Summary
Una chiave per il successo indagini di biologia microglia è la conservazione dei immunofunction microglia ex vivo durante l'isolamento dal tessuto del sistema nervoso centrale. Isolare microglia via rotanti risultati si stringono in colture cellulari altamente puri e immunofunctional come valutato da immagini fluorescenti, immunocitochimica, ed ELISA dopo l'attivazione della microglia con il lipopolisaccaride stimoli pro-infiammatori (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).
Abstract
Isolamento di microglia dal tessuto del sistema nervoso centrale è un potente strumento di indagine utilizzato per studiare biologia microglia ex vivo. Il presente metodo dettaglia un procedimento per l'isolamento di microglia da cortecce neonatali murini mediante agitazione meccanica con un agitatore rotante. Questo isolamento microglia metodo rendimenti microglia corticali purissime che presentano caratteristiche morfologiche e funzionali indicative di microglia quiescenti in condizioni non patologiche normali in vivo. Questa procedura preserva anche la immunofenotipo microglia e funzionalità biochimica come dimostra l'induzione di modificazioni morfologiche, traslocazione nucleare della subunità p65 di NF-kB (p65), e la secrezione della citochina proinfiammatoria segno distintivo, fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α ), su lipopolisaccaride (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam) sfide. Pertanto, l'attuale procedura di isolamento conserva l'immunofenotipo sia quiescente e attivamicroglia vato, fornendo un metodo sperimentale di investigare microglia biologia ex vivo condizioni.
Introduction
Cellule microgliali, i macrofagi sorveglianza del parenchima SNC, comprendono circa il 12% della popolazione totale di cellule del cervello dei mammiferi adulti. Microglia sono derivati dal sacco vitellino mieloidi precursori delle cellule e variano in densità cellulare e morfologia in diverse regioni cytoarchitectural all'interno del SNC adulto 1-5. In un cervello adulto sano, microglia sono piccoli, ramificati o polari cellule con raffinati processi dinamici. In contrasto con macrofagi morfologia periferico, microglia dimostrano una quiescente, basso profilo fenotipo in cervelli sani che possono apparire come l'inattività cellulare, tuttavia, vivo studi di imaging in dimostrano che i processi microgliali si estendono in modo dinamico e ritraggono per monitorare il loro microambiente in un modo che ricorda " campionamento e rilevamento "6,7.
Microglia sono altamente e differenzialmente sensibili alle alterazioni ambientali e patofisiologici nel cervello, commutazioneda una surveillant a un effettrici stati, rispettivamente statali comunemente considerato come il loro riposo e attivato. Questo interruttore di attivazione può essere mediata da un blocco del recettori di membrana pattern recognition (PRR), come i recettori toll-like (TLR), che rispondono a modelli molecolari associati ai patogeni (PAMP), lipoproteine vale a dire-batteriche e virali derivati , acidi nucleici, carboidrati e 8-11. Oltre a PAMPs, PRRs hanno dimostrato di indurre l'attivazione della microglia contro sterili, molecole patogene conosciute come modelli molecolari pericolo / danno associato (smorza), che rappresentano una perturbazione nel sistema nervoso centrale dell'omeostasi, come danno cellulare 12-16. Una volta inserita, PRRs avviare una cascata di segnalazione intracellulare che si traduce in cambiamenti nella morfologia cellulare e l'espressione genica microglia, in particolare, microglia attivata adattare un fenotipo ameboide-like, traslocare la p65 NF-kB subunità (p65) al nucleo della cellula, e il potenziamento della produttoriction e la secrezione di citochine proinfiammatorie, come fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α), interleuchina-1 β (IL-1β), insieme con le specie reattive dell'ossigeno (ROS) 16-24. Sebbene integrale nella risposta immunitaria innata del sistema nervoso centrale, queste molecole secrete sono stati trovati anche ad aumentare lo stress ossidativo neuronale, inducendo in tal modo aggravando e neurodegenerazione in stati malati come il Parkinson e il morbo di Alzheimer 25-29.
