Introduction
Diermodellen inzicht in pathologie die niet kunnen worden verkregen door in vitro analyse. De meest effectieve resultaten oplevert, is het belangrijk om een diermodel dat nauw samenhangt met de ziekte en soorten van gebruik. Bijvoorbeeld, de Reeves 'muntjak (wordt reevesi), een kleine Aziatische hert 1,2 en transgene muizen die de cervid prion eiwit (CerTgPrP) 3 zijn nuttig diermodellen voor soorten hertachtigen. Beide soorten zijn polyestrous, waardoor het hele jaar door fokken, en dus een consistente bron voor zwangerschap-gerelateerde weefsels en vloeistoffen aan specifieke mechanismen bestuderen in hertachtigen biologie. Studies van melk hebben een breed scala van toepassingen die eenvoudiger (en goedkoop) bereikt in diermodellen dan bij de mens. Onderzoekers konden melk en biest als een potentiële bron van 1) overdracht van infectieziekten te onderzoeken, 2) immunoglobulinen overgedragen van moeder op nakomelingen in de ontwikpment van passieve immuniteit 4 en 3) lactoferrine, een eiwit dat voorkomt in moedermelk betrokken bij passieve immuniteit dat de onderzoekers op dit moment proberen om commercieel te produceren 5.
Het verzamelen van een grote hoeveelheid melk van kleine dieren kunnen blijken te zijn een moeilijke taak worden. Rogers voorgestelde benadering om melk te verzamelen van ratten 6, die vervolgens werd gebruikt in muizen. DePeters en Hovey voorgesteld twee methoden voor melkinzameling een een handmatig gegenereerde onderdruk door een rubberen pipet bolbodem een Pasteur pipet en een tweede waarbij de constructie van een melkstel, die vervolgens wordt bevestigd aan een vacuümbron (zoals als een kraan) voor muis melk 7 oogsten. Hier stellen we een eenvoudige, goedkope methode voor het verzamelen van melk van zowel muizen als Reeves 'muntjac herten, die alleen beschikbaar laboratorium apparatuur en technische basisvaardigheden vereist. Onze methode levert voldoende hoeveelheden melk voor diversetoepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mouse Milking Protocol
De in dit protocol beschreven methoden werden goedgekeurd door IACUC.
1. Scheiding van de Dam van Offspring
- Selecteer de dam om gemolken te worden. Kies een dam met een nestje van 4 of meer pups die 8-12 dagen na het werpen te zorgen maximale ophalen van melk-hoewel collectie is mogelijk op elk tijdstip na de bevalling tot 21 dagen.
- Scheid de dam uit haar nest minstens 2 uur voor het melken.
Opmerking: Indien een verlangen om meer dan een dam melk in een bepaalde periode, is het acceptabel om de gescheiden dammen in dezelfde kooi met voldoende voedsel en water te huisvesten.
2. Toediening van Oxytocine, Anesthesie en Eye Glijmiddel
- Dien 2 IE / kg van oxytocine intraperitoneaal (IP). Oxytocine is een hormoon dat de melk van lacterende vrouwen om de afgifte van melk stimuleren. Oxytocine kan worden verworven frOM een dierenarts.
- Dien een verdoving mengsel dat 80-100 mg / kg ketamine in combinatie met 5-10 mg / kg xylazine IP. Zo kan een 10 ml stock anesthesiemengsels worden voorbereid voor muizen gewicht van ongeveer 30 gram en zou omvatten 0,1 ml xylazine, 8,9 ml H2O en 1,0 ml ketamine. 0,25 ml totale verdoving een muis van deze omvang verdoven voor ongeveer 20-30 minuten, die voldoende tijd voor het ophalen van melk moeten verstrekken.
