Introduction
Dyremodeller give indsigt i sygdommen patologi, som ikke kan opnås ved in vitro-analyse. At give de mest effektive resultater, er det vigtigt at anvende en dyremodel, der er nært relateret til sygdommen og arter af interesse. For eksempel Reeves 'muntjac (Muntiacus reevesi), en lille asiatiske hjorte 1,2, og transgene mus, der udtrykker hjortedyr prion protein (CerTgPrP) 3. er nyttige dyremodeller for hjortedyr arter. Begge arter er polyestrous, så året rundt avl, og derfor en konsekvent kilde til graviditetsrelaterede væv og væsker til at studere specifikke mekanismer i hjortedyr biologi. Undersøgelser af mælk har en bred vifte af applikationer, der er mere enkelt (og billigt) udført i dyremodeller end hos mennesker. Forskerne kunne undersøge mælk og colostrum som en potentiel kilde til 1) smitsom sygdom transmission, 2) immunoglobuliner overføres fra mor til afkom i udvikpment af passiv immunitet 4 og 3) lactoferrin, et protein der findes i modermælk er involveret i passiv immunitet, at forskere er i øjeblikket forsøger at kommercielt producere 5.
Indsamling af en væsentlig mængde af mælk fra små dyr kan vise sig at være en vanskelig opgave. Rogers foreslog en tilgang til at indsamle mælk fra rotter, 6, som efterfølgende blev brugt i mus. DePeters og Hovey foreslås to metoder til indsamling af mælk, den ene med en manuelt genereret vakuum fremstillet af gummi pipette pære fastgjort til en Pasteur-pipette, og en anden, der kræver anlæg af en malkeenhed, som derefter fastgøres til en vakuumkilde (såsom som en vandhane) at høste muse mælk 7. Her foreslår vi en enkel, billig metode til indsamling af mælk fra både mus og Reeves 'muntjac hjorte, hvilket kun kræver let tilgængelige laboratorieudstyr og grundlæggende tekniske færdigheder. Vores metode giver tilstrækkelige mængder mælk til diverseapplikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Mouse Malkning Protocol
De i denne protokol beskrevne metoder blev godkendt af IACUC.
1.. Adskillelse af Dam fra Offspring
- Vælg dæmningen der skal malkes. Vælg en dæmning med et kuld på 4 eller flere unger, der er 8-12 dage efter fødsel til at give maksimal indsamling af mælk-selv samling er muligt på ethvert tidspunkt efter fødslen op til 21 dage.
- Adskil dæmningen fra hendes kuld mindst 2 timer før malkning.
Bemærk: Skal man ønske at malke mere end én dæmning i en given tidsperiode, er det acceptabelt at huse de adskilte dæmninger i samme bur med tilstrækkelig mad og vandforsyning.
2.. Administration af oxytocin, Anæstesi og Eye Smøremiddel
- Indgiv 2 IE / kg oxytocin intraperitonealt (IP). Oxytocin er et hormon, der virker på mælkekirtler ammende kvinder til at stimulere frigivelsen af mælk. Oxytocin kan erhverves frabout en dyrlæge.
- Administrere et bedøvelsesmiddel blanding indeholdende 80-100 mg / kg ketamin i kombination med 5-10 mg / kg xylazin IP. For eksempel kan en 10 ml bestand anæstesiblandinger være forberedt på forhånd for mus, der vejer cirka 30 g og vil indeholde 0,1 ml xylazin, 8,9 ml H 2 O, og 1,0 ml ketamin. 0,25 ml total bedøvelse vil bedøve en mus af denne størrelse i ca 20-30 min, som skulle give tilstrækkelig tid til indsamling af mælk.
Bemærkninger: For at bestemme, at dyret er blevet korrekt bedøvet, forsigtigt placere hende på maven på en fast overflade; hun ikke skulle flytte hendes fødder eller forsøger at stige til hendes fødder, hvis hun er fuldt bedøvet. I tilfælde af en mus ikke er fuldt bedøvet med den oprindelige dosis, må forskeren administrere anden ¼ eller ½ af den oprindelige dosis af anæstesiblandinger afhængigt af størrelsen af muse og / eller niveauet af sedation musen allerede har opnået . Men dette kunne jegncrease chancen for en negativ reaktion på anæstesi, og kan også resultere i musen bliver mere dybt bedøvet, og / eller bedøvet i en længere periode.
