ, nonpathogenic अणु, के खिलाफ microglial सक्रियण प्रेरित दिखाया गया है. एक बार जब लगे, PRRs microglial सेल आकारिकी और जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन में यह परिणाम है कि झरना संकेत एक intracellular आरंभ, विशेष रूप से, सक्रिय microglia, एक अमीबाभ तरह फेनोटाइप अनुकूलन सेल नाभिक को p65 NF-κB सबयूनिट (p65) सरकाना, और upregulate उत्पादों होगाction और ऐसे प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) 16-24 के साथ ट्यूमर परिगलन कारक α (TNF-α), इंटरल्यूकिन 1 β (आईएल 1β), के रूप में proinflammatory साइटोकिन्स, का स्राव. सीएनएस की सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में अभिन्न हालांकि, इन स्रावित अणु भी जिससे पार्किंसंस और अल्जाइमर रोग 25-29 के रूप में रोगग्रस्त राज्यों में neurodegeneration उत्प्रेरण और exacerbating, neuronal oxidative तनाव बढ़ाने के लिए पाया गया है.

हालांकि, रोग राज्यों में microglial सक्रियण के तंत्र को पूरी तरह से समझ नहीं रहे हैं. Microglial सक्रियण के विवो सुविधाओं में कई संस्कृति में recapitulated किया जा सकता है के रूप में इसलिए, microglia के अलगाव, इन जैविक प्रक्रियाओं में एक शक्तिशाली खोजी उपकरण है. कई तरीकों सीएनएस ऊतक 30,31 के enzymatic पाचन के बाद एक Percoll ढाल के माध्यम से अलगाव सहित microglia, अलग करने के लिए उपलब्ध हैं. हालांकि, enzymatic पाचन बदल सकते हैंप्रतिजन अभिव्यक्ति 32 सेल सतह को कम करने, और इस के साथ साथ वर्णित विधि की तुलना में पशु प्रति कम सेल उपज में परिणाम द्वारा कोशिकाओं की immunophenotype. पहले एक Percoll ढाल उपज 3-5 x 10 5 कोशिकाओं 30,33,34 के माध्यम से पूरे सीएनएस से अलगाव तरीकों की सूचना दी है, जबकि विशेष रूप से, हम, 7.5 x 10 5 कोशिकाओं का पिल्ला प्रांतस्था औसतन microglia उपज की रिपोर्ट. वर्तमान प्रक्रिया जिससे microglial immunophenotype और कार्यक्षमता के संरक्षण, उनके कम पालन गुणों के आधार पर microglia अलग से पाचन एंजाइमों के उपयोग में गतिरोध उत्पन्न.

एक रोटरी प्रकार के बरतन, पहले से ही विस्तार पर यांत्रिक आंदोलन के माध्यम से, और C57BL 6 / murine cortices - अध्ययन में मौजूद है, हम नवजात विषमयुग्मजी CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + /) से व्युत्पन्न मिश्रित glial संस्कृतियों से microglial कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन प्रकाशित विधि 24,35. हम microglia की आसान दृश्य के लिए पूर्व माउस तनाव का उपयोग, के रूप मेंएक monocyte विशिष्ट प्रमोटर 36-38 - इन चूहों अंतर्जात Cx3Cr1 लोकस के नियंत्रण के तहत व्यक्त GFP. यह विधि एक संरक्षित immunophenotype पूर्व vivo जीवाणु (LPS) lipopolysaccharide या पाम 3 CSK 4 के साथ चुनौती दी जब morphological परिवर्तन, p65 के परमाणु स्थानान्तरण, और TNF-α के स्राव द्वारा प्रदर्शन के रूप में, TLR4 और TLR1 / 2 agonists के साथ अत्यधिक शुद्ध microglial संस्कृतियों का उत्पादन , क्रमशः.

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Protocol

पहले इस प्रोटोकॉल शुरू करने, प्रसव के बाद के दिनों में नवजात चूहों को इकट्ठा 1-3 संरक्षण और गर्मी के लिए मूल पिंजरे बिस्तर के साथ नेस्ट एक बाँझ कंटेनर में (P1-3). यह microglial उपज का अनुकूलन करने के लिए इस प्रोटोकॉल के माध्यम से जल्दी से और कुशलता से काम करने के लिए महत्वपूर्ण है. पूरा अभिकर्मक सूची के लिए 1 टेबल देखें.

