Summary
미세 아교 세포 생물학의 성공적인 조사에 하나의 키는 CNS의 조직으로부터 분리하는 동안 생체 미세 아교 immunofunction의 보존이다. 형광 이미징, 면역 세포 화학, 및 염증성 자극 지질 다당류 (LPS)와 팸 3 CSK 4 (팸)와 ELISA 다음 미세 아교 세포의 활성에 의해 평가 매우 순수하고 immunofunctional 세포 배양에 회전 흔들림 결과를 통해 미세 아교 세포를 분리.
Abstract
CNS 조직에서 미세 아교 세포의 분리 생체 미세 아교 세포 생물학을 연구하는 데 사용하는 강력한 조사 도구입니다. 본 발명의 방법은 회전 쉐이커 기계 교반에 의한 신생아 쥐의 피질에서 미세 아교 세포의 분리를위한 절차를 자세히 설명합니다. 이 미세 아교 세포의 분리 방법 수율 생체 내에서 정상 nonpathological 조건에서 대기 미세 아교 세포 나타내는 형태 학적 및 기능적 특성을 나타내는 순도가 매우 높은 대뇌 피질의 미세 아교 세포. 형태 학적 변화, NF-κB (P65)의 P65 서브 유닛의 핵 전좌하고 각인 전 염증성 사이토 카인의 분비, 종양 괴사 인자-α (TNF-α의 유도에 의해 설명 된대로이 절차는 또한 미세 아교 세포 면역 표현형, 생화학 적 기능을 유지 ), 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)와 팸 3 CSK 4 (팸) 문제시. 따라서, 본 분리 절차는 대기와 함께하는 양의 면역 표현형을 유지생체 조건에서 미세 아교 세포 생물학을 연구의 실험 방법을 제공 vated의 미세 아교 세포,.
Introduction
미세 아교 세포는 중추 신경계의 실질의 감시 대식 세포는 성인 포유류의 뇌의 전체 세포 인구의 약 12 %를 차지. 미세 아교 세포는 난황 주머니 골수 전구 세포에서 유래 및 성인 CNS 1-5에서 다른 cytoarchitectural 지역에서 세포의 밀도와 형태가 다양합니다. 건강한 성인의 뇌에서 미세 아교 세포는 미세 동적 프로세스와, 작은 분지 또는 극성 세포입니다. 그러나, 생체 영상 연구는 미세 아교 프로세스가 동적으로 "를 연상시키는 방식으로 확장하고 자신의 미세 환경을 모니터링 철회 입증, 주변 대식 세포의 형태와는 달리, 미세 아교 세포는 세포 비활성 상태로 나타날 수 있습니다 건강한 두뇌에 대기, 로우 프로파일 표현형을 보여 샘플링 및 "6,7를 조사.
미세 아교 세포는 스위칭, 높은 및 차동 뇌의 환경 및 병태 생리 학적 변화에 반응하는각각 음향 상태 - 일반적으로 자신의 휴식으로 간주하고 활성화 상태에 감시자에서. 정품 인증이 스위치는 병원체 - 관련 분자 패턴에 응답 수신자 같은 수용체 (TLR에), (PAMPS), 즉 세균 및 바이러스 유래 지질 단백질로 막 결합 패턴 인식 수용체 (PRRS)의 결합에 의해 매개 될 수있다 , 핵산, 탄수화물 8-11. PAMPS뿐만 아니라, PRRS는 또한 세포 손상 12-16로 CNS의 항상성에 교란을 나타내는 위험 / 손상 관련 분자 패턴 (감쇠)로 알려진 살균, 비병원성 분자,,에 대해 미세 아교 활성화를 유도하기 위해 표시되었습니다. 일단 종사, PRRS는 미세 아교 세포 형태 및 유전자 발현의 변화가 발생 폭포를 신호 세포를 시작, 특히, 활성화 된 미세 아교 세포는 아메바와 같은 표현형을 적용 세포의 핵에 P65 NF-κB의 서브 유닛 (P65)를 이동시키다, 및 상향 조절 produ의ction의과 반응성 산소 종 (ROS) 16 ~ 24과 함께 종양 괴사 인자-α (TNF-α), 인터루킨-1 β (IL-1β)와 같은 염증성 사이토 카인의 분비. 중추 신경계의 선천성 면역 반응에 필수적인 있지만, 이러한 분비되는 분자는 따라서 파킨슨 병과 알츠하이머 병 25-29로 병에 걸린 상태에서 신경 퇴행을 유발 및 악화, 신경 세포의 산화 스트레스를 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