Opmerkingen: Om vast te stellen dat het dier met succes is verdoofd, plaats voorzichtig haar op haar buik op een stevige ondergrond; ze mogen niet bewegen haar voeten of een poging om te stijgen naar haar voeten als ze volledig verdoofd. Bij een muis niet volledig verdoofd met de oorspronkelijke dosering, kan de onderzoeker een toedienen ¼ of ½ van de oorspronkelijke dosis van het anestheticum mengsel afhankelijk van de grootte van de muis en / of het niveau van sedatie dat de muis verworvenheden . Echter, dit kon ikncrease de kans op een negatieve reactie op anesthesie, en kan ook resulteren in de muis wordt dieper verdoofd en / of verdoofd voor een langere periode.
Opmerking: Als melken meer dan een dam, is het noodzakelijk oxytocine en verdoving injecties door de korte halfwaardetijd van oxytocine en sedatie moment voor ketamine en xylazine spreiden. - Breng een kleine hoeveelheid oogzalf om de hoek van elk oog en verspreid naar de ogen van de muis uitdroogt terwijl onder narcose.
3. Melk Collection
Het ophalen van melk is het meest eenvoudig uitgevoerd met twee onderzoekers: een onderzoeker aan de verdoofde muis vast te houden terwijl handmatig de uiting van de melk (aangeduid als R1), en een onderzoeker aan de melk (R2) te verzamelen. Deze methode kan ook worden uitgevoerd met een persoon, wanneer de muis wordt bevestigd op een plat oppervlak om schade te voorkomen.
- R2 moeten worden uitgerust met steriele alcohol prep pads, een P-200 pipEtman, een schone pipet tip voor elke muis, en een container aan de melk, zoals een 1,5 ml Eppendorf buis of een 1,2 ml cryovial (zie tabel van Materialen) houden.
- Zoals de oxytocine begint door te voeren, zal de melkafgifte zichtbaar in borstklieren gebied van de muis geworden (zie figuur 1A). R1: Haal een steriele alcohol prep pad en veeg de borstklier gebied van de muis om het gebied voorafgaand aan het melken schoon te maken. Handmatig kolven van de tepel met behulp van de duim en wijsvinger zachtjes masseren en knijp het borstweefsel in een opwaartse beweging tot een zichtbare kraal melk begint te vormen bij de basis van de speen.
- Druk op de P-200 pipetman plunjer naar zijn eerste stop om lucht te laten ontsnappen uit de pipet tip en voor te bereiden voor het ophalen van melk.
- Plaats de pipetpunt bovenaan de druppel melk en trek de melk in de pipetpunt door langzaam vrijgeven van de druk op de zuiger. Let er dan op de tip te dicht bij de speen of de huid aan te brengen (zieFiguur 1B). Het is niet nodig om de plunjer volledig vrij te geven als dit de melk zal trekken tot aan de bovenkant van de pipetpunt en het moeilijk maken om de vaak viskeuze melk verdrijven in de houdcontainer.
- Verdrijf de melk in de container met behulp van de duim om op de zuiger voorbij de eerste stop (zie figuur 1C). Om uitzetting van kleine volumes te vergemakkelijken, druk op de pipet tip tegen de zijkant van de buis, zodat er geen vloeistof verloren gaat.
- Blijf handmatig kolven uit elke speen, bewegen in klokwijzerrichting of tegen zodat ze geen spenen slaan. Het is zowel aanvaardbaar en nuttig om terug te komen en voortdurend uiten melk van dezelfde speen moet produceren meer melk dan de andere.
4. Verdoving Omkering in de Dam
- In de meeste gevallen is het gebruikelijk om de dam te gaan beginnen wakker tijdens het melken. Indien dit niet het geval is, zet de dam in een cage indirect onder een warmtebron, zoals een verwarmd circulerende deken, totdat ze begint te ontwaken.
Opmerking: Omdat de dam begint wakker te worden, houden nauwkeurige observatie van haar activiteit totdat ze in staat is om te lopen over haar kooi in haar eentje. - Zodra de dam beweegt over de kooi zonder strijd, zet haar terug in haar oorspronkelijke kooi met haar nestje. Geen nadelige gevolgen zijn geconstateerd met betrekking tot de pups 'vermogen om te voeden na het ophalen van melk.
2. Muntjac Milking Protocol
De in dit protocol beschreven methoden werden goedgekeurd door IACUC.