1. उपकरणों, संस्कृति, मीडिया, और व्यंजन की तैयारी

  1. 10 मिलीग्राम / पिल्ला Microglia पूरा मीडिया (एमसीएम तैयार, 1x न्यूनतम आवश्यक के साथ पूरक मध्यम है Earle [सदस्य]: 1 मिमी एल glutamine, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 0.6% v / वी डी (+) ग्लूकोज, 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस), 4% v / वी भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 6% v / वी हार्स सीरम), और प्रत्येक टी -75 कुप्पी (1 कुप्पी / पिल्ला) को जोड़ने, टोपी और जगह क्षैतिज में एक मशीन (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) 1 घंटे के लिए संतुलित करने के लिए. यह विच्छेदन शुरू करने से पहले कुप्पी (ओं) में इस मीडिया संतुलित करने के लिए आवश्यक है.
  2. Prepaफिर से, विभाज्य, और गर्म विच्छेदन (6 मिलीग्राम / पिल्ला) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान एमसीएम में और सेल मेजबान (2 मिलीग्राम / पिल्ला) के लिए एक अलग शंक्वाकार ट्यूब एमसीएम में. , और विदारक मीडिया (डीएम, सदस्य 100 माइक्रोग्राम / एमएल पी के साथ पूरक /: बर्फ क़ीमा मीडिया (; 100 माइक्रोग्राम / एमएल पी / एस, 0.01 एम HEPES 3 मिलीग्राम / पिल्ला HBSS के साथ पूरक एम एम) पर तैयार करें, विभाज्य, और सर्द एस, 2 मिलीग्राम / पिल्ला).
  3. 10 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में डुबकी द्वारा निम्नलिखित शल्य चिकित्सा उपकरणों जीवाणुरहित: कैंची # 1 (1, सिर काटना करने के लिए), # 1 forcep (2; नाक सुरक्षित और cortices दूर करने के लिए), कैंची # 2 (1; nonangled; खोलने के लिए खोपड़ी ,) कैंची # 3 (1 तानिका दूर करने के लिए;), forcep # 2 (1;,) खोपड़ी को दूर करने के लिए forcep # 4 (2, # 3 (1 forcep,) खोपड़ी को दूर करने के लिए मस्तिष्क के ऊतकों कीमा). एक बाँझ पैड पर हवा शुष्क करने की अनुमति दें.
  4. 70% इथेनॉल के साथ क्षैतिज airflow कार्य केंद्र और विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे साफ कर लें.
  5. सिर पर कब्जा करने के लिए 2 बाँझ, 100 मिमी पेट्री डिश में डीएम बांटना (3 मिलीग्राम, 1/3 पिल्ले पकवान) और विच्छेदन (1 मिलीलीटर;विच्छेदन के लिए पहले बर्फ पर ठंडा); / पिल्ला 1 पकवान. मस्तिष्क के ऊतकों (; 1 पकवान / पिल्ला 1 मिलीलीटर) क़ीमा के लिए 1 बाँझ, 100 मिमी पेट्री डिश में एम.एम. बांटना.

2. मस्तिष्क ऊतक विच्छेदन

  1. पिछले इच्छामृत्यु के लिए, धीरे से एक प्रयोगशाला ऊतक का उपयोग कर 70% इथेनॉल के साथ गर्दन और पिल्ला के सिर को साफ करता है. कैंची # 1 के साथ, जल्दी से सिर निकाल कर पिल्ला euthanize; कब्जा सिर पहले से तैयार पेट्री डिश में. Euthanize और अगले पशु के लिए आगे बढ़ने से पहले एक पिल्ला के विच्छेदन पूरा करें.
  2. ठंडा विच्छेदन पकवान सिर स्थानांतरण; खुला खोपड़ी एक बनाने के द्वारा कैंची # 2 का प्रयोग; विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे # 1 (वैकल्पिक रूप से, सिर थैली के माध्यम से संदंश भेदी द्वारा सुरक्षित किया जा सकता है) forcep का उपयोग कर नाक बन्द रखो द्वारा सिर सुरक्षित वाई कटौती: सिर के आधार से और आँखों की ओर एक कोण पर शुरू करते हैं. धीरे खोपड़ी उजागर laterally छीलने द्वारा खोपड़ी को दूर करने के लिए # 3 forcep का प्रयोग करें.
  3. Forcep # 3 का प्रयोग, धीरे बेस के कम से संयोजी ऊतक को हटानेसिर. पकड़; खोपड़ी के आधार (interhemispheric विदर के बाद) मस्तिष्क और खोपड़ी के बीच में forcep के एक हाथ सूत्रण से, ध्यान से खुला खोपड़ी संपर्क में है धीरे खुला फाड़ करने के लिए ऊपर की ओर खोपड़ी खींच.
  4. Forcep # 1 का उपयोग कर मस्तिष्क के उदर पक्ष के नीचे संयोजी ऊतक बाधित, और बाद में एक ही उपकरण का उपयोग कर मस्तिष्क को हटा दें. मस्तिष्क के उदर पक्ष के नीचे एक ऊपर की ओर बल का उपयोग करके खोपड़ी से बाहर मस्तिष्क लिफ्ट.
  5. अपनी शारीरिक स्थिति में मस्तिष्क रखें: पृष्ठीय पक्ष विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे cortices कल्पना करने के लिए ऊपर की ओर का सामना करना पड़; मध्यमस्तिष्क और प्रांतस्था के चौराहे में संदंश के सुझावों को सम्मिलित करके जगह में मस्तिष्क को सुरक्षित, पूरी तरह से forcep # 4 के साथ cortical तानिका हटाने, तो उदर तानिका दूर करने के लिए आगे बढ़ें. तानिका पूरी तरह से हटा दिया गया है एक बार, forcep # 4 का उपयोग कर मस्तिष्क के शेष से cortices अलग. यह पूरी तरह से microglia पवित्रता और yiel को अधिकतम करने के तानिका संबंधी ऊतक निकालने के लिए आवश्यक हैडी.