그러나 병적 인 상태에있는 미세 아교 세포 활성화 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 미세 아교 세포 활성화의 생체 기능의 많은 문화에 효과적으로 요약 할 수있다 따라서, 미세 아교 세포의 분리, 이러한 생물 학적 과정에 강력한 조사 도구입니다. 여러 가지 방법 CNS 조직 (30, 31)의 소화 효소 다음 퍼콜 그라데이션을 통해 격리 등의 미세 아교 세포를 분리 사용할 수 있습니다. 그러나, 소화 효소가 변경할 수 있습니다항원 발현 세포 표면 (32)을 감소하고, 본원에 기재된 방법보다 동물 당 낮은 세포 수율 결과로 세포의 면역 표현형. 이전에 퍼콜 그라데이션 수율 3-5 × 10 5 세포 30,33,34를 통해 전체 CNS에서 격리 방법을보고하면서 구체적으로, 우리는 7.5 × 10 5 세포의 강아지 피질 당 평균 미세 아교 세포의 수율을보고합니다. 본 절차는 이에 소교 면역 표현형 및 기능을 유지, 그들의 낮은 부착 특성에 기초하여 미세 아교 세포를 분리하여, 소화 효소의 사용을 우회.
회전 진탕 기, 이전의 확장에 기계적 교반을 통해, 및 C57BL / 6 쥐의 피질 - 본 연구에서는 신생아 이형 CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + /)에서 파생 된 혼합 된 아교 문화에서 미세 아교 세포의 분리를 설명 발행 방법 24,35. 우리는 미세 아교 세포의 쉬운 시각화를위한 이전의 마우스 변형을 활용,로단핵구 특이 적 프로모터 36-38 -이 마우스는 내인성 Cx3Cr1 궤적의 통제하에 GFP를 표현한다. 이 방법은 보존 면역 표현형 생체 박테리아 지질 다당류 (LPS) 또는 팸 3 CSK 4에 도전 할 때 형태 학적 변화, P65의 핵 전좌, 및 TNF-α의 분비에 의해 설명되는 것과 같이, TLR4와 TLR1 / 2 작용제와 고순도의 미세 아교 문화를 생산 였다.
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Protocol
이전에이 프로토콜을 시작으로, 출생 후의 일에 신생아 쥐를 수집 1-3 보호와 따뜻함 원래 케이지 침구 중첩 된 멸균 용기에 (P1-3). 그것은 소교 수율을 최적화하기 위해 이러한 프로토콜을 통해 신속하고 효율적으로 작동하는 것이 중요하다. 전체 시약의 목록은 표 1을 참조하십시오.
1. 악기, 문화, 미디어 및 식기 준비
- 10 ㎖ / 강아지 소교 완료 미디어 (MCM을 준비, 1X 최소 필수 보충 중간 얼의 [MEM] : 1 ㎜의 L-글루타민, 1 mM 피루브산 나트륨, 0.6 % V / V의 D-(+) - 포도당, 100 ㎍ / ㎖의 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S), 4 % V / V 태아 혈청 (FBS), 6 % V / V 말 혈청), 각각의 T-75 플라스크 (1 플라스크 / 강아지)에 추가, 모자 및 장소에 가로, 인큐베이터 (37 ° C에서 5 % CO 2) 1 시간 동안 평형합니다. 그것은 절개를 시작하기 전에 플라스크 (들)이 미디어 평형하는 것이 필수적입니다.
- Prepa다시 나누어지는, 따뜻한 해부 (6 ㎖ / 강아지) 37 ° C의 물을 욕조의 MCM의 세포 재 부유 (2 ㎖ / 강아지)에 대한 별도의 원뿔 튜브 MCM에서. , 및 해부 미디어 (DM; MEM은 100 ㎍ / ㎖의의 P 보충 / : 얼음 닦지 미디어 (;, 100 ㎍ / ㎖의의 P / S, 0.01 M HEPES 3 ㎖ / 강아지 HBSS는 보충 MM)에 대한 준비, 나누어지는 및 오한 S 2 ㎖ / 강아지).