Tuttavia, i meccanismi di attivazione della microglia in stati patologici non sono del tutto chiare. Pertanto, l'isolamento di microglia è un potente strumento di indagine in tali processi biologici, come molti nelle caratteristiche vivo di attivazione della microglia può essere ricapitolato in cultura. Sono disponibili diversi metodi per isolare microglia, compreso l'isolamento con gradiente Percoll seguente digestione enzimatica del tessuto CNS 30,31. Tuttavia, la digestione enzimatica può alterarel'immunofenotipo delle cellule riducendo superficie cellulare espressione dell'antigene 32, e si traduce in quantità di cellule per animale inferiore rispetto al metodo qui descritto. In particolare, si segnala un rendimento medio microglia per pup corteccia di 7,5 x 10 5 cellule, mentre precedentemente riportato metodi di isolamento da tutto CNS con gradiente resa Percoll 3-5 x 10 5 cellule 30,33,34. Il presente procedimento elude l'uso di enzimi digestivi isolando microglia in base alle loro proprietà a bassa aderenza, preservando così l'immunofenotipo microglia e funzionalità.
Nel presente studio, si descrive l'isolamento di cellule microgliali da colture gliali miste derivate da neonati eterozigoti CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -), e C57BL / 6 cortecce murini tramite agitazione meccanica su un agitatore rotante, una proroga di precedenza metodo pubblicato 24,35. Utilizziamo il primo ceppo di topi per una facile visualizzazione di microglia, comequesti topi esprimono GFP sotto il controllo del locus endogeno CX3CR1 - un promotore specifico monociti 36-38. Questo metodo produce colture microgliali altamente puri con una preservata immunofenotipo ex vivo, come dimostrato dai cambiamenti morfologici, traslocazione nucleare di p65, e la secrezione di TNF-α quando provocati con lipopolisaccaride batterico (LPS) o Pam 3 CSK 4, TLR4 e TLR1 / 2 agonisti rispettivamente.
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Protocol
Prima di iniziare questo protocollo, raccogliere topi neonati a giorni postnatali 1-3 (P1-3), in un contenitore sterile nidificato con biancheria gabbia originale per la protezione e calore. E 'importante lavorare in modo rapido ed efficiente attraverso questo protocollo per ottimizzare il rendimento della microglia. Si prega di consultare la tabella 1 per la lista completa di reagenti.
1. Preparazione di strumenti, terreni di coltura, e piatti
- Preparare 10 ml / pup Microglia Complete media (MCM; 1x minimo essenziale del Piano Earle [MEM] supplementato con 1 mM L-glutammina, 1 mM di piruvato di sodio, 0,6% v / v D-(+)-glucosio, 100 pg / ml Penicillina / streptomicina (P / S), 4% v / v siero fetale bovino (FBS), 6% v / v Horse Serum), e aggiungere ad ogni pallone T-75 (1 boccetta / pup); cappuccio e posto orizzontalmente in un incubatore (37 ° C, 5% CO 2) per equilibrare per 1 ora. È essenziale equilibrare questo mezzo beuta (s) prima di iniziare la dissezione.
- Prepare, aliquota, e caldo in 37 ° C bagnomaria MCM per dissezione (6 ml / pup) e in un tubo conico MCM separato per risospensione delle cellule (2 ml / pup). Preparare, aliquote e freddo sul ghiaccio Tritacarne media (MM; HBSS completata con: 100 pg / ml P / S, 0.01 M HEPES, 3 ml / pup), e di dissezione media (DM; MEM supplementato con 100 pg / ml P / S, 2 ml / pup).