3. मस्तिष्क के ऊतकों क़ीमा

  1. स्थानांतरण cortices पहले से पकवान क़ीमा तैयार करने, द्वितीय श्रेणी जैविक सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ तकनीक का उपयोग कर कदम क़ीमा जारी है.
  2. कैंची # 3 का उपयोग कीमा मस्तिष्क के ऊतकों, एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण कीमा बनाया हुआ ऊतक;., कैंची और एम.एम. प्रत्येक के 1 मिलीलीटर के साथ क़ीमा पकवान कुल्ला इकट्ठा करने और कीमा बनाया हुआ ऊतक युक्त 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में rinses बांटना इस कुल्ला कदम को अधिकतम जाएगा सभी अवशिष्ट ऊतक शंक्वाकार ट्यूब को सौंप दिया है कि यह सुनिश्चित करके microglia की उपज. कीमा बनाया हुआ ऊतक ट्यूब के नीचे बसा है, की अनुमति 1-2 मिनट तक अछूता ऊतक निलंबन छोड़ दें. एम.एम. आवश्यक पोषक तत्व शामिल नहीं है के रूप में 2 मिनट से अधिक नहीं है.
  3. ध्यान हटाने और बसे कीमा बनाया हुआ ऊतक को बाधित करने के लिए नहीं कुछ कर रही है, एक मानक विंदुक टिप के साथ सामान्य 1,000 μl micropipettor के साथ सतह पर तैरनेवाला के 2 मिलीलीटर त्यागें. कीमा बनाया हुआ ऊतक को एमसीएम के 3 मिलीलीटर जोड़ें, एक मानक विंदुक टिप के साथ एक सामान्य 1,000 μl micropipettor का उपयोग पूरी ताकत के साथ ऊतक triturate विचूर्णन पूरा हो गया है जब कोई discernable ठोस ऊतक रहना चाहिए.. पिपेट टिप से अवशिष्ट triturated नमूना एकत्रित करना, एक ही विंदुक टिप के साथ एमसीएम का एक और 3 मिलीलीटर जोड़ें.

4. बढ़ते cortical कोशिकाओं

  1. अपकेंद्रित्र कोशिकाओं (215 XG, 5 मिनट, आर टी, झूल बाल्टी रोटर के साथ चिकित्सीय अपकेंद्रित्र) गोली कीमा बनाया हुआ ऊतक. जैविक सुरक्षा कैबिनेट को pelleted कोशिकाओं लौटें, हटाने और सतह पर तैरनेवाला त्यागने, धीरे सेल गोली (; एमसीएम 2 मिलीग्राम / ट्यूब); resuspend पहले से तैयार टी -75 फ्लास्क सेल मेजबान जोड़ने, फ्लास्क टोपी और में यह क्षैतिज जगह एक humidified, मानक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2). कोशिकाओं 24 घंटे के लिए सेते दें.
  2. 24 घंटे के बाद, धीरे बाधित करने के लिए हाथ की हथेली के खिलाफ कुप्पी नलऊतक मलबे. पहले और मलबे का पूरी तरह हटाने सुनिश्चित करने के दोहन के बाद कोशिकाओं की जाँच करें. सेट कुप्पी ऊर्ध्वाधर, हटाने और मीडिया त्यागें, कुप्पी के नीचे करने के लिए ताजा एमसीएम जोड़ने (12 एमएल, 37 डिग्री सेल्सियस), टोपी और क्षैतिज, वापस इनक्यूबेटर में जगह है.
  3. संदूषण के लिए दैनिक कोशिकाओं की जाँच करें और विकास पर नजर रखने के लिए.
  4. इन विट्रो (DIV) में लगभग 17-21 दिन, microglial कोशिकाओं मिश्रित glial संस्कृति से कटाई के लिए तैयार हो जाएगा. कोशिकाओं के लिए तैयार हैं, तो यह निर्धारित करने के लिए, एक औंधा चरण विपरीत खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की जांच. Microglia कटाई के लिए तैयार कर रहे हैं जब 40% confluency ~ पर. वे अन्य glia के शीर्ष पर एक monolayer के रूप में बढ़ रहा है, छोटे, उज्ज्वल, गोलाकार कोशिकाओं के रूप में दिखाई देते हैं.