- 10 분 동안 70 % 에탄올에 침수에 의해 다음과 같은 수술 도구를 소독 : 가위 # 1 (1, 목을 벨 수있는)을, # 1 forcep (2, 코를 확보하고 피질을 제거하기 위해), 가위 # 2 (1; nonangled, 열 두피 ,) 가위 # 3 (1 수막을 제거하기 위해,,), forcep # 2 (1,,) 두개골을 제거하는 forcep # 4 (2, # 3 (1 forcep) 두피를 제거하는 뇌 조직을 말하다). 멸균 패드에 공기 건조 할 수 있습니다.
- 70 % 에탄올로 수평 공기가 워크 스테이션과 해부 현미경을 닦습니다.
- 머리를 캡처 2 멸균, 100mm 배양 접시에 DM을 분배 (3 ㎖, 1 / 3 새끼 요리)와 절개 (1 ㎖;해부하기 전에 얼음에 냉장) / 강아지 1 접시. 뇌 조직 (, 1 접시 / 강아지 1 ㎖)를 닦지 1 멸균, 100mm 페트리 접시에 MM을 분배.
2. 뇌 조직 해부
- 이전 안락사에 부드럽게 실험실 조직을 사용하여 70 % 에탄올로 목 강아지의 머리를 소독. 가위 1 번, 빠르게 머리를 제거하여 강아지를 안락사, 캡처 헤드를 이전에 준비 페트리 접시에. 안락사와 다음 동물로 진행하기 전에 한 강아지의 절개를 완료합니다.
- 냉장 해부 접시에 머리를 이동, 개방 두피를 만들어 가위 # 2를 사용하여, 해부 현미경 # 1 (또는, 머리가 눈을 소켓을 통해 집게를 관통하여 고정 할 수 있습니다) forcep을 사용하여 코를 곤란하게하여 머리를 고정 Y-컷 : 머리의 기지에서와 눈을 향해 각도로 시작합니다. 부드럽게 두개골을 노출, 횡 방향으로 박리하여 두피를 제거 # 3 forcep 사용합니다.
- forcep # 3를 사용하여 부드럽게베이스에 결합 조직을 제거머리. 그립,, 두개골의 기초가 (interhemispheric 균열 다음) 뇌와 두개골 사이의 forcep의 한 팔을 나사에 의해 조심스럽게 열고 두개골을 노출되면 부드럽게 열고 눈물을 위쪽으로 머리를 당겨.
- forcep 번호를 사용하여 두뇌의 복부 측면에서 결합 조직을 방해하고,이어서 같은 도구를 사용하여 뇌를 제거합니다. 두뇌의 복부 측면에서 위쪽으로 힘을 사용하여 두개골 밖으로 뇌를 들어 올립니다.
- 의 해부학 적 위치에 머리를 계속 : 등쪽면은 해부 현미경 하에서 피질을 시각화를 향, 중뇌 및 피질의 교차점에 포셉의 팁을 삽입하여 장소에 두뇌를 확보, 완전히 forcep 번호 4 대뇌 피질의 수막을 제거, 다음 복부 수막을 제거하기 위해 진행합니다. 수막이 완전히 제거되면, forcep # 4를 사용하여 뇌의 나머지 부분에서 피질을 분리합니다. 그것은 완전히 미세 아교 세포의 순도와 yiel을 극대화하기 위해 수막 조직을 제거하는 것이 필수적입니다D.
3. 뇌 조직 닦지
- 전송 피질 이전에 접시를 닦지 준비하는, 클래스 II 생물 안전 캐비닛에 멸균 기술을 사용하여 단계를 닦지를 계속합니다.
- 가위 # 3를 사용하여 말하다 뇌 조직, 15 ML 원뿔 튜브로 전송 다진 조직;., 가위 및 MM 각 1 ㎖로 닦지 요리를 씻어 수집하고 다진 조직을 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에 린스를 분배이 세정 단계는 극대화 모든 잔여 조직이 원뿔 튜브로 전송하도록함으로써 미세 아교 세포의 수율. 다진 조직이 튜브의 바닥에 정착 할 수 있도록 1 ~ 2 분 동안 방해받지 조직 현탁액을 남겨주세요. MM은 필수 영양소를 포함하지 않는 2 분을 초과하지 마십시오.
