Introduction
动物模型中提供的洞察，不能由体外分析来获得病的病理。提供最有效的结果，以使用密切相关的疾病和感兴趣物种的动物模型是重要的。例如，在穿过了麂（ 麂 ），小亚鹿1,2，和转基因小鼠中表达鹿科朊病毒蛋白（CerTgPrP）3的有用的动物模型鹿科物种。这两个物种是polyestrous，让常年繁殖，因此一致的来源与妊娠有关的组织和体液中，研究具体的机制在生物学鹿科。牛奶有研究的完成在动物模型中比在人类中应用较为简单（且便宜）繁多。研究人员可以调查乳和初乳为1）感染性疾病传播的潜在来源，2）在开发板的由母亲传递给后代的免疫球蛋白被动免疫4和3）乳铁蛋白pment，参与被动免疫的研究人员目前正在试图人类母乳中发现的一种蛋白质商业化生产5。
由小动物收集的牛奶大量可以证明是一项艰巨的任务。罗杰斯提出了一个方法，从大鼠6，随后在小鼠用于收集牛奶。 DePeters和霍维提出了两种方法，奶收集，一种使用由连接到巴斯德吸管的橡胶吸管灯泡产生的手动产生的真空，并且第二要求挤奶单元，然后将其连接到一个真空源（建造这样作为一个水龙头）收获鼠标奶7。在这里，我们提出了一个简单的，低成本的方法从小鼠和里夫斯'麂鹿，只需要现成的实验室设备和基本的技术技能收集牛奶。我们的方法产生足量的牛奶各种应用程序。
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Protocol
1，鼠标挤奶协议
在本协议中所述的方法进行批准IACUC。
1，分离大坝的后代
- 选择要挤奶的大坝。选择具有4个或更多的小狗一胎是8-12天分娩后提供最大收奶，虽然集合可以在任何时间点分娩后长达21天的大坝。
- 挤奶前，从她的垃圾至少2小时分开大坝。
注：如果出现一种愿望，牛奶多个水坝在给定的时间内，是可以接受的房子在同一个笼子里分离出的大坝有足够的食物和水的供应。
催产素，麻醉和眼部润滑剂2。管理
- 辖2个国际单位/公斤腹腔注射催产素（IP）。催产素是一种激素，作用于女性哺乳期的乳腺，刺激乳汁的释放。催产素可以被收购FROM一名兽医。
- 管理含有80-100毫克/千克氯胺酮在5-10毫克/公斤甲苯噻嗪IP相结合的麻醉剂。例如，一个10毫升储麻醉剂可以提前做好准备对小鼠体重约30g，并将包括0.1毫升甲苯噻嗪，8.9毫升水2 O和1.0毫升氯胺酮。 0.25毫升总麻药会沉着鼠标这种规模的约20〜30分钟，应提供足够的时间，收奶。
注：要确定该动物已成功麻醉后，轻轻地放在她在她的肚子上的固体表面;她不应该动她的脚或试图上升到她的脚，如果她是完全麻醉。在鼠标未充分与原剂量麻醉的情况下，研究者可以管理另一¼或麻醉剂混合物取决于鼠标和/或镇静的水平，该小鼠已经实现的尺寸的原始剂量的半。然而，这我能ncrease不良反应麻醉的机会，并且还可能会导致鼠标被更深度麻醉和/或麻醉的时间较长。
注意：如果挤奶多于一个坝，就必须错开催产素和由于催产素和镇静时间氯胺酮和甲苯噻嗪的半衰期短，麻醉剂注射。 - 取少量眼部润滑剂，以每只眼睛的角落和蔓延，防止老鼠的眼睛干涩，同时在麻醉下。
3，牛奶收集
奶源是最容易进行的两个研究人员：一名研究人员，以保持麻醉的小鼠，而手动表达的牛奶（简称R1），和一个研究人员收集的牛奶（R2）。这种方法也可以与一个人进行的，如果鼠标被固定在平坦表面上，以避免伤害。
- R2应配备消毒酒精消毒片，一个P-200点子etman，干净的移液管尖用于每个小鼠，和一个容器来保存牛奶，如在1.5 ml Eppendorf管或一个1.2毫升离心管（见表材料）。
- 由于催产素开始生效，放乳将成为老鼠的乳腺区可见（ 见图1A）。 R1：拆开消毒酒精棉片轻轻擦拭鼠标的乳腺区域之前，挤奶清洁的区域。使用拇指和食指轻轻按摩和挤压乳腺组织在向上运动，直到牛奶可见珠开始形成于乳头基部手动挤出乳汁从乳头。
- 按P-200 PIPETMAN柱塞其第一站，释放出空气的枪头和牛奶收集准备。
- 定位移液管尖端处的乳滴的顶部，并通过缓慢释放活塞上的压力轻轻拉动牛奶进入移液管尖端。注意不要把尖太靠近乳头或皮肤（见图1B）。它没有必要完全释放所述柱塞，因为这将拉动牛奶一路枪头的顶部，并会使得难以排出常粘稠奶到保持容器。
- 通过使用拇指按压柱塞过去的第一站（ 见图1C）排出乳汁进入容器。为了便于排出小体积，压在管的一侧的移液管尖端，使得没有液体就会丢失。
- 继续从每个乳头人工挤奶，朝着顺时针或反时针方向，以便不跳过任何奶头。它既是可以接受的，有用回来，并不断表达的牛奶来自同一个乳头是否应该产生比另一个更牛奶。
在大坝4。麻醉逆转
- 在大多数情况下，它是很常见的大坝开始，开始在挤奶过程中醒来。如果不是这种情况，将大坝的CAGË间接热源，如加热循环毯子，下方直到她开始醒来。