5. मिश्रित Glial संस्कृति से Microglia का अलगाव

  1. Microglia को अलग करने के लिए, सख्ती प्रयोगशाला बेंच के खिलाफ कुप्पी टैप करें. इस आंदोलन microglia की कम पालन गुणों के कारण अन्य glial कोशिकाओं से अलग microglia में मदद करता है.
    2. कोशिकाओं 5 घंटा से अधिक समय के लिए मंथन करने के लिए अनुमति न दिखने का निरीक्षण किया. कि microglia एक औंधा चरण विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग, 5 घंटा बाद फ्लास्क सतह से हटा लिया है. Microglia मुक्त अस्थायी कोशिकाओं, गोलाकार, उज्ज्वल है. Astrocytes और कुप्पी के नीचे का पालन करने oligodendrocytes के एक अवशिष्ट परत हो जाएगा.
  2. गोली microglia (215 XG;, 5 मिनट, बाल्टी रोटर झूल) सतह पर तैरनेवाला एक बाँझ शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में microglia युक्त मीडिया लीजिए.
  3. ~ 2;, 0.6% v / vglucose, 1 मिमी एल glutamine, 100 माइक्रोग्राम / एमएल पी / एस, 5% v / वी एफ बी एस 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट:; गर्म microglial मध्यम विकास (एमजीएम में microglial गोली Resuspend सदस्य के साथ पूरक एमएल / फ्लास्क), एक hemocytometer का उपयोग सेल एकाग्रता का निर्धारण, और प्लेट 1 एक्स 10 पर एक 24 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में 5 कोशिकाओं / अच्छी तरह सेप्लास्टिक या (500 μl / अच्छी तरह से, एमजीएम) बाँझ गिलास को कवर फिसल जाता है. इस प्रक्रिया का उपयोग औसत microglia उपज 7.5 x 10 5 कोशिकाओं / पिल्ला प्रांतस्था है.
  4. 24 घंटा बाद चढ़ाना, अस्थायी कोशिकाओं और मलबे को हटाने के लिए ताजा एमजीएम (37 डिग्री सेल्सियस) के साथ मीडिया और refeed कोशिकाओं के सभी को हटा दें. यह कदम सेल अस्तित्व के लिए और मौन microglia बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है. कोशिकाओं को तुरंत refeeding के बाद प्रयोग के लिए उपयोग किया जा सकता है.

6. उदाहरण के उपचार

  1. पाम 3 CSK 4 (पाम) के / एमएल, 10 एनजी / एमएल (LPS) lipopolysaccharide या वाहन पर नियंत्रण एनजी 10 के कोशिकाओं को बेनकाब; humidified इनक्यूबेटर में 2 या 24 घंटे के लिए सेते (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2).

7. कार्यक्षमता पूर्व vivo माध्यम Immunofluorescent इमेजिंग और immunocytochemistry के लिए Microglia का विश्लेषण करना

  1. Microfuge ट्यूबों (1.5 एमएल) और centr में उपचार, फसल सेल संस्कृति मीडिया के बादमीडिया खाली करने के लिए; ifuge एक tabletop microcentrifuge (900 XG 2 मिनट) का उपयोग कर. एक स्वच्छ microfuge ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला, परख तुरंत, या दुकान -20 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग करने के लिए तैयार है जब तक. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माउस TNF-α एलिसा किट के माध्यम से सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला में TNF-α एकाग्रता का विश्लेषण करें.
  2. फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को धो लें, और 4% के साथ कोशिकाओं को ठीक (w / v) paraformaldehyde / 4% (w / v) सुक्रोज / पीबीएस 7.4 पीएच (4% पीएफए, 15 मिनट, आर टी). निर्धारण के बाद, कोमल एक कक्षीय हिलनेवाला पर झटकों के साथ 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें.
    1. Immunofluorescence / Immunocytochemistry. निर्धारण और पीबीएस immunocytochemistry के लिए, प्रक्रिया microglia धोने के बाद. कोमल झटकों के साथ किए गए सभी कदम. PBS/0.1% ट्राइटन X-100 में कोशिकाओं permeabilize, एक घंटे के लिए PBS/10% सामान्य बकरी सीरम में ब्लॉक कोशिकाओं. या अवरुद्ध बफर में खरगोश विरोधी IBA -1 एंटीबॉडी (1/750), खरगोश विरोधी NF-κB एंटीबॉडी (1/1, 250 p65 सबयूनिट) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं हे / एन सेते हैं. दृश्यप्रतिजन ize: fluorescently संयुग्मित विरोधी खरगोश बकरी आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी (1 घंटा, 1/1, 000) के साथ ऊष्मायन के बाद एंटीबॉडी जटिल. PBS/0.1% ट्राइटन X-100 (3 x 5 मिनट) के साथ धोने से अनबाउंड माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें.
    2. 4 ',6-diamidino-2-phenylindole / पीबीएस (DAPI, 0.1 ग्राम / एमएल) के साथ काउंटर दाग कोशिकाओं. सेल नाभिक कल्पना करने CX3CR1-GFP + / से प्राप्त सभी microglia - चूहों GFP व्यक्त करते हैं. DAPI कल्पना करने के लिए एक 350 एनएम तरंगदैर्ध्य फिल्टर का उपयोग, GFP कल्पना करने के लिए एक 488 एनएम तरंगदैर्ध्य फिल्टर, और एक 594 एनएम तरंगदैर्ध्य फिल्टर p65 और आईबीए -1 immunocomplexes कल्पना करने के लिए.
  3. माउंट कवर जलीय बढ़ते समाधान का उपयोग और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग microglia कल्पना निकल जाता है.

