Summary
Одним из ключей к успешной расследования микроглии биологии является сохранение микроглии immunofunction экс естественных условиях в процессе выделения из ткани ЦНС. Изоляция микроглии через ротационным качанием результатов в высокочистых и immunofunctional клеточных культурах по оценке флуоресцентных изображений, иммуноцитохимии и ELISA после активации микроглии с провоспалительных стимулов липополисахарида (ЛПС) и Пэм 3 ЦСК 4 (Пэм).
Abstract
Выделение микроглии из ткани ЦНС является мощным исследовательским инструментом используется для изучения микроглии биологию экс естественных. Настоящий способ подробно процедуру для изоляции микроглии из неонатальных мышиных коры с помощью механического перемешивания с роторной качалке. Эта изоляция микроглии метод дает очень чистые корковых микроглии, которые проявляют морфологические и функциональные характеристики, указывающие на покоящихся микроглии в нормальных, непатологических условиях в естественных условиях. Эта процедура также сохраняет микроглии иммунофенотип и биохимический функциональность как показали индукции морфологических изменений, ядерной транслокации р65 субъединицы NF-kB (p65) и секреции чертой провоспалительных цитокинов, фактор некроза опухоли-α (ФНО-α ), на липополисахарида (ЛПС) и Пэм 3 ЦСК 4 (Пэм) проблемы. Таким образом, настоящее процедура изоляции сохраняет иммунофенотип обоих покоя и мероприятияотключенной микроглии, обеспечивая экспериментальный метод исследования микроглии биологию в бывших естественных условиях условиях.
Introduction
Клетки микроглии, макрофаги наблюдения паренхимы ЦНС, составляют около 12% от общего клеточной популяции взрослого мозга млекопитающих. Микроглия выводятся из желточного мешка миелоидных клеток-предшественников и различаются по плотности клеток и морфологии в различных cytoarchitectural регионов в взрослой ЦНС 1-5. В здоровом взрослом мозге, микроглии небольшие, разветвленные или полярные клетки с мелкими, динамических процессов. В отличие от периферической макрофагов морфологии, микроглии продемонстрировать покоя, низкопрофильный фенотип у здоровых мозгов, которые могут появиться как сотовый бездействия, однако в естественных условиях исследования изображений показывают, что микроглии процессы динамически расширить и убрать для контроля за их микросреду таким образом, напоминает " отбор проб и геодезия "6,7.
Микроглия высоко и дифференциально реагировать на окружающую среду и патофизиологических изменений в головном мозге, переключениеот Surveillant к государственным обычно рассматривается как их покоя и активированного государств эффекторных соответственно. Этот переключатель в активации может быть опосредованы рецепторами зацепления мембраносвязанных распознавания образов (PRRS), такие как платные-подобных рецепторов (TLR,), которые реагируют на патоген-ассоциированных молекулярных структур (PAMPs), а именно бактериальных и вирусных-производных липопротеинов , нуклеиновые кислоты, углеводы и 8-11. В дополнение к PAMPs, РРСС, также было показано, чтобы вызвать активации микроглии против стерильных непатогенных молекул, известных как опасность / повреждения связанных молекулярных моделей (DAMPS), которые представляют собой возмущение в ЦНС гомеостаза, таких как повреждение клеток 12-16. После включения РРСС инициировать внутриклеточных каскад, который приводит к изменениям в микроглии морфологии клеток и генной экспрессии сигнализации, а именно, активированной микроглии адаптировать фенотип амебоидной-как, перемещать р65 NF-kB субъединицы (P65) в ядро клетки, и активируют произвоводств и секреция провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли-α (ФНО-α), интерлейкин-1 β (IL-1β), наряду с активными формами кислорода (АФК) 16-24. Хотя интеграл в врожденного иммунного ответа ЦНС, эти выделяемые молекулы также было обнаружено увеличение нейронов окислительный стресс, тем самым вызывая и обостряя нейродегенерацию в пораженных государств, таких как болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера 25-29.