注：由于大坝开始醒来，密切观察她的活动，直到她能走约她在她自己的笼子里。 - 一旦大坝走动笼而不争，把她放回她原来的笼子里与她的垃圾。没有不良影响已经注意到对于幼崽“收奶后，喂能力。
2，麂挤奶协议
在本协议中所述的方法进行批准IACUC。
1，分离能源部从后代
- 选择母鹿被挤奶。里夫斯'麂鹿一般一个小鹿2生出。牛奶中的母鹿分娩后的第二天，让小鹿机会获得初乳8获得必需的营养物质。
注：小鹿一般隐藏和proc中没有再次出现edure;母 - 子对的分离是没有必要的。
催产素，麻醉和眼部润滑剂2。管理
- 辖10个国际单位/公斤催产素肌肉注射（IM）。催产素是一种激素，作用于女性哺乳期的乳腺，刺激乳汁的松懈下来。催产素可以从兽医收购。
- 管理BAM麻醉IM 11布托啡诺含有0.45毫克/千克，二甲苯胺噻嗪0.25毫克/千克，medetomadine 0.07毫克/千克。在BAM麻醉剂混合物中的一种剂量镇静一个麂约20-30分钟，可提供充足的时间完成收奶。对麻醉剂的另一个选项是咪达唑仑在1-2毫克/千克，这将镇静一个麂为约10-15分钟。虽然这提供了足够的时间用于奶收集，这种麻醉剂被代谢的速度比BAM和动物可能试图逃脱在较短的时间周期的结束。
注：对疼痛的反应最小，在触摸耳朵较小的反射，其次是R1的持有MJ而不争的能力，表明该动物已成功麻醉。
注意：在一个麂没有充分与原剂量麻醉的情况下，研究者可以管理另一¼或麻醉剂混合物的原剂量取决于镇静的动物和/或电平的大小已经是的半实现的。但是，这可能增加不良反应麻醉的机会，并且还可能会导致麂更加深度麻醉和/或麻醉的时间较长。 - 涂抹少量的润滑剂，以每只眼睛和蔓延的角落，以防止麂的眼睛在麻醉状态下干燥时。
3，牛奶收集
奶源是最容易与两位研究人员进行的;一位研究人员举行麻醉中麂的腿上，而手动表达奶（简称R1），第二研究员保持麂的头在一个舒适，安全的位置，并收集牛奶（R2）。
- 根据所使用的麻醉剂，挤奶应执行要么1）在他们的笔，他们应该在手术过程中醒来（咪达唑仑诱导）或2）的床上用品，免费接待室，以保持清洁（BAM - 提供一个安全的地方为他们诱导）。
- R1和R2应配备乙醇浸泡过的纱布和一些的15毫升锥形聚丙烯管来保存牛奶。
- 由于催产素开始生效，放乳将成为麂的乳腺区可见。 R1：消毒戴手套的手和手指，以及整个乳房，并与乙醇浸泡过的纱布动物的每个单独的奶头。 R2：按住麂的头在一个安全和舒适的位置，使其很容易呼吸，并有助于防止瘤胃返流。按住收集管CL OSE的乳头挤奶不接触，以防止潜在的污染。
- 从一个乳头挤出乳汁通过使用拇指和食指轻轻挤压乳房组织中的向上运动，直至乳头充血与牛奶，并轻轻地滚动牛奶出奶嘴和成R2的保持管（ 见图2 ）。
- 注意：牛奶出来，在一个流中，所以对于R 2具有收集管定位，使得很少或几乎没有牛奶将被浪费是重要的。
- 本麂的乳房被分成象限。 R1：继续从每个象限挤出乳汁，直到牛奶不再轻易流动。如果牛奶不能从一个乳头表示，从所有其他乳头返回到第一前表达。它既是可以接受的，有用回来，并不断表达的牛奶来自同一个乳头是否应该产生比另一个更牛奶。
在母鹿4。麻醉逆转
T“>这是常见的咪达唑仑诱导母鹿开始在挤奶过程中醒来。在大多数情况下，美国能源部将试图逃避所有的牛奶已经表示之前。小的克制是用在努力增加牛奶产量，但无论是研究人员和美国能源部的安全性和舒适性也同样重要。- 辖阿替美唑在2.5毫克/毫克medetomadine皮下注射BAM的快速逆转麻醉母鹿。
注意：使用这两种类型的麻醉剂，有必要保持密切的观察母鹿的，直到她能走在她自己没有绊倒或下降，并能吃喝不用担心误吸或窒息。没有不良影响已经注意到对于小鹿的收奶后，护士的能力。
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Representative Results
鼠标
从我们的实验中，我们已经确定，就可以收集大约100-400微升的牛奶从一个实验室小鼠，取决于几个变量。这些变量包括：1）的时间预留收集，2）催产素的剂量给药，3）有多少幼仔大坝是目前护理和时间分娩后4）的金额。我们的研究表明，当坝从它们的后代中分离至少2小时，获得最高的产率，和至少45分钟到一个小时被设定每只小鼠挤奶一边。最大的牛奶量收获8-12天使用2 IU / kg的催产素后分娩。我们的研究结果大多是根据其他研究的地方产仔数呈正产奶量9（ 见图3）相关。
麂
尽管奶HAR的量从麂归属是从一天又一天，我们能够收集5〜30毫升牛奶/水坝/会话，取决于所用的麻醉和/或时间后分娩变量。麂鹿polyestrous;牛奶能在全年2不同时间点收集（ 见表1）。咪达唑仑诱导能源部保持在麻醉状态下对少至10分钟，从而允许更小的体积集合（通常是5-30毫升），而BAM诱导能源部持续一段较长时间的麻醉作用（20-30分钟），从而允许完整牛奶表达（15-130毫升）。牛奶收集被中断时，牛奶不再由美国能源部生产足够数量，以及相应的小鹿正在滋养饮食上多干草饲料的。