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Representative Results

अलगाव के दौरान microglia पूर्व vivo की immunophenotype और कार्यक्षमता बनाए रखने microglial जीव विज्ञान के लिए एक जांच पड़ताल मॉडल के रूप में इन कोशिकाओं का उपयोग करने में सक्षम होने के लिए महत्वपूर्ण है. (- और C57BL 6 / CX3CR1-GFP + /) और LPS या पाम के साथ या तो इलाज संस्कृतियों वर्तमान पद्धति का उपयोग microglia immunofunctionality के सफल संरक्षण प्रदर्शित करने के लिए, हम पी 3 नवजात शिशुओं से cortical microglia पृथक.

चित्रा 1 ए में सचित्र, रोटरी झटकों के माध्यम से आंदोलन के माध्यम से microglia के अलगाव सामान्य में vivo परिस्थितियों में microglia को जिम्मेदार ठहराया मौन phenotype बरकरार रखता है. Microglial पवित्रता का आकलन करने के लिए, CX3CR1-GFP + / - सेल संस्कृतियों बृहतभक्षककोशिका प्रतिजन IBA -1 और सेल नाभिक कल्पना करने के क्रम में DAPI के साथ दाग काउंटर के लिए दाग रहे थे. Prese के माध्यम से कम बढ़ाई, microglia अलगाव के तहत आंकड़े 1 ए और 1 बी में दिखाया गया हैntly कोशिकाओं के 95% से अधिक के रूप में, एक अत्यधिक शुद्ध सेल संस्कृति में विधि परिणाम वर्णित GFP, आईबीए-1, और DAPI की colocalization दिखा रहे हैं.

हम अगले LPS के साथ कोशिकाओं को चुनौती देने से microglia पूर्व vivo की जवाबदेही की पुष्टि करने की मांग की. वाहन उपचार की तुलना में, LPS का इलाज CX3CR1-GFP + / -. चित्रा 1 बी में दिखाया गया है microglia, एक अमीबाभ आकार की तरह करने के लिए एक छोटा सा, द्विध्रुवी फेनोटाइप से एक निरा रूपात्मक बदलाव अनुकूलित इस रूपात्मक बदलाव भी अलग cortical microglia में recapitulated है पाम के साथ इलाज C57BL / 6 नवजात शिशुओं (चित्रा 2) से. विभिन्न उत्तेजनाओं के साथ सक्रिय आनुवंशिक अलग microglia के बीच यह संरक्षित रूपात्मक प्रतिक्रिया, विभिन्न प्रयोगात्मक मॉडल के संबंध में reproducibility और वर्तमान प्रोटोकॉल की प्रयोज्यता रेखांकित करता है.

आकृति विज्ञान में इस बदलाव के सक्रियण 39 का संकेत है हालांकि, यह विकास के लिए आवश्यक हैetermine microglia द्वारा पृथक अगर रोटरी कार्यात्मक TLR की मध्यस्थता intracellular संकेत के संरक्षण का संकेत है, सक्रियण पर p65 सरकाना करने की क्षमता बनाए रखने मिलाते हुए. इस झरना संकेत की पुष्टि करने के लिए, हम पाम साथ C57BL / 6 नवजात शिशुओं से अलग microglia इलाज किया. चित्रा 2 में सचित्र, p65 के लिए immunocytochemical धुंधला पाम के साथ एक 2 घंटा उत्तेजना के बाद, p65 immunoreactivity नाटकीय रूप से सेल नाभिक स्थानीयकरण स्थानांतरित कर दिया है, जबकि सामान्य परिस्थितियों में, p65 विस्तारपूर्वक, cytoplasm भर में स्थानीय है, कि इसका सबूत.

प्रस्तुत विधि के माध्यम से पृथक microglia यहां नाभिक को p65 सरकाना के लिए आणविक तंत्र की रक्षा है कि स्थापित करने के बाद, हम अगले कि पृथक microglia सक्रियण पर एक बानगी proinflammatory साइटोकाइन TNF-α, स्रावित करने की उनकी क्षमता का परीक्षण करके अपने जैव रासायनिक immunofunctionality बनाए रखने की पुष्टि करना चाहता था . चित्रा 3, में में प्रदर्शनक्रमशः संकेत दे रास्ते कार्यात्मक TLR1 / 2 andTLR4 का संकेत,,, वाहन का इलाज microglia की तुलना, पाम या LPS के संपर्क में कोशिकाओं संस्कृति मीडिया (एक तरह से एनोवा पी <0.0001) में TNF-α के स्राव को बढ़ा सकते हैं.