Тем не менее, механизмы активации микроглии в патологических состояний полностью не выяснены. Таким образом, изоляция микроглии является мощным исследовательским инструментом в этих биологических процессов, так как многие в естественных особенностей активации микроглии может быть обобщены в культуре. Существует несколько методов для выделения микроглии, в том числе изоляции через градиентом Перколла следующие ферментативного переваривания ткани ЦНС 30,31. Тем не менее, ферментативное расщепление может изменитьиммунофенотип клеток путем снижения клеточной поверхности антиген выражение 32, и приводит к снижению выхода клеток на животное, чем методом, описанным в данном документе. В частности, мы сообщаем средний урожай микроглии за щенка коры 7,5 х 10 5 клеток, в то время как ранее сообщалось методы изоляции от всей ЦНС через Перколла градиента доходности 3-5 × 10 5 клеток 30,33,34. Настоящая процедура обходит использование пищеварения ферментов по изоляции микроглии на основе их свойств низкой приверженности, тем самым сохраняя микроглии иммунофенотип и функциональность.
В настоящем исследовании мы описывают выделение клеток микроглии из смешанных глиальных культурах, полученных из новорожденных гетерозиготных CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -), и C57BL / 6 мышей коры через механическим перемешиванием на роторной качалке, расширение ранее опубликовал метод 24,35. Мы используем бывшего напряжение мыши для легкой визуализации микроглии, какэти мыши выразить GFP под контролем эндогенного локуса CX3CR1 - моноцитов-специфического промотора 36-38. Этот метод дает очень чистые микроглии культурами в консервированных иммунофенотипа исключая виво, как показано на морфологических изменений, ядерной транслокации р65 и секреции TNF-α, когда вызов с бактериальным липополисахаридом (ЛПС) или Pam 3 CSK 4, TLR4 и TLR1 / 2 агонистов , соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Перед началом этого протокола, собирать новорожденных мышей в послеродовых дней 1-3 (Р1-3) в стерильный контейнер вложенных с оригинальным клетке подстилки для защиты и тепла. Важно работать быстро и эффективно через этот протокол, чтобы оптимизировать микроглии выход. Пожалуйста, см. таблицу 1 для полного списка реагента.
1. Подготовка инструментов, культурой, а блюда
- Подготовка 10 мл / щенка микроглии полной среде (MCM; 1x минимальной основной среде Эрла [MEM] дополнен: 1 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 0,6% объем / объем D-(+)-глюкозы, 100 мкг / мл пенициллина / стрептомицина (P / S), 4% объем / объем фетальной сыворотки теленка (FBS), 6% об / об сыворотки лошади), а также добавить к каждой Т-75 колбу (1 колбу / детенышей); крышка и место горизонтально в инкубатор (37 ° С, 5% СО 2), чтобы уравновесить в течение 1 часа. Важно, чтобы уравновесить это средства массовой информации в колбе (ов), прежде чем начать вскрытие.
- Prepaповторно, аликвоту, и тепло в 37 ° С водяной бане MCM для вскрытия (6 мл / щенков) и в отдельном MCM коническую трубку для сотового ресуспендированием (2 мл / щенка). Подготовка, аликвоту, и охладить на льду Минсинг Media (HBSS мм; дополненной: 100 мкг / мл P / S, 0,01 М HEPES, 3 мл / детенышей) и рассечения информации (СД; MEM с добавлением 100 мкг / мл P / S; 2 мл / щенок).
- Стерилизация следующие хирургические инструменты погружением в 70% этаноле в течение 10 мин: ножницы # 1 (1; обезглавить), Forcep № 1 (2;, чтобы обеспечить нос и удалить кору), ножницы # 2 (1; nonangled; открыть головы ), Forcep № 2 (1; удалить кожу головы), Forcep № 3 (1; удалить череп), Forcep № 4 (2; удалить мозговые оболочки), ножниц № 3 (1; рубить ткани мозга). Дайте высохнуть на воздухе на стерильной площадку.
- Протрите горизонтально-воздушного потока рабочей станции и рассечение микроскоп с 70% этанола.
- Внесите DM на 2 стерильных, 100 мм чашки Петри для захвата голову (3 мл; 1 блюдо / 3 щенков) и рассечение (1 мл;1 блюдо / щенок, охлаждали на льду перед вскрытием). Внесите ММ в 1 стерильной, 100 мм чашки Петри для мясорубки ткани мозга (1 мл; 1 блюдо / щенка).