Bemærk: Hvis der malkning mere end en dæmning, er det nødvendigt at forskyde oxytocin og bedøvende indsprøjtninger på grund af den korte halveringstid af oxytocin og sedation tider for ketamin og xylazin. - Påfør en lille mængde af øjet smøremiddel til hjørnet af hvert øje og spredes til at forhindre musens øjne tørrer ud, mens under anæstesi.
3.. Milk Collection
Samlingen mælk lettest udføres med to forskere: en forsker til at holde den bedøvede mus, mens manuelt udtrykke mælk (benævnt R1), og en forsker til at indsamle mælken (R2). Denne metode kan også udføres med en person, hvis musen er sikret på en flad overflade for at undgå skader.
- R2 bør være udstyret med sterile alkohol prep puder, en P-200 pipEtman en ren pipettespids for hver mus, og en beholder til at holde mælken, såsom et 1,5 ml Eppendorf-rør eller et 1,2 ml kryohætteglas (se tabel Materialer).
- Da oxytocin begynder at træde i kraft, vil mælkenedlægningen blevet synlige i musens brystkirtler område (se figur 1A). R1: Pak en steril alkohol prep pad og tør forsigtigt brystkirtler område af musen til at rense området før malkning. Manuelt udtrykke mælk fra patten ved hjælp af tommel-og pegefinger til forsigtigt at massere og klemme brystvævet i en opadgående bevægelse, indtil en synlig stribe af mælk begynder at dannes i bunden af patten.
- Tryk på P-200 Pipetman stemplet til sin første stop for at frigøre luften ud af pipetten spids og forberede sig til indsamling af mælk.
- Anbring pipettespidsen øverst dråbe mælk, og træk forsigtigt mælken i pipettespidsen ved langsomt at frigive trykket på stemplet. Pas på ikke at sætte spidsen for tæt på patten eller huden (seFigur 1B). Det er ikke nødvendigt fuldstændigt at frigive stemplet, da dette vil trække mælken hele vejen til toppen af pipettespidsen og vil gøre det vanskeligt at udvise de ofte viskøse mælk i opbevaringsbeholder.
- Pres mælken i beholderen ved hjælp af tommelfingeren til at trykke stemplet forbi det første stop (se figur 1C). For at lette udsendelse af små volumener, tryk pipettespidsen mod den side af røret, så at ingen væske er tabt.
- Fortsæt med at manuelt at udtrykke mælk fra hver patte, bevæger sig i enten en uret eller mod uret for ikke at springe nogen patterne. Det er både acceptabelt og nyttigt at vende tilbage til og løbende udtrykke mælk fra samme patten skal det producere mere mælk, end en anden.
4.. Bedøvelse Tilbageførsel i dæmningen
- I de fleste tilfælde er det almindeligt for dæmningen til at begynde at begynde at vågne op under malkeprocessen. Hvis dette ikke er tilfældet, skal du placere dæmningen i en KAGe indirekte under en varmekilde, såsom en opvarmet cirkulerende tæppe, indtil hun begynder at vågne op.
Bemærk: Da dæmningen begynder at vågne op, holde tæt observation af hendes aktivitet, indtil hun er i stand til at gå om hendes bur på hendes egen. - Når dæmningen bevæger omkring buret uden kamp, placere hende tilbage i hendes oprindelige bur med hendes kuld. Ingen skadelige virkninger er blevet konstateret med hensyn til hvalpene evne til at fodre efter indsamling af mælk.
2.. Muntjac Malkning Protocol
De i denne protokol beskrevne metoder blev godkendt af IACUC.