इसलिए एक साथ लिया, इन आंकड़ों पूर्व vivo संरक्षित immunophenotype और कार्यक्षमता के साथ अत्यधिक शुद्ध सेल संस्कृतियों में रोटरी मिलाते हुए परिणामों के माध्यम से microglia की है कि अलगाव की स्थापना.

चित्रा 1
.. पी 3 में नवजात चूहों और 24 घंटे के लिए वाहन (ए), या बैक्टीरियल LPS (बी) के साथ या तो इलाज - चित्रा 1 रोटरी पैदावार संरक्षित immunophenotype साथ उच्च शुद्धता microglial संस्कृतियों मिलाते microglial कोशिकाओं CX3CR1-GFP + / से अलग थे.कोशिकाओं 4% immunocytochemically IBA-1 के लिए दाग पीएफए, और DAPI के साथ दाग काउंटर के साथ तय किया गया. (ए) Microglia पीबीएस प्रदर्शनी एक द्विध्रुवी, मौन phenotype के साथ इलाज किया. (बी) LPS चुनौती पर, microglia सक्रियण का संकेत एक अमीबाभ तरह phenotype, अनुकूलन. 10X आवर्धन के तहत विलय कर दिया पैनल में चैनल (ए) और (बी) कोशिकाओं की> 95% GFP/Iba-1 सकारात्मक कोशिकाओं रहे हैं कि प्रदर्शित करता है. 10X पैमाने पर पट्टी: 100 मीटर, 40X पैमाने पर पट्टी: 20 माइक्रोन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. Microglia के माध्यम से पृथक रोटरी पाम चा पर नाभिक सेल NF-κB सरकाना मिलातेllenge. microglial कोशिकाओं पी 3 पर C57BL / 6 नवजात शिशुओं से अलग और 2 घंटे के लिए वाहन या पाम के साथ इलाज किया गया. कोशिकाओं 4% पीएफए ​​के साथ तय की और immunocytochemistry के माध्यम से p65 के लिए दाग रहे थे. प्रकोष्ठों काउंटर सेल नाभिक कल्पना करने के लिए DAPI के साथ दाग रहे थे. पाम के साथ उत्तेजना p65 के परमाणु स्थानान्तरण लाती है, जबकि वाहन इलाज microglia में, p65, cytoplasm भर में स्थानीय है. 40X पैमाने पर पट्टी:. 20 माइक्रोन बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
पाम या LPS के लिए जोखिम पर रोटरी मिलाते रिहाई TNF-α के साथ अलग चित्रा 3. Microglia. Microglial कोशिकाओं पी 3 पर C57BL / 6 नवजात चूहों से अलग और वाहन के साथ इलाज किया गया, पाम, या 2 घंटे के लिए LPS. सेल संस्कृति supernatants TNF-α रिहाई के लिए एलिसा के माध्यम से एकत्र की है और विश्लेषण किया गया. *** पी <0.0001 (एन = 2; एक तरह से एनोवा). डाटा ± एसडी मतलब है के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं.

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Discussion

वर्तमान प्रक्रिया नवजात चूहों से cortical microglia के अलगाव के लिए एक प्रभावी तरीका प्रदान करता है. यह प्रक्रिया फ्लोरोसेंट इमेजिंग, immunocytochemistry, और एलिसा द्वारा निर्धारित रूप में, 1) के संरक्षण microglia immunophenotype और कार्यक्षमता की एक दो गुना लाभ है, और, 2) microglia से पहले अन्य glial कोशिकाओं (astrocytes और oligodentrocytes) की उपस्थिति में परिपक्व करने की अनुमति glial संस्कृति परिपक्वता अवधि के दौरान महत्वपूर्ण सेल सेल बातचीत की सुविधा हो सकती है, जो अलगाव,. महत्वपूर्ण बात है, अलग कक्षों संरक्षित कार्यक्षमता और immunophenotype पूर्व vivo साथ उच्च व्यवहार्यता और एकरूपता का प्रदर्शन किया.

उच्चतम पवित्रता और उपज के साथ microglia की सफल अलगाव के लिए विशेष रूप से ध्यान और परिश्रम के साथ प्रदर्शन करने की आवश्यकता है कि कई कदम उठाए हैं. ये कदम हैं: 1) पूरे प्रयोग प्रक्रिया भर में एक बाँझ, स्वस्थ संस्कृति को बनाए रखने के लिए, 2) भ्रष्टाचार से सभी तानिका हटानेtices microdissection दौरान; cortices क़ीमा के बाद थाली और कैंची क़ीमा 3) उचित धोने, 4) microdissection शुरुआत से पहले इनक्यूबेटर में टी 75 बोतल में एमसीएम equilibrating, 5) 24 घंटे के बाद अलगाव refeeding.