2. Мозговая ткань Рассечение
- До эвтаназии, мягко санировать шею и голову щенка с 70% этанола с помощью лабораторной ткани. С ножницами № 1, быстро усыпить щенка, удалив голову; захвата голову в предварительно подготовленную чашку Петри. Усыпить и завершить вскрытие одного щенка, прежде чем перейти к следующему животного.
- Перенести голову к охлажденному рассечение блюдо; под микроскопом рассечение обеспечить головой, зажимая нос, используя Forcep № 1 (в качестве альтернативы, головка может быть обеспечено путем прокалывания щипцы через глазницы), открытые головы с помощью ножниц № 2 путем создания Y-рез: начать от основания головы и под углом к глазам. Используйте Forcep № 3, чтобы мягко удалить кожу головы пилинг с боков, обнажая череп.
- Использование Forcep № 3, аккуратно удалить соединительную ткань в основанииГлава. Когда база черепа подвергается, тщательно открытый череп, пронизывая одну руку из Forcep в между мозгом и черепом (после межполушарной щели); сцепление; осторожно потяните череп вверх, чтобы разорвать.
- Сорвать соединительную ткань под вентральной стороне мозга с помощью Forcep № 1, а затем удалить мозг, используя тот же инструмент. Поднимите мозг из черепа с помощью направленную вверх силу под вентральной стороне мозга.
- Держать мозг в анатомическом положении: спинной стороной вверх, чтобы визуализировать кору под микроскопом рассечение; обеспечить мозг на месте путем вставки кончики щипцов на пересечении среднего мозга и коре; полностью удалить корковых мозговых оболочек с Forcep # 4, затем приступить к удалению вентральной мозговые оболочки. После того, как мозговые оболочки были полностью удалены, отделить кору от остальной части мозга с помощью Forcep # 4. Важно, чтобы полностью удалить мозговых оболочек ткани, чтобы максимизировать чистоту микроглии и yielг.
3. Мозговая ткань Mincing
- Коре Переезд в предварительно приготовленный мясорубки блюдо; продолжать мясорубки шаг с использованием стерильной техники в класс II Кабинета биологической безопасности.
- Фарш мозговой ткани с помощью ножниц № 3; передача измельченной ткани в 15 мл коническую трубку;. Промыть ножницы и мясорубки блюдо с 1 мл ММ каждого, собирать и распределять полоскания в 15 мл коническую трубку с фарш ткани Этот шаг полоскания будет максимизировать выход микроглии, гарантируя, что весь остаточный ткань переносили в коническую пробирку. Оставьте тканевой суспензии в покое на 1-2 мин, что позволяет измельченной ткани, чтобы поселиться в нижней части трубы. Не превышать 2 мин, как ММ не содержит необходимые питательные вещества.
- Осторожно снимите и выбросьте 2 мл супернатанта с общей 1000 мкл микропипетки со стандартным наконечником пипетки, убедившись, что не нарушить устоявшуюся фарш-ткани. Добавьте 3 мл MCM к мясным-ткани; растирают ткани с полной силой с помощью универсального 1000 мкл микропипетки со стандартным наконечником пипетки без видимых твердых тканей не должно оставаться, когда растирание завершена.. Добавить еще 3 мл MCM с тем же наконечником пипетки, сбор остаточного растирают образца от кончика пипетки.
4. Растущие корковых клеток
- Центрифуга измельченной ткани для осаждения клеток (215 XG; 5 мин; РТ; клиническая центрифуга с Бакет ротор). Вернуться осажденные клетки к биологической безопасности кабинета, снимите и выбросьте супернатант; мягко ресуспендируют осадок клеток (2 мл / трубки; MCM); добавить клеток ресуспендирование к заранее подготовленной Т-75 колбу; довершение колбу и поместить его горизонтально в увлажненный, стандарт тканевой культуры инкубатор (37 ° С, 5% СО 2). Разрешить клетки инкубировать 24 часов.
- После 24 часов, слегка постучите колбу против ладони сорватьткани мусора. Проверьте клетки до и после нажатия, чтобы обеспечить полное удаление мусора. Набор колбу вертикали; удалить и выбросить информации; добавить свежий мкм до дна колбы (12 мл; 37 ° С); колпачок и поместить обратно в инкубатор, в горизонтальном направлении.
- Проверьте клетки ежедневно загрязнения и контролировать рост.