- 조심스럽게 제거하고 정착 다진 - 조직을 방해하지 않도록 확실히하는 표준 피펫 팁으로 일반 1,000 μL의 micropipettor와 상층 액 2 ㎖를 폐기합니다. 다진 - 조직에 MCM의 3 ㎖를 추가, 표준 피펫 팁으로 일반 1,000 μL의 micropipettor를 사용하여 전체 힘으로 조직을 씹다 분쇄가 완료되면 뚜렷한 단단한 조직이 남아 있어야합니다.. 피펫 팁에서 잔류 분쇄 샘플을 수집, 같은 피펫 팁과 MCM의 또 다른 3 ML을 추가합니다.
4. 성장 외피 세포
- 원심 분리기 세포 (215 XG, 5 분, RT, 스윙 버킷 로터 임상 원심 분리기를) 펠렛 다진 조직. 생물 안전 캐비닛에 펠렛 세포를 반환 제거하고 상층 액을 버린다, 부드럽게 세포 펠렛 (; MCM 2 ㎖ / 튜브) 재현 탁 이전에 제조 된 T-75 플라스크에 세포 재 부유를 추가, 플라스크 모자와에 수평으로 배치 가습, 표준 조직 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5 % CO 2). 세포는 24 시간 동안 배양 할 수 있습니다.
- 24 시간 후, 부드럽게 방해하는 손의 손바닥에 플라스크를 누릅니다조직 파편. 이전과 파편의 완전한 제거를 보장하기 위해 도청 후 세포를 확인합니다. 설정 플라스크 수직, 제거 및 미디어를 폐기, 플라스크의 바닥에 신선한 MCM을 추가 (12 ㎖를, 37 ° C), 모자, 수평, 인큐베이터에 배치합니다.
- 오염 매일 세포를 확인하고 성장을 모니터링 할 수 있습니다.
- 시험 관내 (DIV)의 약 17~21일, 미세 아교 세포가 혼합 된 아교 세포 배양에서 수확을위한 준비가 될 것입니다. 세포가 준비되어 있는지 확인하려면, 반전 위상차 현미경으로 세포를 검사합니다. 소교 수확 준비가되면 40 % 자랄 ~에. 그들은 다른 아교 위에 단층으로 성장하고, 작고, 밝고, 구형 세포로 나타납니다.
5. 혼합 된 아교 문화에서 소교 세포의 분리
- 미세 아교 세포를 분리하기 위해, 적극적으로 실험실 벤치에 플라스크를 누릅니다. 이 동요는 미세 아교 세포의 낮은 부착 특성으로 인해 다른 glial 세포에서 분리 된 미세 아교 세포를하는 데 도움이됩니다.
- 펠릿 미세 아교 세포 (215 XG,, 5 분, 버킷 로터 스윙) 상층 액을 멸균 원뿔 원심 분리 관에 미세 아교 세포를 포함하는 미디어를 수집합니다.
- ~ 2;, 0.6 % V / vglucose, 1 ㎜의 L-글루타민, 100 ㎍ / ㎖의의 P / S, 5 % V / V FBS 1 mM의 피루브산 나트륨 :; 따뜻한 미세 아교 세포 성장 매체 (MGM에서 미세 아교 세포 펠렛을 재현 탁 MEM은 보충 ML / 플라스크)을 사용하여 혈구 세포 농도를 결정하고, 플레이트 (1) X 10 24 - 웰 플레이트 포맷에서 105 세포 / 웰플라스틱 (500 μL / 잘, MGM) 멸균 유리 커버 전표.이 절차를 사용하여 평균 미세 아교 세포의 수율은 7.5 × 10 5 세포 / 강아지 피질이다.
- 24 시간 게시물 도금, 부동 세포 파편을 제거하기 위해 신선한 MGM (37 ° C)와 미디어 및 재 공급 세포를 모두 제거합니다.이 단계는 세포 생존하고 대기 미세 아교 세포를 유지하는 것이 중요합니다. 세포를 즉시 재 이송 후 실험에 이용 될 수있다.
6. 예 트리트먼트
- 팸 3 CSK 4 (팸)의 / ㎖, 10 NG / ㎖ 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) 또는 차량 제어를 겨 (10)에 세포를 노출, 배양기에서 2 ~ 24 시간 동안 배양 (37 ° C, 5 % CO 2).