- Sterilizzare i seguenti strumenti chirurgici mediante immersione in etanolo al 70% per 10 min: forbice # 1 (1, a decapitare), forcep # 1 (2, per assicurare il naso e rimuovere cortecce), forbice # 2 (1; nonangled, per aprire cuoio capelluto ), forcep # 2 (1; rimuovere cuoio capelluto), forcep # 3 (1; rimuovere cranio), forcep # 4 (2; rimuovere meningi), forbice # 3 (1; tritare tessuto cerebrale). Lasciare asciugare all'aria su un tampone sterile.
- Pulire la postazione di lavoro e la dissezione microscopio orizzontale del flusso d'aria con il 70% di etanolo.
- Dispensare DM in 2 sterili, 100 millimetri piastre di Petri per l'acquisizione di testa (3 ml, 1 piatto / 3 cuccioli) e la dissezione (1 ml;1 piatto / pup; raffreddata in ghiaccio prima di dissezione). Dispensare MM in 1 sterile, 100 millimetri piatto di Petri per tritare il tessuto cerebrale (1 ml, 1 piatto / pup).
2. Cervello Tissue Dissection
- Prima di eutanasia, igienizzare delicatamente il collo e la testa del cucciolo con il 70% di etanolo utilizzando un tessuto di laboratorio. Con scissor # 1, eutanasia rapidamente pup togliendo la testa, testa di cattura in capsula di Petri precedentemente preparato. Euthanize e completare la dissezione di un cucciolo prima di procedere alla successiva animale.
- Trasferire la testa al piatto dissezione refrigerate; sotto il microscopio di dissezione fissare la testa pizzicando il naso con pinza # 1 (in alternativa, la testa può essere fissata da piercing pinza attraverso la cavità oculare); cuoio capelluto aperto con scissor # 2, creando un Y-cut: iniziare dalla base della testa ed inclinato verso gli occhi. Utilizzare forcep 3 # per rimuovere delicatamente il cuoio capelluto con il peeling laterale, esponendo il cranio.
- Utilizzando forcep # 3, rimuovere delicatamente il tessuto connettivo alla base deltesta. Quando la base del cranio è esposto, accuratamente aperto il cranio infilando un braccio della pinza tra il cervello e il cranio (seguendo la fessura interemisferica); presa; tirare delicatamente il cranio verso l'alto per strappare aperto.
- Disrupt tessuto connettivo sotto il lato ventrale del cervello utilizzando forcep # 1, e successivamente rimuovere il cervello utilizzando lo stesso strumento. Sollevare il cervello su cranio utilizzando una forza verso l'alto sotto la faccia ventrale del cervello.
- Mantenere il cervello nella sua posizione anatomica: lato dorsale verso l'alto per visualizzare le cortecce al microscopio dissezione; fissare il cervello in posizione inserendo punte della pinza nel punto di intersezione del mesencefalo e corteccia; rimuovere completamente meningi corticali con forcep # 4, quindi procedere a rimuovere le meningi ventrali. Una volta che le meningi siano stati completamente asportati, separare le cortecce dal resto del cervello utilizzando pinza # 4. È essenziale rimuovere completamente il tessuto meningeo per massimizzare microglia purezza e yield.
3. Cervello Tissue Mincing
- Cortecce di trasferimento di preparati in precedenza macinazione piatto, continuare a tritare passo con tecnica sterile in Classe II Sicurezza biologica Gabinetto.
- Tritare il tessuto cerebrale utilizzando forbice # 3; trasferimento di tessuto tritato in una provetta da 15 ml;. Lavare le forbici e tritare piatto con 1 ml di MM ciascuna, raccogliere e dispensare risciacqui nel tubo conico da 15 ml contenente il tessuto tritato Questa fase di risciacquo massimizzerà la resa di microglia garantendo che tutto il tessuto residuo viene trasferito tubo conico. Lascia sospensione tessuto indisturbato per 1-2 minuti, permettendo il tessuto macinata di stabilirsi sul fondo della provetta. Non superare 2 min come MM non contiene nutrienti essenziali.