- В примерно 17-21 дней в пробирке (DIV), клетки микроглии будет готов для урожая от смешанного глиальных культуры. Чтобы определить, клетки готовы, изучения клеток под перевернутой фазе контрастного микроскопа. Микроглия готовы для сбора урожая, когда на ~ 40% слияния. Они появляются в виде небольших, ярких, сферических клеток, растет в виде монослоя на вершине другой глии.
5. Выделение микроглии из смешанного Glial культуры
- Для выделения микроглии, энергично нажмите колбу против лабораторном столе. Эта агитация помогает отдельные микроглии из других глиальных клеток в связи с низким уровнем приверженности свойств микроглии.
- Сбор Всплывшую среду, содержащую микроглии в стерильный конической трубки центрифуги; пеллетах микроглии (215 XG; 5 мин; Бакет ротор).
- Ресуспендируют микроглии осадок в теплой микроглии роста среды (MGM; MEM с добавлением: 1 пирувата мМ натрий, 0,6% об / vglucose 1 мм L-глутамина, 100 мкг / мл P / S, 5% об / об FBS; ~~~HEAD=iobj 2 мл / колбу), определить концентрацию клеток, используя гемоцитометра, и пластина 1 х 10 5 клеток / лунку в формате 24-луночного планшета напластик или стерильные скользит стекло крышка (500 мкл / лунку; MGM). Используя эту процедуру средняя урожайность микроглии составляет 7,5 х 10 5 клеток / щенок коры.
- 24-часовой пост-покрытие, удалить все средства массовой информации и подпитку клеток с пресной MGM (37 ° C) для удаления плавающих клеток и мусора. Этот шаг имеет решающее значение для выживания клеток и поддерживать покоящиеся микроглии. Клетки могут быть использованы для экспериментов сразу после повторной подачи.
6. Пример лечения
- Защиту клеток до 10 нг / мл Пам 3 ЦСК 4 (PAM), 10 нг / мл липополисахарида (LPS) или управления транспортным средством; инкубировать в течение 2 или 24 часов в увлажненном инкубаторе (37 ° C, 5% CO 2).
7. Анализируя микроглии для функциональности Экс Vivo через иммунофлуоресцентный изображений и иммуноцитохимии
- После обработки культуральной среде урожай клеток в микроцентрифужные пробирки (1,5 мл) и CENTRifuge используя настольный микроцентрифужную (2 мин; 900 XG), чтобы очистить СМИ. Передача супернатант в чистую пробирке; анализ сразу, или хранить при температуре -20 ° С до использования. Анализ концентрации ФНО-α в надосадочной культуре клеток с помощью коммерчески доступных мыши TNF-α ИФА.
- Промыть клеток фосфатно-буферным раствором (PBS), и зафиксировать клетки с 4% (вес / объем) параформальдегида / 4% (вес / объем) сахарозы / PBS, рН 7,4 (4% PFA, 15 мин; RT). После фиксации, мыть клетки с PBS в течение 5 мин при осторожном встряхивании на орбитальном шейкере.
- Иммунофлуоресценции / Иммуноцитохимия. После фиксации и PBS мыть, обрабатывать микроглии для иммуноцитохимии. Все шаги, проведенные с осторожном встряхивании. Проницаемыми клеток в PBS с 0,1% Triton X-100; блок клеток в PBS/10% нормальной козьей сывороткой в течение одного часа. Инкубируйте клетки O / N при 4 ° С с кроличьей анти-NF-kB антитела (субъединицы p65, 1/1, 250) или кролика против Iba-1 антитела (1/750) в блокирующем буфере. ВизуальныйИзе антиген: антитело после инкубации с флуоресцентно конъюгированного козьего антитела против кроличьего IgG вторичного антитела (1 час, 1/1, 000). Удаления несвязанного вторичное антитело промыванием PBS с 0,1% Triton X-100 (3x 5 мин).
- Счетчик пятна клеток с 4 ',6-диамидино-2-фенилиндол / PBS (DAPI, 0,1 мкг / мл). Визуализировать ядро клетки микроглии Все полученные из CX3CR1-GFP + / - мышей выразить GFP. Использование длины волны фильтра 350 нм для визуализации DAPI; длина волны фильтра 488 нм для визуализации GFP и длина волны фильтра 594 нм для визуализации P65 и МБА-1 Иммунокомплексы.