1.. Adskillelse af Doe fra Offspring
- Vælg dåen der skal malkes. Reeves 'muntjac rådyr generelt føder en fawn 2. Mælk dåen dagen efter fødslen for at tillade fawn mulighed for at få adgang til essentielle næringsstoffer i råmælken 8.
Bemærk: Den fawn normalt skjuler og ikke dukke op igen i løbet af procedure; adskillelse af mor-afkom par er ikke nødvendig.
2.. Administration af oxytocin, Anæstesi og Eye Smøremiddel
- Indgiv 10 IE / kg af Oxytocin intramuskulært (IM). Oxytocin er et hormon, der virker på mælkekirtler ammende kvinder at stimulere Lad-ned af mælk. Oxytocin kan erhverves fra en dyrlæge.
- Administrere BAM bedøvelsesmiddel IM 11 indeholdende butorphanol 0,45 mg / kg, azaperon 0,25 mg / kg, medetomadine 0,07 mg / kg. En dosis af BAM anæstesiblandinger vil bedøve en muntjac i ca 20-30 min, hvilket giver rigelig tid til en fuldstændig indsamling af mælk. En anden mulighed for bedøvelsesmiddel er midazolam på 1-2 mg / kg, hvilket vil bedøve en muntjac ca 10-15 min. Mens dette giver tilstrækkelig tid til indsamling af mælk, er dette bedøvelsesmiddel metaboliseres hurtigere end BAM og dyret kan forsøge at flygte ved afslutningen af den kortere periode.
Bemærk: Minimal reaktion på smerte, Mindre reflekser upon røre ørerne, efterfulgt af evnen af R1 til at holde MJ uden kamp viser, at dyret er blevet korrekt bedøvet.
Bemærk: I tilfælde af en muntjac ikke fuldt bedøvet med den oprindelige dosis, må forskeren administrere anden ¼ eller ½ af den oprindelige dosis af anæstesiblandinger afhængigt af størrelsen af dyret og / eller niveauet af sedation, som allerede er opnået. Dette kunne dog øge chancen for en negativ reaktion på anæstesi, og også kan resultere i muntjac bliver mere dybt bedøvet, og / eller bedøvet for en længere periode. - Anvende en lille mængde smøremiddel til hjørnet af hvert øje og spredning for at forhindre muntjac øjne udtørre mens under anæstesi.
3.. Milk Collection
Samlingen mælk lettest udføres med to forskere; en forsker til at holde den bedøvede muntjac iskødet, mens du manuelt udtrykke mælk (Benævnt R1), og en anden forsker til at holde muntjac hoved i en komfortabel og sikker position, og til at indsamle mælk (R2).
- Afhængig af anæstetikum bør malkningen udføres enten 1) i deres penne til at give et sikkert sted for dem, hvis de vågner op under proceduren (midazolam-induceret) eller 2) i en strøelse-fri forrum til at opretholde renlighed (BAM- induceret).
- R1 og R2 skal være udstyret med ethanol gaze og flere 15 ml koniske polypropylenrør at holde mælken.
- Da oxytocin begynder at træde i kraft, vil mælkenedlægningen blive synlig i muntjac s brystkirtler område. R1: Sanitize behandskede hænder og fingre, samt hele yveret og hver enkelt patte på dyret med ethanol gaze. R2: Hold muntjac hoved i en sikker og behagelig stilling til at tillade nem vejrtrækning og hjælpe med at forhindre vommen opstød. Hold opsamlingsrøret cl OSE til patten bliver malket uden at røre den for at forhindre potentiel forurening.
- Udtrykke mælk fra en patte ved hjælp af tommel-og pegefinger til forsigtigt presse brystvævet i en opadgående bevægelse, indtil patten engorged med mælk, og rul forsigtigt mælken ud af patten og ind i røret, R2 holder (se figur 2 ).
- Bemærk: Mælken kommer ud i en strøm, så det er vigtigt, at R2 har opsamlingsrøret placeret således, at lidt eller ingen mælk vil være spildt.