Microglia सीएनएस के निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं हैं, वे पर्यावरण अपमान करने के लिए अत्यधिक संवेदनशील हैं. इसलिए, रोगजनक एजेंटों के साथ संस्कृति संदूषण से परहेज मौन microglial कोशिकाओं की immunophenotypic और कार्यात्मक विशेषताओं के संरक्षण के लिए महत्वपूर्ण है. प्रदूषण और विकास पर नजर रखने के लिए कक्षों की दैनिक निरीक्षण से समझौता सेल संस्कृतियों से बचने और microglial विकास दर का एक बेहतर समझ हासिल करने का अभिन्न अंग है. इसके अलावा, यह सेल व्यवहार्यता और कार्यक्षमता को बनाए रखने के क्रम में microglia की एमजीएम 24 घंटे बाद चढ़ाना ताज़ा करने के लिए आवश्यक है.

Microglia अलग में काबू पाने के लिए एक प्रमुख बाधा कीमा बनाया हुआ सीएनएस ऊतक endothelial कोशिकाओं से मुक्त है कि यह सुनिश्चित करने के लिए है, जो,अगर मौजूद है, glial संस्कृतियों में घने कालोनियों के गठन से microglial प्रसार बाधित कर सकते हैं. इस कारण से, यह अच्छी तरह से मस्तिष्क की microdissection दौरान सीएनएस तानिका दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है. ऊतक और अधिक विकसित और विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे कल्पना करने के लिए आसान है के रूप में हमारे अनुभव में, पी 3 नवजात शिशुओं की तानिका, P1 नवजात शिशुओं की तुलना में अधिक आसानी से हटा रहे हैं. इसके अतिरिक्त, यह खोपड़ी से मस्तिष्क को हटाने के बाद डीएम के साथ मस्तिष्क के पृष्ठीय पक्ष गीला से बचने के लिए महत्वपूर्ण है. इस डीएम को स्थानांतरित जब शारीरिक स्थिति (पृष्ठीय पक्ष) में मस्तिष्क रखने के द्वारा किया जा सकता है. मस्तिष्क सूखे की पृष्ठीय पक्ष रखते हुए बेहतर दृश्य और तानिका की आसान हटाने के लिए अनुमति देता है.

हम तानिका दूर करने के लिए सबसे प्रभावी तरीका interhemispheric विदर के सबसे पीछे भाग में बल # 4 डालने के लिए है, और laterally छील तानिका बंद, मिल गया है. पृष्ठीय तानिका साफ हो गया है एक बार, हम तो रेमोमस्तिष्क (उदर पक्ष अप) inverting, और धीरे घ्राण बल्ब लोभी और वापस मस्तिष्क के पीछे भाग की ओर छीलने से उदर तानिका लिया. हम तो धीरे छीलने और एक पार्श्व गति में tweezing द्वारा किसी भी शेष उदर तानिका संबंधी ऊतक को हटा दें. मस्तिष्क के बाकी हिस्सों से प्रांतस्था के बाद जुदाई केवल cortical microglia अलग करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह रूप में अच्छी तरह से, subcortical क्षेत्रों से microglia अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि इस के साथ साथ विस्तृत प्रक्रिया भी लचीला है. हालांकि, यह सेल उपज के कारण microglia घनत्व प्रति उदासीन कोशिकाओं की व्यवस्था से संबंधित मस्तिष्क क्षेत्रों में 40 की परिवर्तनशीलता को कम किया जा सकता है कि नोट करना महत्वपूर्ण है.

हम यह क़ीमा बनाने की प्रक्रिया में इस्तेमाल सामग्री से कुल्ला कुल्ला और इकट्ठा करने के लिए महत्वपूर्ण है microglia की अंतिम उपज को अधिकतम करने के लिए मिल गया है. ये rinses पूरा क़ीमा कैंची पर बने रहे हो सकता है कि सभी अवशिष्ट ऊतक का संग्रह, पेट्री डिश, और पिपेट सुनिश्चितटिप शंक्वाकार ट्यूब में कीमा बनाया हुआ ऊतक विभाज्य इस्तेमाल किया. यह इन rinses सेल व्यवहार्यता का अनुकूलन करने के लिए, शंक्वाकार ट्यूब कीमा बनाया हुआ सीएनएस के ऊतकों में परिवर्तित करने के बाद तुरंत उस जगह ले महत्वपूर्ण है. यह भी एम.एम. आवश्यक पोषक तत्वों से रहित है क्योंकि कोशिकाओं 2 मिनट से अधिक समय के लिए एम एम में नहीं रहते कि सेल व्यवहार्यता के लिए महत्वपूर्ण है.

अंत में, यह एमसीएम साथ टी 75 बोतल तैयार करने और humidified इनक्यूबेटर में उन्हें जगह के लिए महत्वपूर्ण है (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) microdissection प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले. Thet-75 फ्लास्क मिश्रित glial संस्कृतियों के अलावा पहले मीडिया संतुलन की सुविधा, गैसों के आदान प्रदान के लिए अनुमति देता है कि अपनी टोपी के तहत एक झरझरा अस्तर है. हम यह करने में विफलता एक suboptimal microglial फसल में यह परिणाम है कि मिल गया है. यह पिछले जबकि घूर्णन में और कुप्पी से बाहर गैसीय विनिमय को कम करने के क्रम में रोटरी प्रकार के बरतन पर कुप्पी रखने के लिए Parafilm के साथ टी -75 फ्लास्क टोपी सील करने के लिए भी महत्वपूर्ण है.