- Установить крышку скользит с использованием водного раствора Монтаж и визуализировать микроглии с помощью флуоресцентной микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сохраняя иммунофенотип и функциональность микроглии экс естественных во время изоляции имеет решающее значение, чтобы иметь возможность использовать эти клетки в качестве следственного модели для микроглии биологии. Для того чтобы продемонстрировать успешное сохранение микроглии immunofunctionality помощью данного способа, мы выделили корковых микроглии с P3 новорожденных (CX3CR1-GFP + / - и C57BL / 6) и обработанных культур с либо ЛПС или Пэм.
Как показано на фиг.1А, выделение микроглии через перемешивании через ротационным качанием сохраняет покоя фенотип отнести к микроглии в нормальных условиях в естественных условиях. Для оценки микроглии чистоту, CX3CR1-GFP + / - клеточные культуры окрашивали для макрофагов антигена МБА-1 и счетчик окрашивали DAPI для визуализации в ядро клетки. Как показано на фиг.1А и 1В, при малом увеличении, изоляции микроглии через Пресеntly описано результаты метод с высокой степенью очистки культуре клеток, так как более 95% клеток обладают колокализации GFP, МБА-1, и DAPI.
Далее мы стремились подтвердить отзывчивость микроглии экс естественных, бросая вызов клетки с ЛПС. По сравнению с лечения транспортного средства, ЛПС обращению CX3CR1-GFP + / -. Микроглии адаптированы абсолютный морфологическое изменение от небольшого, биполярное фенотипа к амебоидной-образную форму, как показано на рисунке 1b Этот морфологические изменения также обобщены в корковых микроглии изолированных от C57BL / 6 новорожденных, получавших Пэм (рис. 2). Это сохраняется морфологическая характеристика между генетически отличной микроглии, активированный с различными стимулами, подчеркивает воспроизводимость и применимость настоящего Протокола в отношении различных экспериментальных моделях.
Хотя это изменение в морфологии указывает на активацию 39, необходимо, чтобы гetermine если микроглии выделяют ротационным качанием сохраняют способность перемещать P65 при активации, что свидетельствует о сохранении функционального TLR-передачи сигналов внутриклеточной. Для подтверждения этого сигнальный каскад, мы относились микроглии, выделенные из C57BL / 6 новорожденных с Пэм. Как показано фиг.2 иммуноцитохимическая окрашивание р65 свидетельствует что при нормальных условиях р65 диффузно локализованы всей цитоплазме тогда после 2 часами стимуляции Пэм р65 иммунореактивность резко сместился локализацию ядру клеток.
Установив, что микроглии изолированных с помощью метода, представленных здесь сохранить молекулярные механизмы транслоцироваться P65 к ядру, мы затем хотел подтвердить, что изолированные микроглии сохраняют свою биохимическую immunofunctionality путем тестирования их способность выделять признак провоспалительных цитокинов, TNF-α, при активации . Как показано на фиг.3, всравнение с обработанной носителем микроглии клетки, контактирующие с Пам или LPS увеличению секреции ФНО-α в культуральную среду (Р <0,0001; односторонний ANOVA), что свидетельствует о функциональной TLR1 / 2 andTLR4 сигнальных путей, соответственно.
Поэтому вместе взятые, эти данные установить, что изоляцию микроглии через ротационным качанием результатов в высокочистых клеточных культур с сохраненной иммунофенотипа и функциональности, экс естественных условиях.