7. 기능 예 생체를 통해 면역 이미징 및 면역 세포 화학 소교 분석
- 의 미세 튜브 (1.5 ㎖), 원심의 처리, 수확 세포 배양 매체 후미디어를 취소, ifuge 탁상 마이크로 원심 (900 XG 2 분)를 사용. 깨끗한 미세 원심 분리 튜브에 뜨는을 전송, 분석 즉시, 또는 상점 -20 ° C에서 사용할 준비가 될 때까지. 상업적으로 이용 가능한 마우스 TNF-α ELISA 키트를 통해 세포 배양 상층 액의 TNF-α의 농도를 분석합니다.
- 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)로 세포를 씻어 4 %로 세포를 고정 (w / v)의 파라 포름 알데히드 / 4 % (W / V) 크로스 / PBS 산도 7.4 (4 % PFA, 15 분, RT). 고정 후, 부드러운가 진탕에 떨고으로 5 분 동안 PBS로 세포를 씻어.
- 면역 / 면역 세포 화학. 고정하고 PBS는 면역 세포 화학, 공정 미세 아교 세포를 세척 한 후. 부드러운 흔들림으로 수행의 모든 단계. PBS/0.1 % 트리톤 X-100에서 세포를 투과, 한 시간 동안 PBS/10 % 정상 염소 혈청에있는 블록 세포. 또는 버퍼를 차단하는 토끼 항 이바-1 항체 (7백50분의 1) 토끼 반대로 NF-κB의 항체 (1 / 1, 250 P65 서브 유닛)으로 4 ° C에서 세포를 O / N을 품어. 시각항원이지는 : 형광 복합 염소 항 - 토끼 IgG의 차 항체 (1 시간, 1 / 1, 000)와 함께 배양 한 다음 항체 복합체. PBS/0.1 % 트리톤 X-100 (3 배 5 분)로 세척하여 언 바운드 차 항체를 제거합니다.
- 4 ', 6 - Diamidino -2 - 페닐 인돌 / PBS (DAPI, 0.1 ㎍ / ㎖)와 카운터 얼룩 세포. 세포의 핵을 시각화하기는 CX3CR1-GFP + /에서 파생 된 모든 미세 아교 세포 - 마우스는 GFP를 표현한다. DAPI를 시각화하는 350 nm 파장의 필터를 활용, GFP를 시각화하는 488 nm 파장 필터, 그리고 594 nm 파장 필터는 P65와 이바-1 면역 복합체를 시각화 할 수 있습니다.
- 마운트 커버 실장 수성 용액을 사용하여 형광 현미경을 사용하여 미세 아교 세포를 시각화 미끄러진다.
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Representative Results
격리하는 동안 미세 아교 세포 생체의 면역 표현형 및 기능을 유지하는 미세 아교 세포 생물학에 대한 조사의 모델로이 세포를 활용할 수있을 것이 중요합니다. (-와 C57BL / 6 CX3CR1-GFP + /) 및 LPS 또는 팸 하나와 처리 문화를 본 방법을 사용하여 미세 아교 세포의 immunofunctionality의 성공적인 보존을 설명하기 위해, 우리는 P3의 신생아에서 대뇌 피질의 미세 아교 세포를 고립.
도 1a에 도시 된 바와 같이, 회전 흔들림을 통해 교반을 통해 미세 아교 세포의 분리는 정상 생체 내 조건에서 미세 아교 세포에 의한 정지 표현형을 유지합니다. 소교 순도를 평가하기 위해, CX3CR1-GFP + / - 세포 배양 식세포 항원 이바-1과 세포핵을 시각화하기 위해 DAPI로 염색 카운터 염색 하였다. prese를 통해 낮은 배율, 미세 아교 세포의 격리에서 그림 1A 및 1B에 도시 된 바와 같이,ntly 세포의 95 % 이상으로서, 고순도의 세포 배양 방법의 결과를 설명은 GFP, 이바-1, 및 DAPI의 colocalization을 출품.
우리는 다음 LPS와 함께 세포에 도전하여 미세 아교 세포 생체의 응답을 확인하기 위해 노력했다. 차량 처리에 비해, LPS 처리 CX3CR1-GFP는 + / -. 그림 (b)에 도시 한 바와 같이 미세 아교 세포는 아메바 같은 모양에 작은, 바이폴라 표현형에서 뚜렷한 형태 변화에 적응이 형태 변화는 고립 된 대뇌 피질의 미세 아교 세포에 효과적으로 요약된다 팸으로 처리 C57BL / 6 신생아 (그림 2)에서. 다른 자극으로 활성화 전적으로 별개의 미세 아교 세포 사이의 보존 형태 학적 반응은 다양한 실험 모델에 관해서 재현성이 의정서의 적용을 강조.