- Den muntjac yver er opdelt i kvadranter. R1: Fortsæt med at udtrykke mælk fra hver kvadrant indtil mælken ikke længere flyder let. Hvis mælken ikke kan udtrykkes fra en patte, udtrykke fra alle andre patter før han vendte tilbage til den første. Det er både acceptabelt og nyttigt at vende tilbage til og løbende udtrykke mælk fra samme patten skal det producere mere mælk, end en anden.
4.. Bedøvelse Tilbageførsel i Doe
t "> Det er almindeligt for midazolam-induceret doe at begynde at vågne op under malkningen. I de fleste tilfælde vil doe forsøge at flygte, før al mælken er blevet udtrykt. er mindre tilbageholdenhed bruges i et forsøg på at øge mælken udbytte, men den sikkerhed og komfort for både forskere og doe er lige vigtige.- Administrere atipamezol på 2,5 mg / mg medetomadine subkutant til hurtig tilbageførsel af BAM bedøvede doe.
Bemærk: Med begge typer af narkose, er det nødvendigt at opretholde tæt observation af doe indtil hun er i stand til at gå på egen hånd uden at snuble eller falde, og er i stand til at spise og drikke uden frygt for aspiration eller kvælning. Ingen skadelige virkninger er blevet konstateret med hensyn til fawn evne til at amme efter indsamling af mælk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mus
Fra vores eksperimenter har vi fastslået, at det er muligt at indsamle ca 100-400 pi mælk fra en laboratorie-mus, afhængig af flere variabler. Disse variabler omfatter 1) den tid, der er afsat til indsamling, 2) dosis af oxytocin administreret, 3) hvor mange unger dæmningen er i øjeblikket sygepleje og 4) mængden af tid efter kælvning. Vores undersøgelser har vist, at det højeste udbytte opnås, når dæmninger er separeret fra deres afkom i mindst 2 timer, og mindst 45 minutter til en time er afsat pr musen til malkning. Maksimale mælk mængder blev høstet 8-12 dage efter fødsel med 2 IE / kg oxytocin. Vores resultater er hovedsagelig i overensstemmelse med andre undersøgelser, hvor kuldstørrelse var positivt korreleret med mælkeydelse 9 (se figur 3).
Muntjac
Selv om mængden af mælk hasoptjent fra muntjac var variabel fra dag til dag, vi var i stand til at indsamle 5 til 30 ml mælk / dæmning / session, afhængigt af den anvendte anæstesi og / eller tid efter fødsel. Muntjac hjorte er polyestrous; mælk kan afhentes på forskellige tidspunkter i løbet af året 2 (se tabel 1). Midazolam-induceret doe forblev under anæstesi for så lidt som 10 minutter, giver mulighed for mindre volumen samlinger (typisk 5-30 ml), mens BAM-induceret doe opretholdt en længere periode af bedøvelsesmiddel effekt (20-30 min), hvilket giver komplet mælk udtryk (15-130 ml). Mælk kollektioner blev indstillet, da mælk ikke længere bliver produceret i tilstrækkelige mængder af DOE, og den tilsvarende fawn blev næret på en diæt af det meste hø foder.
Fig. 1. (A) Dæmningen217; s patter bliver engorged med mælk efter oxytocin indsprøjtning (B) Indsamling af mælk fra en bedøvet dæmning ved hjælp af en P-200 Pipetman (C) udslyngning af mælk i en 1,2 ml cryovial...
Figur 2. Muntjac mælken opsamles i et 15 ml konisk rør.
Figur 3.. Cirka mælkeydelse indsamlet fra mus baseret på kuldstørrelse, og alder hvalpe.
Tabel 1.. Milk collfdeling start-og slutdatoer for diegivende Reeves 'muntjac dæmninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mus
Der er flere faktorer at tage i betragtning, når de indsamler mælk fra en mus, herunder 1) den tid, der er afsat til indsamling, 2) dosis af oxytocin administreret, 3) hvor mange unger dæmningen er i øjeblikket sygepleje og 4) det beløb, tid, der er gået siden fødslen på tidspunktet for indsamlingen. Brug tidligere undersøgelser som retningslinjer, vi satte sig for at optimere betingelserne for mælkeydelse.