- Rimuovere con cautela e scartare 2 ml di surnatante con generico 1000 microlitri micropipettatore con un puntale di serie, facendo attenzione a non disturbare il tessuto tritato risolta. Aggiungere 3 ml di MCM al tessuto tritato; triturare il tessuto con forza con un generico 1000 microlitri micropipettatore con un puntale di serie n distinguibile tessuto solido dovrebbe rimanere quando triturazione è completa.. Aggiungere altri 3 ml di MCM con la stessa punta della pipetta, la raccolta del campione triturato residuo dalla punta della pipetta.
4. Crescita delle cellule corticali
- Centrifugare il tessuto tritato a pellet cellule (215 xg, 5 min; RT, centrifuga clinica con rotore oscillante). Ritorno cellule pellet al gabinetto di sicurezza biologica, rimuovere e scartare il surnatante, risospendere delicatamente il pellet cellulare (2 ml / provetta, MCM), aggiungere la risospensione delle cellule al precedentemente preparato T-75 pallone, tappare il pallone e metterlo in orizzontale in umidificata standard coltura tissutale incubatore (37 ° C, 5% CO 2). Permettono alle cellule di incubare per 24 ore.
- Dopo 24 ore, delicatamente toccare pallone contro il palmo della mano per distruggereframmenti di tessuto. Controllare le cellule prima e dopo aver toccato per garantire la completa rimozione dei detriti. Set pallone verticale; rimuovere ed eliminare media; aggiungere MCM fresco al fondo del pallone (12 ml; 37 ° C); cappuccio e inserire di nuovo nel incubatore, orizzontalmente.
- Controllare le cellule al giorno per la contaminazione e per monitorare la crescita.
- A circa 17-21 giorni in vitro (DIV), le cellule microgliali saranno pronti per il raccolto dalla cultura gliali mista. Per determinare se le cellule sono pronte, esaminare le cellule sotto un microscopio a contrasto di fase invertito. Microglia sono pronti per il raccolto, quando al ~ 40% di confluenza. Essi appaiono come piccoli, luminosi, celle sferiche, crescendo come un monostrato in cima glia altri.
5. Isolamento di Microglia da Mixed Cultura Glial
- Per isolare microglia, vigorosamente toccare pallone contro il banco di laboratorio. Questa agitazione aiuta microglia, distinta da altre cellule gliali a causa delle proprietà di bassa aderenza della microglia.
- Raccogliere i media surnatante contenente microglia in una provetta da centrifuga conica sterile; microglia a pellet (215 xg, 5 min, oscillanti rotore secchio).
- Risospendere il pellet microglia nel warm microglia crescita medio (MGM; MEM supplementato con: 1 piruvato di sodio mM, 0,6% v / vglucose, 1 mM L-glutammina, 100 pg / ml P / S, 5% v / v di FBS; ~ 2 ml / beuta), determinare la concentrazione cellulare mediante un emocitometro e piastra 1 x 10 5 cellule / pozzetto in un formato di piastra da 24 pozzetti sullaplastica o sterili scivola copertura in vetro (500 microlitri / e; MGM). Utilizzando questa procedura il rendimento medio microglia è di 7,5 x 10 5 cellule / pup corteccia.
- 24 ore di post-placcatura, rimuovere tutti i mezzi di comunicazione e delle cellule refeed con MGM fresco (37 ° C) per rimuovere le cellule galleggianti e detriti. Questo passaggio è fondamentale alla sopravvivenza delle cellule e mantenere microglia quiescenti. Le cellule possono essere utilizzati per la sperimentazione subito dopo rialimentazione.
6. Trattamenti Esempio
- Esporre le cellule a 10 ng / ml di Pam 3 CSK 4 (Pam), 10 ng / ml di lipopolisaccaride (LPS) o di controllo del veicolo; incubare per 2 o 24 ore in incubatore umidificato (37 ° C, 5% CO 2).