. Рисунок 1. Ротационным качанием высокими выходами чистоты микроглии культур с сохраненной иммунофенотипа микроглии клетки выделяли из CX3CR1-GFP + / - новорожденных мышей в Р3 и обрабатывали либо транспортного средства (А), или бактериальными ЛПС (B) в течение 24 часов.Клетки фиксировали 4% PFA, иммуноцитохимически окрашенных для МБА-1, и счетчик окрашивали DAPI. (А) Микроглия обрабатывали PBS выставке биполярного, покоя фенотипа. (Б) По ЛПС, микроглии адаптировать амебоидной, как фенотип, что свидетельствует о активации. Объединенный канал в панелях (A) и (B) под 10-кратным увеличением показали, что> 95% клеток являются GFP/Iba-1 позитивные клетки. 10X масштабная линейка: 100 мкм; 40X масштабная линейка: 20 мкм. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 2. Микроглия выделяли ротационным качанием транслоцируются NF-kB в ядре клетки на Пэм чаllenge. микроглии клетки выделяли из C57BL / 6 новорожденных в Р3 и обрабатывали носителем или Пам течение 2 часов. Клетки фиксировали 4% PFA и окрашивают в течение р65 через иммуноцитохимии. Клетки счетчик окрашивали DAPI визуализировать в ядро клетки. В обработанной носителем микроглии, р65 локализован по всей цитоплазме, тогда как стимуляция с Пэм индуцирует ядерной транслокации р65. 40X масштабная линейка:. 20 мкм Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 3. Микроглия изолированы с ротационным качанием выхода ФНО-α при воздействии Пам или LPS. Микроглии клетки выделяли из C57BL / 6 мышей в неонатальном Р3 и обрабатывали носителем, Пэм, или ЛПС в течение 2 часов. Супернатанте культуры клеток собирали и анализировали с помощью ELISA для TNF-α выпуска. *** Р <0,0001 (п = 2; односторонним ANOVA). Данные представлены в виде средних значений ± SD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Настоящая процедура предлагает эффективный способ выделения корковых микроглии от новорожденных мышей. Эта процедура имеет двукратное преимущество 1) сохранение микроглии иммунофенотипа и функциональности, как это определено флуоресцентных изображений, иммуноцитохимии и ELISA, и 2) что позволяет микроглии, чтобы созреть в присутствии других глиальных клеток (астроцитов и oligodentrocytes) до изоляция, которая может способствовать важные взаимодействия клетка-клетка в глиальных период культура созревания. Важно отметить, что изолированные клетки проявляли высокую жизнеспособность и однородность с сохранением функциональности и иммунофенотип экс естественных.
Есть несколько шагов, которые должны быть выполнены с особым вниманием и усердием для успешного выделения микроглии с самым высоким чистотой и выходом. Эти шаги являются: 1) поддержание стерильной, здоровой культуры на протяжении всей процедуры экспериментов; 2) удаление всех мозговые оболочки из корTices во микродиссекции; 3) собственно мытье мясорубки пластины и ножницы после мясорубки кору; 4) уравновешивания MCM в Т-75 колб в инкубаторе перед началом микродиссекции; 5) повторного кормления 24 ч после изоляции.
С микроглии являются резиденты иммунные клетки ЦНС, они очень отзывчивы к экологическим оскорблений. Таким образом, для предотвращения загрязнения культуры с патогенными агентами имеет решающее значение для сохранения иммунофенотипические и функциональные атрибуты покоящихся клеток микроглии. Ежедневный осмотр клеток для контроля загрязнения и рост является неотъемлемой частью избегая скомпрометированных клеточных культур и получить лучшее понимание того, микроглии роста курса. Кроме того, необходимо, чтобы обновить MGM 24-ч после покрытие микроглии, чтобы поддерживать жизнеспособность и функциональность клеток.
Основным препятствием для преодоления в изоляции микроглии, чтобы гарантировать, что фарш ЦНС ткань свободна от эндотелиальных клеток, которыеесли он присутствует, может препятствовать микроглии пролиферацию образуя густые колонии в глиальных культур. По этой причине, очень важно, чтобы тщательно удалить мозговые оболочки ЦНС во микродиссекции мозга. По нашему опыту, мозговых оболочек из P3 новорожденных удаляются с большей легкостью, чем P1 новорожденных, как ткань более развита и легче визуализировать под микроскопом рассечение. Кроме того, важно, чтобы избежать смачивания спинной стороне мозга с СД после удаления мозг от черепа. Это может быть сделано посредством мозг в анатомическом положении (спинной стороной вверх) при передаче его на DM. Ведение спинной стороне сухой мозга позволяет для лучшей визуализации и легкого удаления мозговых оболочек.