Tidligere forskning har direkte korreleret mælkeydelse med kuldstørrelse 8. Desværre kuldstørrelse er en variabel, der ikke kan styres. Imidlertid kan malkningstidspunktet efter kælvning styres. Ifølge Laboratoriet Mouse maksimum mælk sekretion er på 8-10 dage efter fødsel 9. Vores erfaring er i kongruens med denne erklæring.
Det er blevet påvist, at oxytocin spiller en uerstattelig rolle i mælkeproduktionen indlægfødsel 10. Oxytocin doser fra 0,1 IE / kg 9-4 IE / kg 6 er blevet rapporteret til indsamling af mælk fra gnavere 6,7,9. Vi begyndte vores undersøgelse ved at administrere den laveste dosis foreslog 0,1 IE / kg 9. Ved anvendelse af denne dosis, mængden af mælk produceret af mus var for lille til at måle eller indsamle. Ved at øge oxytocin dosis til 2 IU / kg 6,7, mælkeydelse var betydeligt højere ved cirka 120 ul. Fordi vi ønskede at bruge den laveste dosis af oxytocin for at opnå optimal indsamling af mælk, vi ikke administrere højere doser end 2 IE / kg.
Mælkeydelse er også afhængig af mængden af afsat tid til samling. Vi har fastslået, at et minimum af 3 timer er nødvendige for optimal indsamling-2 hr for hvalpene at blive adskilt fra dæmningen og 1 time for materiel forberedelse og indsamling. Indsamling mælk fra flere dæmninger i en session, vil mindske den samlede nødvendige tid tilhøste en bestemt mængde mælk, dvs 2 timer til at adskille unger, 30 min til setup materialer og 20-30 min til at indsamle mælk fra hver dæmningen. Hver dæmning skal overvåges, indtil de er vågne, inden det bringes tilbage med deres unger. Vi har bemærket, at jo mere tid afsat til malkning fører til højere udbytter mælk, fordi musen kan malkes, indtil hun kommer til bevidsthed.
Tilfælde vil opstå med dyremodeller, der vil påvirke mælkeydelsen. Et fælles problem er tilstedeværelsen af blod eller ekssudat i mælken ældre dæmninger, der er avlet flere gange og har store kuld, eller i dæmninger, der ammer deres første kuld. Skulle dette ske, foreslår vi ophørende indsamling af mælk fra det pågældende patte. Det er tilrådeligt at skifte pipettespidser på dette tidspunkt, og kassere enhver ekssudat eller blod.
Forskere, der udfører denne metode bør også være klar over, at det ofte er tilfældet ved brug af dyremodeller varierer resultaterne (figur3). Hvis en mindre end optimal mængde mælk opsamles i en session, er det at foretrække at gentage proceduren på et senere tidspunkt (fx 24-48 timer) i stedet for at ændre de eksperimentelle betingelser for at tvinge mælk udgivelse.
Muntjac
Mængden af mælk, der indsamles fra Reeves 'muntjac dæmninger var afhængig af bedøvelsesmiddel anvendes. Vores indledende bedøvelsesmiddel valg var midazolam. Midazolam fremlagt tilstrækkelig sedation til at tillade tilbageholdenhed i korte perioder-ie, hvis R1 havde en rolig disposition og kunne holde muntjac ro, kan R2 overtage malkningen til at øge udbyttet inden muntjac ville vække-sikkerhed og komfort for både dyr og handleren var af yderste vigtighed, og vi opgav malkningen indsats, hvis vi følte enten blev kompromitteret. Vi opdagede, at muntjac doe hurtigt blive tolerante over for midazolam, og at højere doser vil være nødvendigt efter gentagen eksponering, gør indsamling af mælk to gange om ugen stadig vanskeligere.
Manglen af midazolam, kombineret med en bygning tolerance, førte os til at forske en alternativ bedøvelsesmiddel. En blanding af Butorphanol, Azaperone og Medetomadine (BAM) er effektivt til immobilisering af hvide hale hjorte 11. I vores hænder, BAM cocktail fremlagt tilstrækkelige bedøvelse for at tillade indsamling af acceptable mængder mælk på en sikker måde, med mindre lægemiddel tolerance ved gentagen brug, og med bedre kontrol vende virkningerne af bedøvelsen.