7. Analizzando Microglia per la funzionalità ex vivo tramite immunofluorescenza Imaging e Immunocytochemistry
- Dopo il trattamento, mezzi di coltura cellulare raccolto in provette per microcentrifuga (1,5 ml) e centrifuge utilizzando una microcentrifuga da tavolo (2 min; 900 xg) per cancellare i media. Trasferire il supernatante in una provetta per microcentrifuga pulita; dosaggio immediatamente, o conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso. Analizzare concentrazione di TNF-α in coltura cellulare surnatante tramite disponibile in commercio del mouse-TNF α kit ELISA.
- Lavare le cellule con tampone fosfato (PBS), e fissare le cellule con il 4% (w / v) di paraformaldeide / 4% (w / v) di saccarosio / PBS pH 7,4 (4% PFA, 15 min; RT). Dopo la fissazione, lavare le cellule con PBS per 5 minuti agitando delicatamente su un agitatore orbitale.
- Immunofluorescenza / Immunocytochemistry. Dopo la fissazione e PBS lavare, processo microglia per immunocitochimica. Tutte le fasi effettuate con un leggero scuotimento. Permeabilize cellule in PBS/0.1% triton X-100; cellule blocchi in siero normale di capra PBS/10% per un'ora. Incubare le cellule O / N a 4 ° C con coniglio anti-NF-kB anticorpo (p65 subunità, 1/1, 250) o coniglio anti-Iba-1 anticorpo (1/750) nel tampone di bloccaggio. Visivoize antigene: anticorpo seguente incubazione con fluorescenza di capra coniugato anti-IgG di coniglio anticorpo secondario (1 ora, 1/1, 000). Rimuovere l'anticorpo secondario non legato mediante lavaggio con PBS/0.1% triton X-100 (3x 5 min).
- Cellule macchia contatore con 4 ',6-Diamidino-2-phenylindole / PBS (DAPI; 0,1 mg / ml). Per visualizzare nucleo della cellula Tutti microglia derivati da CX3CR1-GFP + / - topi esprimono GFP. Utilizzare un filtro di lunghezza d'onda di 350 nm per visualizzare DAPI, un filtro di lunghezza d'onda di 488 nm per visualizzare GFP, ed un filtro di lunghezza d'onda 594 nm di visualizzare p65 e Iba-1 immunocomplessi.
- Montare il coperchio scivola usando la soluzione di montaggio acquosa e visualizzare microglia usando la microscopia a fluorescenza.
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Representative Results
Conservando la immunofenotipo e la funzionalità della microglia ex vivo durante l'isolamento è fondamentale per essere in grado di utilizzare queste cellule come un modello di indagine per la biologia della microglia. Al fine di dimostrare la conservazione di successo della microglia immunofunctionality con il metodo attuale, abbiamo isolato microglia corticali da neonati P3 (CX3CR1-GFP + / - e C57BL / 6) e le colture trattate sia con LPS o Pam.
Come illustrato nella Figura 1A, isolamento di microglia tramite agitazione mediante agitazione rotante conserva il fenotipo quiescente conferita microglia in condizioni normali in vivo. Per valutare la purezza della microglia, + / CX3CR1-GFP - colture cellulari sono state colorate per l'antigene macrofagi Iba-1 e contro colorati con DAPI per visualizzare nucleo della cellula. Come mostrato nelle Figure 1A e 1B, sotto basso ingrandimento, isolamento microglia via Presente risultati metodo descritto in una coltura cellulare ad elevata purezza, come più del 95% delle cellule esibiscono colocalizzazione di GFP, Iba-1, e DAPI.
Abbiamo poi cercato di confermare la capacità di risposta della microglia ex vivo sfidando le cellule con LPS. In confronto al trattamento veicolo, LPS-trattati CX3CR1-GFP + / -. Microglia adattato un cambiamento morfologico Stark da un piccolo, fenotipo bipolare ad una forma ameboide simile, come mostrato nella Figura 1B Tale variazione morfologica è anche ricapitolato in microglia corticali isolati da C57BL / 6 neonati trattati con il PAM (Figura 2). Questa risposta morfologica conservati tra microglia geneticamente distinte, attivato con stimoli diversi, sottolinea la riproducibilità e applicabilità del presente protocollo per quanto riguarda vari modelli sperimentali.