Мы обнаружили, что наиболее эффективным способом для удаления мозговые оболочки, это вставить силы № 4 в самой задней части межполушарной щели, и кожура мозговые оболочки прочь, с боков. После того, как спинной мозговых оболочек были очищены, мы тогда Ремове брюшной мозговые оболочки путем обращения мозг (брюшной стороной вверх), и осторожно схватив обонятельные луковицы и пилинг обратно к задней части мозга. Мы затем удалите оставшуюся вентральной мозговых оболочек ткани, мягко пилинг и выщипывание в боковом движении. Последующее разделение коры с остальной частью мозга является решающим для выделения только корковых микроглии. Процедура подробно описано также гибкость в том, что он может быть использован для изоляции микроглии от подкорковых областях, а также. Хотя, важно отметить, что выход клеток может быть ниже из-за изменчивости плотности микроглии равнодушных cytoarchitectural областях мозга 40.
Мы обнаружили, что для максимизации конечного выхода микроглии, важно, чтобы промыть и собирать полоскание из материалов, используемых в процессе мясорубки. Эти полоскания обеспечить полную коллекцию всех остаточной ткани, которая, возможно, остались на мясорубок ножницами, чашку Петри и пипеткинаконечник используется для Алиготе фарш ткани в конической трубе. Важно, что эти полоскания иметь место сразу же после передачи фарш ЦНС ткани в коническую пробирку, чтобы оптимизировать жизнеспособности клеток. Важно также, чтобы жизнеспособности клеток, что клетки не останавливаются в ММ дольше 2 минут, так как ММ лишена необходимых питательных веществ.
Наконец, крайне важно, чтобы подготовить Т-75 колб с MCM и разместить их в увлажненном инкубаторе (37 ° C, 5% СО 2) до начала протокол микродиссекции. Тет-75 колбу имеет пористую подкладку под его крышкой что позволяет для обмена газов, содействия СМИ уравновешивание перед добавлением смешанных глиальных культур. Мы обнаружили, что неспособность сделать это приводит к неоптимальным микроглии урожая. Важно также, чтобы запечатать крышку колбу Т-75 парафином до помещая колбу на роторном шейкере с целью минимизации газообмен в и из колбы при вращении.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что исследование было проведено в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношениях, которые могли бы быть истолкованы как потенциального конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIEHS R01ES014470 (КМЗ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose | Sigma | G8270 | Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 °C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM. |
| Sodium pyruvate 100 mM (100x) | Hyclone | SH30239.01 | Store at 4 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM. |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Fetal Bovine Serum (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Minimum Essential Medium Earle's (MEM) | Cellgro | 15-010-CV | Without L-glutamine. Contains Earle's salts. Used to make MCM, MGM, and DM. |
| Horse Serum | Gibco | 16050 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Cellgro | 21-021-CV | Without calcium and magnesium. Store at 4 °C. Used to make MM. |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-031 | Store at 4 °C. Used to make MM. |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | Used to stain cell nucleus. |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1. |
| Rabbit anti-NFκB (p65) | Abcam | 7970 | Used at 1/1,250 dilution for ICC staining for p65. |
| Alexa Fluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11012 | Used at 1/1,000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC. |
| 10 ml Disposable Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 50 ml Disposable Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| 15 ml Disposible Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Sterile Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1) | Roboz Surgical | RS-6010 | 1; 5 in; used for removing head |
| Scissor: Vannas (scissor #2) |
Fine Science Tools | 15000-08 | 1; nonangled; 2.5 mm cutting edge; used to open scalp |
| Scissor: Student Vannas (scissor #3) | Fine Science Tools | 91501-09 | 1; curved; used to mince brain tissue |
| Forcep: Dumont #7 (forcep #1) |
Fine Science Tools | 91197-00 | 2; used to secure nose and remove cortices |
| Forcep: Dumont #2 (forcep #2) |
Fine Science Tools | 11223-20 | 1; used to remove scalp |
| Forcep: Dumont #3 (forcep #3) |
Fine Science Tools | 11231-30 | 1; used to remove skull |
| Forcep: Dumont #5a (forcep #4) |
Fine Science Tools | 11253-21 | 1; used to remove meninges |
| Table of Specific Equipment | |||
| Zoom Stereo Dissection Microscope | Olympus | SZ4060 | Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet |
| Laminar-Horizontal Flow Cabinet | Nuaire | NU-201-330 | |
| Biological Safety Cabinet | Labconco | 3440001 | Class II |
| Water-Jacketed CO2 Incubator | VWR | 97025-836 | Set to 37 °C, 5% CO2 |
| Swing-out buckets | Fisher Scientific | 75006441 | To be used with Swing-out rotor |
| Swing-out Rotor | Fisher Scientific | 75006445 | Max Radius: 19.2 (cm) |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge (clinical centrifuge) |
Fisher Scientific | 75-004-377 | With swing-out rotor |
| AccuSpin Micro 17 microcentrifuge (tabletop microcentrifuge) |
Fisher Scientific | S98645 | With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524) |
References
- Ranshoff, R. M. P. V. H. Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39, 151-170 (1990).