Nogle muntjac dæmninger lidt fra følsomme yvere og / eller var første gang mødre. Disse muntjac udviklede blå mærker på patterne under malkning, og mælkestrømmen nedtonet eller standset helt, hvilket fik os til at afbryde den igangværende session. Skulle dette ske, skal man bruge en mere blid malketeknik i et forsøg på at undgå ubehag eller blå mærker i patterne.
e_content "> Mælkeproduktionen syntes at voks og aftager ved flere lejligheder. Lave mælk høst kan være forårsaget af 1) fawn har plejet lige før samlinger eller 2) et fald i mælkeproduktionen som følge af den naturlige proces med fawn fravænning.Selv om det kan være en prøve proces at opnå en betydelig mængde mælk fra små dyremodeller, vores arbejde viser, at det rent faktisk er en mulighed for både mus og muntjac modeller; hverken kræver omfattende færdighed eller dybe lommer, simpelthen udholdenhed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials—Mouse | |||
| Ketamine (KetaVed 100 mg/ml) (dose: 80-100 mg/kg) | MWI/Vedco | 011075 | |
| Xylazine (TranquiVed 100 mg/ml) (dose: 5-10 mg/kg) | MWI/Vedco | NADA 139236 | |
| Eye lubricant | MWI/Apexa | 701013 | |
| Oxytocin (2 IU/kg) | Vet One | 501013 | |
| Materials—Muntjac | |||
| Midazolam (1-2 mg/kg) | Amerisource Bergen Drug Corp | 924326 | Optional: researcher can either use Midazolam on its own or BAM combination as an anesthetic |
| Butorphanol tartrate (Torbugesic) (0.45 mg/kg) | Fort Dodge Animal Health | NADA 135-780 | |
| Azaperone tartrate (0.25 mg/kg) | ZooPharm | ||
| Medetomadine HCl (0.07 mg/kg) | ZooPharm | ||
| Antipamezol hydrochloride (Antisedan) (dose: 0.25 mg/kg) | Orion Corporation | NADA 141-033 | |
| Oxytocin (10 IU/kg) | Vet One | 501013 | |
| Equipment—Mouse | |||
| P-200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μl pipette tips | Light Labs | B-2004-SH | |
| 1 ml syringes | MWI | 005427 | |
| 27 G needles | MWI | 002031 | |
| Equipment—Muntjac | |||
| 15 ml conical tubes | VWR | 21008-918 | |
| 22 G needles | MWI | 873 | |
| 3 ml luer lock syringes | MWI | 001377 | |
References
- Dueling, S. Muntiacus reevesi. Animal Diversity Web. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Muntiacus_reevesi (2004).
- Pei, K., Taber, R., O'Gara, B., Wang, Y. Breeding cycle of the Formosan Reeves muntjac (Muntiacus reevesi micrurus) in northern Taiwan, Republic of China. Mammalia. 59 (2), 223-228 (1995).
- Browning, S. R. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J. Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
- Van de perre, P. Transfer of antibody via mother's milk. Vaccine. 21 (24), 3374-3376 (2003).
- Maden, C. Genetically modified mice produce human milk protein. BioNews. , (2009).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- Depeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
- Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: effects of litter size and lactation. 84 (1), 127-133 (1986).
- Hedrich, H. J., Bullock, G. R. The laboratory mouse. , 735-736 (2004).
- Nishimori, K., Young, L. J., Guo, Q., Wang, Z., Insel, T. R., Matzuk, M. M. Oxytocin is required for nursing but is not essential for parturition or reproductive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (21), 11699-11704 (1996).
- Miller, B. F., Osborn, D. A., Lance, W. R., Howze, M. M., Warren, R. J., Miller, K. V. Butorphanol-azaperone-medetomidine for immobilization of captive white-tailed deer. 45 (2), 457-467 (2009).