Anche se questo cambiamento nella morfologia è indicativa di attivazione 39, è necessario determine se microglia isolato con un agitatore rotativo conservano la loro capacità di traslocare p65 al momento dell'attivazione, indicando la conservazione della funzionalità di segnalazione intracellulare TLR-mediata. A conferma di ciò cascata di segnalazione, abbiamo trattato microglia isolati da C57BL / 6 neonati con Pam. Come illustrato nella Figura 2, colorazione immunocitochimica per p65 evidenziato che, in condizioni normali, p65 è localizzato diffusamente tutto il citoplasma, mentre dopo una stimolazione 2 ore con il PAM, p65 immunoreattività spostata drammaticamente localizzazione al nucleo della cellula.
Avendo stabilito che microglia isolato tramite il metodo qui presentato conservano i meccanismi molecolari di traslocare p65 al nucleo, che accanto voluto confermare che la microglia isolato conservano la loro immunofunctionality biochimica testando la loro capacità di secernere una citochina proinfiammatoria segno distintivo, TNF-α, all'attivazione . Come mostrato nella Figura 3, inconfronto a veicolo trattati microglia, cellule esposte a Pam o LPS aumentare la secrezione di TNF-α nel terreno di coltura (P <0.0001; ANOVA), indicativa di funzionale TLR1 / 2 andTLR4 vie di segnalazione, rispettivamente.
Pertanto nel loro insieme, questi dati dimostrano che l'isolamento di microglia via rotanti che agitano risultati in colture di cellule altamente puri con immunofenotipo e funzionalità conservato, ex vivo.
.. Cellule microgliali Figura 1 Rotary scuotendo rendimenti elevata purezza colture microgliali con immunofenotipo conservati sono stati isolati da CX3CR1-GFP + / - mice neonatale a P3 e trattati con veicolo (A), o LPS batterici (B) per 24 ore.Le cellule sono state fissate con 4% PFA, immunocytochemically tinto per Iba-1, e il contatore colorati con DAPI. (A) Microglia trattati con PBS mostra un bipolare, fenotipo quiescente. (B) Al LPS sfida, microglia adattare un fenotipo ameboide-like, indicativa di attivazione. Canale uniti in pannelli (A) e (B) sotto ingrandimento 10x dimostrano che il> 95% delle cellule sono cellule positive GFP/Iba-1. 10X barra della scala: 100 micron; 40X barra della scala: 20 micron. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 2. Microglia isolato tramite un agitatore rotativo traslocare NF-kB alla cella nucleo su Pam challenge. cellule microgliali sono state isolate da C57BL / 6 neonati a P3 e trattati con veicolo o Pam per 2 ore. Le cellule sono state fissate con 4% PFA e colorate per p65 tramite immunocitochimica. Le cellule sono state contatore colorate con DAPI per visualizzare il nucleo della cellula. Nel veicolo trattati microglia, p65 è localizzato in tutto il citoplasma, mentre la stimolazione con Pam induce la traslocazione nucleare di p65. 40X barra della scala:. 20 micron Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 3. Microglia isolato con un agitatore rotativo rilascio di TNF-α seguito all'esposizione Pam o LPS. Cellule microgliali sono state isolate da C57BL / 6 topi neonati a P3 e trattati con veicolo, Pam, o LPS per 2 ore. Surnatanti di coltura cellulare sono stati raccolti e analizzati tramite ELISA per il rilascio di TNF-α. *** P <0.0001 (n = 2; one-way ANOVA). I dati sono presentati come mezzi SD ±.