형태의 변화가 활성화 39 나타내는하더라도, 그것은 D에 필요한etermine 미세 아교 세포가에 의해 고립 된 경우 회전 기능 TLR-매개 세포 내 신호의 보존을 나타내는 활성화에 P65를 이동시키다 수있는 능력을 유지 흔들어. 이 신호 폭포를 확인하기 위해, 우리는 팸 C57BL / 6 신생아에서 분리 된 미세 아교 세포를 치료. 그림 2에 나타낸 바와 같이, P65에 대한 면역 세포 화학적 염색은 팸 2 시간 자극 한 후, P65 면역 반응이 극적으로 세포의 핵에 지역화를 이동 반면, 정상적인 조건에서, P65가 확산, 세포질에 걸쳐 현지화된다는 것을 입증.
제시된 방법을 통해 고립 된 미세 아교 세포가 여기에 핵 P65를 이동시키다하는 분자 메커니즘을 유지하는 것이 설립하는 데, 우리는 다음이 격리 된 미세 아교 세포가 활성화시 특징 염증성 사이토 카인 TNF-α를 분비 할 수있는 능력을 테스트하여 자신의 생화학 immunofunctionality을 유지 확인하고 싶어 . 그림 3에서에서와 같이각각 신호 전달 경로 기능 TLR1 / 2 andTLR4 나타내는,,, 차량 처리 된 미세 아교 세포에 비해, 팸 또는 LPS에 노출 된 세포 배양 배지 (일원 분산 분석 P <0.0001)로 TNF-α의 분비를 증가시킨다.
따라서 함께 촬영, 이러한 데이터는 생체 보존 면역 표현형과 기능을 가진 고순도의 세포 배양에 회전 흔들림 결과를 통해 미세 아교 세포의 격리를 설정합니다.
.. P3에서 신생아 쥐를 24 시간 동안 차량 (A), 또는 세균의 LPS (B) 중 하나를 처리 - 그림 1 로타리 수율에게 보존 면역 표현형을 가진 고순도 미세 아교 문화를 흔들어 미세 아교 세포는 CX3CR1-GFP + /에서 분리되었다.세포는 4 % immunocytochemically 이바-1 염색 PFA, 및 DAPI로 염색 카운터 수정되었습니다. (A) 소교 PBS 전시 바이폴라, 정지 표현형으로 처리 하였다. (B) LPS 도전하면, 미세 아교 세포 활성화를 나타내는 아메바 같은 표현형을, 적응시킨다. 10X 배율 하에서 병합 패널의 채널 (A) 및 (B)는 세포의> 95 % GFP/Iba-1 양성 세포임을 보여준다. 10 배의 스케일 바 : 100 μm의, 40 배의 스케일 바 : 20 μm의이. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 소교를 통해 격리 회전 팸 차에 핵 셀에 NF-κB를 이동시키다 동요llenge. 미세 아교 세포는 P3에서 C57BL / 6 신생아에서 분리하고 2 시간 동안 차량이나 팸으로 처리 하였다. 세포는 4 % PFA로 고정 및 면역 세포 화학을 통해 P65에 염색 하였다. 균체 카운터 세포핵을 시각화 DAPI로 염색 하였다. 팸 자극 P65의 핵 전좌를 유도하는 반면 차량 처리 미세 아교 세포에서 P65는 세포질에 걸쳐 현지화되어 있습니다. 40 배의 스케일 바 :. 20 μm의는 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
팸 또는 LPS에 노출시 회전 흔들림 릴리스 TNF-α와 격리 그림 3. 소교. 미세 아교 세포는 P3에서 C57BL / 6 신생아 생쥐에서 분리 된 차량을 시행 하였다, 팸, 또는 2 시간 동안 LPS. 세포 배양 상층 액은 TNF-α 릴리스에 대한 ELISA를 통해 수집하고 분석 하였다. *** P <0.0001 (N = 2, 일원 분산 분석). 데이터는 ± SD를 의미하는 형식으로 표시하고 있습니다.