5 कोशिकाओं / पिल्ला प्रांतस्था) में जिसके परिणामस्वरूप नवजात चूहों से cortical microglia अलग करने का एक प्रभावी तरीका विवरण ढाल (3-5 x 10 5 कोशिकाओं / पूरे सीएनएस) 30,33,34. फ्लोरोसेंट इमेजिंग, immunocytochemistry, और एलिसा द्वारा सबूत के रूप में, इस प्रक्रिया के माध्यम से पृथक microglia ऐसे पाम और LPS रूप immunogenic उत्तेजनाओं को उजागर जब रूपात्मक और जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं के दौर से गुजर में सक्षम हैं. इसलिए, इस के साथ साथ वर्णित प्रक्रिया पूर्व vivo परिस्थितियों में microglial जीव विज्ञान की जांच का एक प्रयोगात्मक विधि प्रदान करता है.

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Disclosures

लेखकों अनुसंधान ब्याज की एक संभावित संघर्ष के रूप में लगाया जा सकता है कि किसी भी व्यावसायिक या वित्तीय संबंधों के अभाव में आयोजित किया गया है कि घोषणा.

Acknowledgments

इस काम NIEHS R01ES014470 (KMZ) द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucose Sigma G8270 Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 °C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM.
Sodium pyruvate 100 mM (100x) Hyclone SH30239.01 Store at 4 °C. Used to make MCM and MGM.
Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x) Gibco 15140-122 Store at -20 °C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM.
L-Glutamine 200 mM (100x) Gibco 25030-081 Store at -20 °C. Used to make MCM and MGM.
Fetal Bovine Serum (Defined) Hyclone SH30070.03 Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM.
Minimum Essential Medium Earle's (MEM) Cellgro 15-010-CV Without L-glutamine. Contains Earle's salts. Used to make MCM, MGM, and DM.
Horse Serum Gibco 16050 Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM.
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Cellgro 21-021-CV Without calcium and magnesium. Store at 4 °C. Used to make MM.
HEPES 1 M Gibco 15630-031 Store at 4 °C. Used to make MM.
T-75 Flask Corning 430641
4',6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI) Invitrogen D3571 Used to stain cell nucleus.
Rabbit anti-Iba1 Wako 019-19741 Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1. 
Rabbit anti-NFκB (p65) Abcam 7970 Used at 1/1,250 dilution for ICC staining for p65.
Alexa Fluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Invitrogen A11012 Used at 1/1,000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC.
10 ml Disposable Serological Pipet Fisher Scientific 13-678-11E
50 ml Disposable Centrifuge Tube Fisher Scientific 05-539-8
15 ml Disposible Centrifuge Tube Fisher Scientific 05-539-12
Sterile Polystyrene Petri Dish Fisher Scientific 875713 100 mm x 15 mm
Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1) Roboz Surgical RS-6010 1; 5 in; used for removing head
Scissor: Vannas
(scissor #2)		 Fine Science Tools 15000-08 1; nonangled; 2.5 mm cutting edge; used to open scalp
Scissor: Student Vannas (scissor #3) Fine Science Tools 91501-09 1; curved; used to mince brain tissue
Forcep: Dumont #7
(forcep #1)		 Fine Science Tools 91197-00 2; used to secure nose and remove cortices 
Forcep: Dumont #2
(forcep #2)		 Fine Science Tools 11223-20 1; used to remove scalp
Forcep: Dumont #3
(forcep #3)		 Fine Science Tools 11231-30 1; used to remove skull
Forcep: Dumont #5a
(forcep #4)		 Fine Science Tools 11253-21 1; used to remove meninges
Table of Specific Equipment
Zoom Stereo Dissection Microscope  Olympus SZ4060 Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet
Laminar-Horizontal Flow Cabinet Nuaire NU-201-330
Biological Safety Cabinet Labconco 3440001 Class II
Water-Jacketed CO2 Incubator VWR 97025-836 Set to 37 °C, 5% CO2
Swing-out buckets Fisher Scientific 75006441 To be used with Swing-out rotor
Swing-out Rotor Fisher Scientific 75006445 Max Radius: 19.2 (cm)
Sorvall Legend RT+ Centrifuge
(clinical centrifuge)		 Fisher Scientific 75-004-377 With swing-out rotor
AccuSpin Micro 17 microcentrifuge
(tabletop microcentrifuge)		 Fisher Scientific S98645 With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524)  

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References

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Murine नवजात शिशुओं से संरक्षित Immunophenotype और कार्यक्षमता के साथ Cortical Microglia का अलगाव
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Daniele, S. G., Edwards, A. A., Maguire-Zeiss, K. A. Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates. J. Vis. Exp. (83), e51005, doi:10.3791/51005 (2014).

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