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Discussion
Il presente procedimento offre un metodo efficace per l'isolamento di microglia corticali di topi neonati. Questa procedura ha un duplice vantaggio di 1) conservare immunofenotipo microglia e funzionalità, come determinato mediante imaging fluorescente, immunocitochimica e ELISA, e, 2) permettendo microglia di maturare in presenza di altre cellule gliali (astrociti e oligodentrocytes) prima isolamento, che può facilitare importanti interazioni cellula-cellula durante il periodo di coltura maturazione gliale. È importante sottolineare che le cellule isolate esposti alta vitalità e uniformità con la funzionalità conservato e immunofenotipo ex vivo.
Ci sono diversi passaggi che devono essere eseguite con particolare attenzione e diligenza successo per l'isolamento della microglia con la più alta purezza e resa. Questi passaggi sono: 1) il mantenimento di una sterile, cultura sana in tutta la procedura di sperimentazione; 2) la rimozione di tutte le meningi dalla cortiche durante microdissezione, 3) un adeguato lavaggio di macinazione piastra e forbici dopo la macinatura cortecce; 4) equilibrante MCM in T-75 palloni in incubatrice prima di iniziare microdissezione; 5) rialimentazione 24 ore post-isolamento.
Poiché microglia sono le cellule immunitarie residenti del SNC, sono altamente sensibili alle insulti ambientali. Pertanto, evitando la contaminazione culturale con agenti patogeni è fondamentale per preservare gli attributi immunofenotipiche e funzionali delle cellule microgliali quiescenti. Ispezione quotidiana delle cellule per monitorare la contaminazione e la crescita è parte integrante di evitare colture di cellule compromesse e di acquisire una migliore comprensione della microglia tasso di crescita. Inoltre, è necessario aggiornare MGM 24h alberino placcatura di microglia per mantenere la vitalità cellulare e funzionalità.
Un ostacolo importante da superare nell'isolare microglia è garantire che il tessuto del SNC macinata è libero di cellule endoteliali, che,se presente, può impedire la proliferazione della microglia formando dense colonie nelle colture gliali. Per questo motivo, è fondamentale per rimuovere completamente le meningi SNC durante microdissezione del cervello. Nella nostra esperienza, le meningi dei neonati P3 vengono rimossi con maggiore facilità rispetto neonati P1, in quanto il tessuto è più sviluppato e più facile da visualizzare sotto il microscopio di dissezione. Inoltre, è importante evitare di bagnare il lato dorsale del cervello con DM dopo aver rimosso il cervello dal cranio. Questo può essere fatto mantenendo il cervello in posizione anatomica (dorsale lato alto) quando trasferendolo DM. Mantenendo il lato dorsale del cervello secco consente una migliore visualizzazione e facile rimozione delle meningi.
Abbiamo trovato che il modo più efficace per rimuovere le meningi inserirà il forza # 4 nella porzione più posteriore della fessura interemisferica, e buccia meningi off, lateralmente. Una volta che le meningi dorsali sono stati cancellati, abbiamo poi Remove le meningi ventrali invertendo cervello (ventrale in su), e afferrare delicatamente i bulbi olfattivi e sollevando verso la porzione posteriore del cervello. Abbiamo poi rimuovere ogni residuo di tessuto meningea ventrale delicatamente peeling e pinzette in un movimento laterale. Successiva separazione della corteccia dal resto del cervello è fondamentale per isolare solo microglia corticali. La procedura qui riportata è anche flessibile in quanto può essere utilizzata per isolare microglia dalle regioni sottocorticali, pure. Però, è importante notare che il rendimento cella può essere inferiore a causa della variabilità della densità microglia indifferenti regioni cerebrali cytoarchitectural 40.