图1（A）大坝217，S乳头变得充血与牛奶后注射催产素（B）收集的牛奶从使用P-200 PIPETMAN麻醉坝（C）喷射的牛奶倒入一个1.2毫升冻存管。
图2。麂牛奶被收集到15毫升锥形管中。
图3：从小鼠大约产奶量收集的基础上产仔数和幼仔的年龄。
表1。牛奶科尔挠度开始和结束日期为哺乳期里夫斯'麂水坝。
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Discussion
鼠标
有几个因素来自鼠标收集牛奶时要考虑到，包括1）的时间预留收集，催产素2）的给药剂量，3）有多少幼仔大坝是目前护理和4）金额自分娩已经通过在收集时的时间。使用以往的研究为指导，我们开始着手优化产奶量的条件。
此前有研究直接相关的产奶量与产仔8。不幸的是，产仔数是不能被控制的变量。然而，挤奶后的分娩的时间可以得到控制。据该实验小鼠的最大乳汁分泌是在8-10天分娩后9。我们的经验是在一致性与本声明。
它已经表明，催产素起着牛奶生产岗位不可替代的作用分娩10。催产素剂量范围从0.1 IU / kg的9〜4 IU / kg的6已报告的收集牛奶从啮齿动物6,7,9。我们开始研究管理的最低剂量建议，0.1 IU / kg的9。使用这种用量，通过鼠标产奶量太小，无法测量或收集。当增加催产素剂量为2 IU / kg的6,7，产奶量是相当高的，大约120微升。因为我们想用催产素的最低剂量，以达到最佳的奶源，我们没有管理的剂量比2 IU / kg的高。
产奶量也取决于预留收集的时间量。我们已经确定，最少3小时是必要的最佳收集，2小时为从大坝和1小时的材料准备和收集分离的幼崽。从几个水坝在一个会话中收集牛奶会需要的总体时间减少到收获的牛奶比容， 即 2小时分开幼仔，30分钟设置材料和20-30分钟，收集牛奶从每个水坝。每个大坝必须进行监测，直到它们被放回到它们的幼崽才清醒。我们已经注意到，有更多的时间留出挤奶导致较高的产奶量，因为鼠标可以挤奶，直到她恢复意识。
情况确实出现与动物模型，这将影响产奶量。一个常见的问题是血液或渗出液中的老年水坝已经多次繁殖，并有较大的窝，或在那些护理他们的第一窝坝的牛奶存在。如果发生这种情况，我们建议从该特定乳头停止收奶。明智的做法是在这个时候切换枪头，并放弃任何渗出物或血液。
研究人员实施该方法也应该知道的是，这是常有的情况下利用动物模型时，结果相同（ 图3）。如果被收集在一个会话牛奶小于最佳值的值，优选的是，重复该过程在稍后的时间（ 例如 24-48小时），而不是改变实验条件迫使乳汁释放。
麂
牛奶从穿过了麂水坝所收集的量依赖于所使用的麻醉剂。我们最初选择的麻醉剂是咪达唑仑。咪达唑仑提供足够的镇静，让克制的时间， 即短期内，如果R1有一个冷静处置，并能保持冷静麂，R2可以接管挤奶，以提高产量前麂将唤醒，两者的安全性和舒适性动物和处理是极为重要，我们放弃了挤奶的努力，如果我们觉得要么被攻破。我们发现，麂母鹿迅速变得宽容，以咪达唑仑和高剂量会反复接触后有必要，使牛奶收集，每周两次越来越困难。
咪达唑仑的短缺，再加上建筑宽容，使我们研究一个替代麻醉剂。布托啡诺，二甲苯胺噻嗪和Medetomadine（BAM）的混合物有效地用于白尾鹿11的固定。在我们的手中，在BAM鸡尾酒提供了足够的麻醉，让收集可接受的奶卷以安全的方式，用后可重复使用较少药物的耐受性，并与在倒车麻醉的效果更好的控制。
有些麂水坝遭受敏感的乳房和/或为首次母亲。这些麂挤奶过程开发的乳头青紫，和奶流减慢或完全停止，促使我们停止正在进行的会话。如果发生这种情况，应该在试图阻止不适或瘀伤的奶嘴使用更温和的挤奶技术。
e_content“>牛奶生产出现了团圆几次。低奶收成可能会由1引起）的小鹿刚刚之前的集合或2）在牛奶产量下降，由于小鹿断奶的自然过程调养。虽然它可以是一个尝试的过程中获得的牛奶小动物模型一个相当大的量，我们的工作说明，这的确是一个可能性鼠标和麂模型;既不需要广泛的技能也不是财大气粗，只要持之以恒。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials—Mouse | |||
| Ketamine (KetaVed 100 mg/ml) (dose: 80-100 mg/kg) | MWI/Vedco | 011075 | |
| Xylazine (TranquiVed 100 mg/ml) (dose: 5-10 mg/kg) | MWI/Vedco | NADA 139236 | |
| Eye lubricant | MWI/Apexa | 701013 | |
| Oxytocin (2 IU/kg) | Vet One | 501013 | |