1. Scheiding van de Doe uit Offspring
- Selecteer de hinde te melken. Reeves 'muntjak hert algemeen bevallen van een fawn 2. Melk de hinde de dag na geboorte aan het reetje mogelijkheid om de toegang tot essentiële voedingsstoffen krijgen in colostrum 8 mogelijk te maken.
Opmerking: De fawn verbergt meestal en niet opnieuw in de procedure; scheiding van de moeder-nakomelingen paar is niet noodzakelijk.
2. Toediening van Oxytocine, Anesthesie en Eye Glijmiddel
- Dien 10 IE / kg Oxytocine intramusculair (IM). Oxytocine is een hormoon dat inwerkt op de melkklieren van de zogende vrouwen om de teleurstelling van melk te stimuleren. Oxytocine kan worden verkregen van een dierenarts.
- Dien de BAM verdoving IM 11 met butorphanol 0,45 mg / kg, azaperon 0,25 mg / kg, medetomadine 0,07 mg / kg. Een dosis van het BAM verdoving mengsel zal een muntjak verdoven voor ongeveer 20-30 minuten, die meer dan voldoende tijd voor complete ophalen van melk voorziet. Een andere optie voor verdoving midazolam op 1-2 mg / kg, die een muntjac zal sederen ongeveer 10-15 minuten. Hoewel dit biedt voldoende tijd voor het ophalen van melk, wordt deze verdoving sneller gemetaboliseerd dan BAM en het dier kan proberen te ontsnappen aan het einde van de kortere periode.
Opmerking: Minimale reactie op pijn, Kleine reflexen bij aanraken van de oren, gevolgd door het vermogen van R1 MJ houden zonder strijd blijkt dat het dier succesvol is verdoofd.
Opmerking: Bij een muntjac niet volledig verdoofd met de oorspronkelijke dosering, kan de onderzoeker een toedienen ¼ of ½ van de oorspronkelijke dosis van het anestheticum mengsel afhankelijk van de grootte van het dier en / of het niveau van sedatie reeds is bereikt. Echter, kan dit de kans op een negatieve reactie op anesthesie verhogen en ook kan leiden tot muntjac wordt dieper verdoofd en / of verdoofd voor een langere periode. - Breng een kleine hoeveelheid smeermiddel om de hoek van elk oog en uitbreiden tot de ogen van de muntjak's uitdroogt terwijl onder narcose.
3. Melk Collection
Het ophalen van melk is het meest eenvoudig uit te voeren met twee onderzoekers; een onderzoeker aan de verdoofde muntjak houden inde schoot tijdens het handmatig uiting van de melk (Bedoeld als R1), en een tweede onderzoeker aan het hoofd van de muntjak in een comfortabele en veilige positie te houden en om de melk (R2) te verzamelen.
- Afhankelijk van de verdoving gebruikt, moeten melken in hun hokken worden uitgevoerd ofwel 1) naar een veilige plaats voor hen moeten ze wakker worden tijdens de procedure (-midazolam veroorzaakte) in een-beddengoed gratis voorkamer 2) of om schoon te houden (BAM- geïnduceerde).
- R1 en R2 moeten worden uitgerust met-ethanol gedrenkt gaas en diverse 15 ml conische polypropyleenbuizen om de melk te houden.
- Zoals de oxytocine begint door te voeren, zal de melkafgifte zichtbaar in borstklieren gebied de muntjak geworden. R1: Sanitize gehandschoende handen en vingers, alsmede de gehele uier en elke individuele speen van het dier met de ethanol gedrenkt gaas. R2: Houd het hoofd van de muntjak in een veilige en comfortabele positie om het gemak van de ademhaling mogelijk maken en helpen voorkomen pens oprispingen. Houd de collectie buis cl OSE op de speen gemolken zonder aan te raken om mogelijke besmetting te voorkomen.
- Kolven van de ene speen met behulp van de duim en wijsvinger om knijp het borstweefsel in een opwaartse beweging totdat de speen wordt volgezogen met melk, en zachtjes rol de melk uit de speen en in de buis die R2 houdt (zie figuur 2 ).