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Discussion
본 절차는 신생아 쥐에서 대뇌 피질의 미세 아교 세포의 분리를위한 효과적인 방법을 제공합니다. 이 절차는 형광 이미징, 면역 세포 화학 및 ELISA에 의해 결정, 1) 보존 미세 아교 세포의 면역 표현형과 기능의 두 가지 이점을 제공하고, 2) 미세 아교 세포는 이전에 다른 glial 세포 (성상 세포 및 oligodentrocytes)의 존재로 성숙 할 수 있도록 아교 문화의 성숙 기간 동안 중요한 세포 - 세포 상호 작용을 용이하게 할 수있다 격리. 중요한 것은, 고립 된 세포가 유지 기능과 면역 표현형 생체 높은 생존 능력과 균일 성을 나타내었다.
높은 순도와 수율 미세 아교 세포의 성공적인 분리를 위해 특별한 관심과 근면으로 수행해야 할 몇 가지 단계가 있습니다. 이 단계는 다음과 같다 : 1) 전체 실험 절차를 통해 살균, 건강한 문화를 유지, 2) 고전에서 모든 수막을 제거tices 미세 절제하는 동안, 피질을 닦지 후 접시와 가위를 닦지 3) 적절한 세척, 4) 미세 절제를 시작하기 전에 인큐베이터에서 T-75 플라스크에 MCM을 평형화, 5) 24 시간 후 격리를 재 이송.
미세 아교 세포는 중추 신경계의 면역 세포에 거주하기 때문에, 그들은 환경 모욕에 매우 반응이다. 따라서, 병원체와 문화의 오염을 방지하는 대기 미세 아교 세포의 immunophenotypic 및 기능 특성을 유지에 매우 중요합니다. 오염 및 성장을 모니터링하는 셀의 일상 점검은 손상된 세포 배양을 피하고 소교 성장 속도의 더 나은 이해를 얻기 위해 일체형이다. 또한, 세포 생존과 기능을 유지하기 위해 미세 아교 세포의 MGM 24 시간 포스트 도금을 리프레쉬 할 필요가있다.
미세 아교 세포를 분리 극복하기위한 주요 장애물은 다진 CNS 조직은 혈관 내피 세포의 자유를 보장하는 것입니다,하는,존재하는 경우, 아교 문화 밀도 식민지를 형성하여 미세 아교 세포의 증식을 방해 할 수 있습니다. 이 때문에, 철저 뇌의 미세 절제 동안 CNS의 수막을 제거하는 것이 중요하다. 조직이 더 많은 선진국과 해부 현미경으로 시각화하는 것이 더 쉽습니다 우리의 경험에 의하면, P3 신생아의 수막은 P1 신생아보다 쉽게 제거됩니다. 또한 그것은 두개골로부터 뇌를 제거한 후 DM으로 뇌의 등쪽 습윤제 피하는 것이 중요하다. 이 DM로 전송하면 해부학 적 위치 (지느러미 쪽까지)에 뇌를 유지하여 수행 할 수 있습니다. 뇌 건조 등의 측면을 유지하는 것은 더 나은 시각화 및 수막 쉽게 제거 할 수 있습니다.
우리는 수막을 제거하는 가장 효과적인 방법은 interhemispheric 균열의 가장 뒤쪽 부분에 힘 # 4를 삽입하고, 옆으로 껍질 수막 떨어져 있음을 발견했다. 등의 수막이 해제되고 나면, 우리는 레모뇌 (복부 쪽까지)를 반전, 부드럽게 후각 전구를 잡고 다시 뇌의 뒤쪽 부분으로 박리하여 복부 수막을했습니다. 우리는 부드럽게 필링 및 횡 방향 운동에 뽑기로 남아있는 복부 뇌막 조직을 제거합니다. 뇌의 나머지 피질의 후속 분리는 대뇌 피질의 미세 아교 세포를 분리 중요합니다. 그것뿐만 아니라, 피질 영역에서 미세 아교 세포를 분리하기 위해 사용될 수 있다는 점에서 본원에서 설명 된 절차로는 유연하다. 하지만, 그것은 세포 수율로 인해 미세 아교 세포 밀도 무관심 cytoarchitectural 뇌 영역 (40)의 변화에 낮을 수 있습니다하는 것이 중요합니다.