| Materials—Muntjac | |||
| Midazolam (1-2 mg/kg) | Amerisource Bergen Drug Corp | 924326 | Optional: researcher can either use Midazolam on its own or BAM combination as an anesthetic |
| Butorphanol tartrate (Torbugesic) (0.45 mg/kg) | Fort Dodge Animal Health | NADA 135-780 | |
| Azaperone tartrate (0.25 mg/kg) | ZooPharm | ||
| Medetomadine HCl (0.07 mg/kg) | ZooPharm | ||
| Antipamezol hydrochloride (Antisedan) (dose: 0.25 mg/kg) | Orion Corporation | NADA 141-033 | |
| Oxytocin (10 IU/kg) | Vet One | 501013 | |
| Equipment—Mouse | |||
| P-200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μl pipette tips | Light Labs | B-2004-SH | |
| 1 ml syringes | MWI | 005427 | |
| 27 G needles | MWI | 002031 | |
| Equipment—Muntjac | |||
| 15 ml conical tubes | VWR | 21008-918 | |
| 22 G needles | MWI | 873 | |
| 3 ml luer lock syringes | MWI | 001377 | |
References
- Dueling, S. Muntiacus reevesi. Animal Diversity Web. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Muntiacus_reevesi (2004).
- Pei, K., Taber, R., O'Gara, B., Wang, Y. Breeding cycle of the Formosan Reeves muntjac (Muntiacus reevesi micrurus) in northern Taiwan, Republic of China. Mammalia. 59 (2), 223-228 (1995).
- Browning, S. R. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J. Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
- Van de perre, P. Transfer of antibody via mother's milk. Vaccine. 21 (24), 3374-3376 (2003).
- Maden, C. Genetically modified mice produce human milk protein. BioNews. , (2009).
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- Depeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
- Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: effects of litter size and lactation. 84 (1), 127-133 (1986).
- Hedrich, H. J., Bullock, G. R. The laboratory mouse. , 735-736 (2004).
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- Miller, B. F., Osborn, D. A., Lance, W. R., Howze, M. M., Warren, R. J., Miller, K. V. Butorphanol-azaperone-medetomidine for immobilization of captive white-tailed deer. 45 (2), 457-467 (2009).