- Opmerking: De melk komt uit in een stroom, dus is het belangrijk voor R2 de verzamelbuis geplaatst dat weinig tot geen melk zal worden verspild.
- Uier De muntjak is verdeeld in kwadranten. R1: Blijf kolven van elk kwadrant totdat de melk niet meer stroomt gemakkelijk. Als de melk niet kan worden uitgedrukt van de ene speen, uiten van alle andere spenen alvorens terug te keren naar de eerste. Het is zowel aanvaardbaar en nuttig om terug te komen en voortdurend uiten melk van dezelfde speen moet produceren meer melk dan de andere.
4. Verdoving Omkering in de Doe
t "> Het is gebruikelijk voor-midazolam geïnduceerde doe om te beginnen om wakker te worden tijdens het melken. In de meeste gevallen zal de hinde proberen te ontsnappen voordat alle melk is geuit. wordt Minor terughoudendheid gebruikt in een poging om de melk te verhogen opbrengst, maar de veiligheid en het comfort van zowel de onderzoekers en de hinde zijn even belangrijk.- Dien atipamezol met 2,5 mg / mg medetomadine subcutaan voor een snelle ommekeer van BAM verdoofd doe.
Opmerking: Met beide soorten verdoving, is het noodzakelijk om een nauwkeurige observatie van de hinde handhaven totdat ze in staat is in haar eentje te lopen zonder te struikelen of vallen, en is in staat om te eten en te drinken zonder angst voor aspiratie of stikken. Geen nadelige gevolgen zijn geconstateerd met betrekking tot het vermogen van de fawn om verpleegkundige na het ophalen van melk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Muis
Uit onze experimenten hebben we vastgesteld dat het mogelijk is om ongeveer 100-400 pl melk ve laboratoriummuis, afhankelijk van verschillende variabelen verzamelen. Deze variabelen zijn 1) het bedrag van de tijd gereserveerd voor het verzamelen, 2) de dosis oxytocine toegediend, 3) hoeveel pups de dam is momenteel verpleging en 4) de hoeveelheid tijd na de bevalling. Onze studies hebben aangetoond dat de hoogste opbrengst wordt verkregen wanneer de dammen gescheiden van hun nakomelingen ten minste 2 uur en ten minste 45 minuten tot een uur wordt uitgetrokken voor het melken per muis. Maximale melk volumes werden geoogst 8-12 dagen na het werpen met behulp van 2 IE / kg van oxytocine. Onze resultaten zijn meestal in overeenstemming met andere studies waar worpgrootte positief gecorreleerd was met melkgift 9 (zie figuur 3).
Muntjac
Hoewel de hoeveelheid melk harverworven van de muntjak was variabel van dag tot dag, waren we in staat om te verzamelen 5 tot 30 ml melk / dam / sessie, afhankelijk van de gebruikte anesthesie en / of tijd na de bevalling. Muntjac herten zijn polyestrous; melk kan worden verzameld op verschillende tijdstippen gedurende het jaar 2 (zie tabel 1). -Midazolam geïnduceerde doe bleef onder narcose voor zo weinig als 10 minuten, waardoor kleinere volume collecties (typisch 5-30 ml), terwijl BAM-geïnduceerde doe liep een langere periode van verdovend effect (20-30 min), waardoor volledige melk expressie (15-130 ml). Melk collecties werden stopgezet toen melk werd niet meer in voldoende hoeveelheden wordt geproduceerd door de hinde, en de bijbehorende fawn werd gevoed op een dieet van voornamelijk hooi voer.
Figuur 1. (A) De dam217; s spenen worden overvuld met melk bij oxytocine injectie (B) Het verzamelen van melk van een verdoofde dam met behulp van een P-200 pipetman (C) uitwerpen van melk in een 1,2 ml cryovial...
Figuur 2. Muntjac melk wordt verzameld in een 15 ml conische buis.
Figuur 3. Geschatte melkgift verzameld van muizen gebaseerd op worpgrootte, en de leeftijd van de pups.