우리는 닦지 공정에 사용되는 재료로 헹굼 씻어 수집하는 것이 중요하다 미세 아교 세포의 최종 수율을 극대화 할 수있는 것으로 나타났습니다. 이 린스는 전체 닦지 가위에 남아있을 수있는 모든 잔여 조직의 수집, 페트리 접시, 피펫을 보장팁은 원뿔 튜브에 다진 조직을 나누어지는 데 사용됩니다. 그것은 이러한 헹굼은 세포 생존 능력을 최적화하기 위해, 원뿔형 튜브에 다진 CNS 조직을 전사 후 즉시 수행하는 것이 중요하다. 또한, MM은 필수 영양소의 결여 때문에 세포가 2 분 이상을위한 MM에서 숙박하지 않는 세포 생존에 매우 중요합니다.
마지막으로, 그것은 MCM와 T-75 플라스크를 준비하고 배양기에 배치하는 데있어 매우 중요합니다 (37 ° C, 5 % CO 2) 미세 절제 프로토콜을 시작하기 전에. THET-75 플라스크 혼합 된 아교 문화를 추가하기 전에 미디어 평형을 촉진, 가스를 교환 할 수 있습니다 자사의 모자에서 다공성 안감이 있습니다. 우리는이 작업을 수행하는 실패가 최적이 아닌 미세 아교 수확 결과 나타났습니다. 그것은 종래 회전시키면서 및 플라스크 밖으로 기체 교환을 최소화하기 위해 회전 진탕 플라스크를 배치하는 파라 필름으로 T-75 플라스크의 뚜껑을 밀봉하는 것도 중요하다.
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Disclosures
저자는 연구가 관심의 충돌 가능성으로 해석 될 수있는 모든 상업적 또는 금융 관계의 부재에서 수행 된 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIEHS R01ES014470 (KMZ)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose | Sigma | G8270 | Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 °C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM. |
| Sodium pyruvate 100 mM (100x) | Hyclone | SH30239.01 | Store at 4 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM. |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Fetal Bovine Serum (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Minimum Essential Medium Earle's (MEM) | Cellgro | 15-010-CV | Without L-glutamine. Contains Earle's salts. Used to make MCM, MGM, and DM. |
| Horse Serum | Gibco | 16050 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Cellgro | 21-021-CV | Without calcium and magnesium. Store at 4 °C. Used to make MM. |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-031 | Store at 4 °C. Used to make MM. |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | Used to stain cell nucleus. |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1. |
| Rabbit anti-NFκB (p65) | Abcam | 7970 | Used at 1/1,250 dilution for ICC staining for p65. |
| Alexa Fluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11012 | Used at 1/1,000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC. |
| 10 ml Disposable Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 50 ml Disposable Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| 15 ml Disposible Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Sterile Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1) | Roboz Surgical | RS-6010 | 1; 5 in; used for removing head |
| Scissor: Vannas (scissor #2) |
Fine Science Tools | 15000-08 | 1; nonangled; 2.5 mm cutting edge; used to open scalp |
| Scissor: Student Vannas (scissor #3) | Fine Science Tools | 91501-09 | 1; curved; used to mince brain tissue |
| Forcep: Dumont #7 (forcep #1) |
Fine Science Tools | 91197-00 | 2; used to secure nose and remove cortices |
| Forcep: Dumont #2 (forcep #2) |
Fine Science Tools | 11223-20 | 1; used to remove scalp |
| Forcep: Dumont #3 (forcep #3) |
Fine Science Tools | 11231-30 | 1; used to remove skull |
| Forcep: Dumont #5a (forcep #4) |
Fine Science Tools | 11253-21 | 1; used to remove meninges |
| Table of Specific Equipment | |||
| Zoom Stereo Dissection Microscope | Olympus | SZ4060 | Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet |
| Laminar-Horizontal Flow Cabinet | Nuaire | NU-201-330 | |
| Biological Safety Cabinet | Labconco | 3440001 | Class II |
| Water-Jacketed CO2 Incubator | VWR | 97025-836 | Set to 37 °C, 5% CO2 |
| Swing-out buckets | Fisher Scientific | 75006441 | To be used with Swing-out rotor |
| Swing-out Rotor | Fisher Scientific | 75006445 | Max Radius: 19.2 (cm) |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge (clinical centrifuge) |
Fisher Scientific | 75-004-377 | With swing-out rotor |
| AccuSpin Micro 17 microcentrifuge (tabletop microcentrifuge) |
Fisher Scientific | S98645 | With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524) |
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