- Gomez Perdiguero, E., Schulz, C., Geissmann, F. Development and homeostasis of "resident" myeloid cells: The case of the microglia. Glia. 61, 112-120 (2013).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat. Neurosci. 16, 273-280 (2013).
- Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nature reviews. Immunology. , 11-775 (2011).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Hu, S., et al. Cytokine and free radical production by porcine microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 78, 93-96 (1996).
- Muzio, M., Polentarutti, N., Bosisio, D., Prahladan, M. K., Mantovani, A. Toll-like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially expressed and regulated by different leukocytes. J. Leukocyte Biol. 67, 450-456 (2000).
- Lee, S. J., Lee, S. Toll-like receptors and inflammation in the CNS. Curr. Drug Targets. Inflamm. Allergy. 1, 181-191 (2002).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8, 57-69 (2007).
- Halle, A., et al. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta. Nat. Immunol. 9, 857-865 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Duewell, P., et al. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals. Nature. 464, 1357-1361 (2010).
- Stewart, C. R., et al. CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4. 11, 155-161 (2010).
- Beraud, D., et al. alpha-Synuclein Alters Toll-Like Receptor Expression. Front. Neurosci. 5, 80 (2011).
- Banati, R. B., Gehrmann, J., Schubert, P., Kreutzberg, G. W. Cytotoxicity of microglia. Glia. 7, 111-118 (1993).
- Combs, C. K., Karlo, J. C., Kao, S. C., Landreth, G. E. beta-Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNF alpha-dependent expression of induciblenitric oxide synthase and neuronal apoptosis. J. Neurosci. 21, 1179-1188 (2001).
- Kim, Y. S., Joh, T. H. Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the pathogenesis of Parkinson's disease. Exp. Mol. Med. 38, 333-347 (2006).
- Colton, C., Wilcock, D. M. Assessing activation states in microglia. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 174-191 (2010).
- Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Ceramide activates microglia to enhance the production/secretion of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) without induction of deleterious factors in vitro. J. Neurochem. 80, 697-705 (2002).
- Uesugi, M., Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Nonparticipation of nuclear factor kappa B (NFkappaB) in the signaling cascade of c-JunN-terminal kinase (JNK)- and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)-dependent tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) induction in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated microglia. Brain Res. , 1073-1074 (2006).
- Beraud, D., et al. Microglial Activation and Antioxidant Responses Induced by the Parkinson's Disease Protein alpha-Synuclein. J. Neuroimmun. Pharmacol. 8, 94-117 (2013).
- Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease. Neurobiol. Aging. 29, 1690-1701 (2008).
- Minghetti, L., Levi, G. Microglia as effector cells in brain damage and repair: focus on prostanoids and nitric oxide. Prog. Neurobiol. 54, 99-125 (1998).
- Hirsch, E. C. Glial cells and Parkinson's disease. J. Neurol.. 247 (2), 58-62 (2000).
- Liu, B., et al. Role of nitric oxide in inflammation-mediated neurodegeneration. Ann. NY Acad. Sci. 962, 318-331 (2002).
- Shie, F. S., Nivison, M., Hsu, P. C., Montine, T. J. Modulation of microglialinnate immunity in Alzheimer's disease by activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Curr. Med. Chem. 16, 643-651 (2009).
- Rogers, J., Mastroeni, D., Leonard, B., Joyce, J., Grover, A. Neuroinflammation in Alzheimer's disease and Parkinson's disease: are microglia pathogenic in either disorder. Int. Rev. Neurobiol. 82, 235-246 (2007).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murinemicroglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
- Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression. J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).
- Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J. Vis. Exp. , (2011).
- Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation. J. Vis. Exp. , (2012).
- Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity. Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Imai, T., et al. Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion. Cell. 91, 521-530 (1997).
- Cardona, A. E., et al. Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor. Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).
- Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