Tabel 1. Melk collectie begin-en einddatum voor zogende Reeves 'muntjac dammen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Muis
Er zijn verschillende factoren om rekening te houden bij het verzamelen van melk van een muis, waaronder 1) het bedrag van de tijd gereserveerd voor het verzamelen, 2) de dosis oxytocine toegediend, 3) hoeveel pups de dam is momenteel verpleging en 4) het bedrag van de tijd die is verstreken sinds de bevalling op het moment van de collectie. Met behulp van eerdere studies als leidraad hebben we besloten om de voorwaarden voor de melkgift te optimaliseren.
Eerder onderzoek heeft direct gecorreleerd melkgift met worpgrootte 8. Helaas, worpgrootte is een variabele die niet kan worden gecontroleerd. Echter, kan het tijdstip van melken na de bevalling worden gecontroleerd. Volgens The Laboratory Mouse maximale melk secretie is bij 8-10 dagen na de bevalling 9. Onze ervaring is in congruentie met deze stelling.
Het is aangetoond dat oxytocine een onvervangbare rol melkproductie na speeltbevalling 10. Oxytocine doses variërend van 0,1 IE / kg 9-4 IE / kg 6 gemeld voor ophalen van melk op knaagdieren 6,7,9. We begonnen onze studie door het toedienen van de laagste dosis voorgesteld, 0,1 IE / kg 9. Met deze dosering, de hoeveelheid melk van de muis te klein om te meten of verzamelen. Bij toenemende dosis oxytocine 2 IE / kg 6,7, melkgift aanzienlijk hoger na ongeveer 120 ul. Want we wilden de laagste dosering van oxytocine te gebruiken om een optimale inzameling melk te bereiken, hebben we niet doses hoger dan 2 IE / kg toe te dienen.
Melkgift is ook afhankelijk van de hoeveelheid tijd gereserveerd voor de collectie. We hebben vastgesteld dat een minimum van 3 uur is noodzakelijk voor een optimale collectie-2 uur voor de pups te worden gescheiden van de dam en 1 uur voor de materiële voorbereiding en collectie. Het verzamelen van melk van verschillende dammen in een sessie zal de totale tijd die nodig is afnemen totoogst een specifiek volume melk, dat wil zeggen 2 uur tot pups, 30 min te installeren materialen en 20-30 min apart van melk van elk dam verzamelen. Elke dam moet gevolgd worden tot ze wakker zijn voordat ze geplaatst terug met hun pups. We hebben opgemerkt dat het meer tijd gereserveerd voor het melken leidt tot een hogere melkproductie, omdat de muis kan worden gemolken totdat ze weer bij bewustzijn.
Gevallen doen zich met dierlijke modellen die melkgift zal beïnvloeden. Een veel voorkomend probleem is de aanwezigheid van bloed of exsudaat in de melk van oudere dammen die herhaaldelijk zijn gefokt en hebben grote nesten, of dammen die borstvoeding hun eerste nest. Als dit gebeurt, raden wij staken het ophalen van melk die bepaalde speen. Het is raadzaam om pipetpunten schakelen op dit moment en eventuele exsudaat of bloed verwijderen.
Onderzoekers uitvoeren van deze werkwijze moet zich ook bewust dat, zoals vaak het geval is bij het gebruik van dierlijke modellen, resultaten variëren (Figuur3). Als een minder dan optimale hoeveelheid melk wordt opgevangen in een sessie, het de voorkeur om de werkwijze op een later tijdstip (bijv. 24-48 uur) plaats herhalen veranderen de experimentele condities melk release force.
Muntjac
De hoeveelheid verzamelde melk van Reeves 'muntjac dammen was afhankelijk van de verdoving gebruikt. Onze eerste verdoving van keuze was midazolam. Midazolam leverden voldoende sedatie tot terughoudendheid zorgen voor korte tijd-dat wil zeggen, als R1 had een rustig karakter en kon de muntjak rustig te houden, R2 kon dan het melken te nemen om de opbrengst te verhogen voordat de muntjak zou ontwaken-de veiligheid en het comfort van zowel dier en handler waren van het grootste belang en we verlaten het melken moeite als we voelden ofwel werd gecompromitteerd. We ontdekten dat muntjac doe snel tolerant voor midazolam worden en dat hogere doses nodig zou zijn na herhaalde blootstelling, het maken van melk collectie twee keer per week steeds moeilijker.