Abbiamo trovato che, per massimizzare la resa finale della microglia è importante risciacquare e raccogliere il risciacquo dai materiali utilizzati nel processo di macinazione. Questi risciacqui garantire la collezione completa di tutto il tessuto residuo che può essere rimasta sulle forbici fenditoi, capsula di Petri, e la pipettatip utilizzato per un'aliquota del tessuto tritato nel tubo conico. È importante che questi risciacqui avviene immediatamente dopo il trasferimento del tessuto del SNC macinata al tubo conico, per ottimizzare la vitalità cellulare. E 'anche fondamentale per la vitalità cellulare che le cellule non rimangono in MM per più di 2 minuti dal MM è privo di sostanze nutritive essenziali.
Infine, è fondamentale per preparare i T-75 palloni con MCM e metterli in incubatrice umidificata (37 ° C, 5% CO 2) prima di iniziare il protocollo microdissezione. Matraccio THET-75 ha un rivestimento poroso sotto il tappo che permette lo scambio di gas, facilitando supporti equilibramento prima dell'aggiunta di colture gliali miste. Abbiamo scoperto che la mancata fare questo si traduce in un raccolto microglia non ottimale. E 'anche importante per sigillare il tappo della beuta T-75 con Parafilm prima dell'immissione nel pallone rotativo per minimizzare lo scambio gassoso dentro e fuori del pallone durante la rotazione.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di rapporti commerciali o finanziari che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal NIEHS R01ES014470 (KMZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose | Sigma | G8270 | Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 °C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM. |
| Sodium pyruvate 100 mM (100x) | Hyclone | SH30239.01 | Store at 4 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM. |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Fetal Bovine Serum (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Minimum Essential Medium Earle's (MEM) | Cellgro | 15-010-CV | Without L-glutamine. Contains Earle's salts. Used to make MCM, MGM, and DM. |
| Horse Serum | Gibco | 16050 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Cellgro | 21-021-CV | Without calcium and magnesium. Store at 4 °C. Used to make MM. |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-031 | Store at 4 °C. Used to make MM. |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | Used to stain cell nucleus. |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1. |
| Rabbit anti-NFκB (p65) | Abcam | 7970 | Used at 1/1,250 dilution for ICC staining for p65. |
| Alexa Fluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11012 | Used at 1/1,000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC. |
| 10 ml Disposable Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 50 ml Disposable Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| 15 ml Disposible Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Sterile Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1) | Roboz Surgical | RS-6010 | 1; 5 in; used for removing head |
| Scissor: Vannas (scissor #2) |
Fine Science Tools | 15000-08 | 1; nonangled; 2.5 mm cutting edge; used to open scalp |
| Scissor: Student Vannas (scissor #3) | Fine Science Tools | 91501-09 | 1; curved; used to mince brain tissue |
| Forcep: Dumont #7 (forcep #1) |
Fine Science Tools | 91197-00 | 2; used to secure nose and remove cortices |
| Forcep: Dumont #2 (forcep #2) |
Fine Science Tools | 11223-20 | 1; used to remove scalp |
| Forcep: Dumont #3 (forcep #3) |
Fine Science Tools | 11231-30 | 1; used to remove skull |
| Forcep: Dumont #5a (forcep #4) |
Fine Science Tools | 11253-21 | 1; used to remove meninges |
| Table of Specific Equipment | |||
| Zoom Stereo Dissection Microscope | Olympus | SZ4060 | Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet |
| Laminar-Horizontal Flow Cabinet | Nuaire | NU-201-330 | |
| Biological Safety Cabinet | Labconco | 3440001 | Class II |
| Water-Jacketed CO2 Incubator | VWR | 97025-836 | Set to 37 °C, 5% CO2 |
| Swing-out buckets | Fisher Scientific | 75006441 | To be used with Swing-out rotor |
| Swing-out Rotor | Fisher Scientific | 75006445 | Max Radius: 19.2 (cm) |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge (clinical centrifuge) |
Fisher Scientific | 75-004-377 | With swing-out rotor |
| AccuSpin Micro 17 microcentrifuge (tabletop microcentrifuge) |
Fisher Scientific | S98645 | With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524) |
References
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