Het tekort aan midazolam, in combinatie met een gebouw tolerantie, leidde ons naar een alternatief verdovingsmiddel onderzoek. Een mengsel van Butorfanol, Azaperon en Medetomadine (BAM) wordt effectief gebruikt voor de immobilisatie van witte staart herten 11. In onze handen, de BAM cocktail leverden voldoende verdoving om de verzameling van aanvaardbare hoeveelheden melk toe op een veilige manier, met minder drugtolerantie na herhaald gebruik, en met een betere controle in het omkeren van de effecten van de verdoving.
Sommige muntjac dammen last van gevoelige uiers en / of was de eerste keer moeder. Deze muntjac ontwikkeld blauwe plekken op de spenen tijdens het melken, en de melkstroom vertraagd of helemaal gestopt, wordt gevraagd ons aan de lopende sessie beëindigen. Als dit gebeurt, moet men een meer zachte melktechniek gebruiken in een poging om ongemak of blauwe plekken in de spenen te voorkomen.
e_content "> De melkproductie bleek was en afnemen bij verschillende gelegenheden. Lage melk oogsten kan worden veroorzaakt door 1) de welpen die verpleegd vlak voor verzamelingen of 2) een daling van de melkproductie als gevolg van het natuurlijke proces van fawn spenen.Hoewel het een moeilijke proces kan zijn om een aanzienlijke hoeveelheid melk van kleine diermodellen te verkrijgen, ons werk illustreert dat het inderdaad een mogelijkheid voor zowel de muis als muntjac modellen; noch die uitgebreide vaardigheid noch diepe zakken, gewoon doorzettingsvermogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials—Mouse | |||
| Ketamine (KetaVed 100 mg/ml) (dose: 80-100 mg/kg) | MWI/Vedco | 011075 | |
| Xylazine (TranquiVed 100 mg/ml) (dose: 5-10 mg/kg) | MWI/Vedco | NADA 139236 | |
| Eye lubricant | MWI/Apexa | 701013 | |
| Oxytocin (2 IU/kg) | Vet One | 501013 | |
| Materials—Muntjac | |||
| Midazolam (1-2 mg/kg) | Amerisource Bergen Drug Corp | 924326 | Optional: researcher can either use Midazolam on its own or BAM combination as an anesthetic |
| Butorphanol tartrate (Torbugesic) (0.45 mg/kg) | Fort Dodge Animal Health | NADA 135-780 | |
| Azaperone tartrate (0.25 mg/kg) | ZooPharm | ||
| Medetomadine HCl (0.07 mg/kg) | ZooPharm | ||
| Antipamezol hydrochloride (Antisedan) (dose: 0.25 mg/kg) | Orion Corporation | NADA 141-033 | |
| Oxytocin (10 IU/kg) | Vet One | 501013 | |
| Equipment—Mouse | |||
| P-200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μl pipette tips | Light Labs | B-2004-SH | |
| 1 ml syringes | MWI | 005427 | |
| 27 G needles | MWI | 002031 | |
| Equipment—Muntjac | |||
| 15 ml conical tubes | VWR | 21008-918 | |
| 22 G needles | MWI | 873 | |
| 3 ml luer lock syringes | MWI | 001377 | |
References
- Dueling, S. Muntiacus reevesi. Animal Diversity Web. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Muntiacus_reevesi (2004).
- Pei, K., Taber, R., O'Gara, B., Wang, Y. Breeding cycle of the Formosan Reeves muntjac (Muntiacus reevesi micrurus) in northern Taiwan, Republic of China. Mammalia. 59 (2), 223-228 (1995).
- Browning, S. R. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J. Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
- Van de perre, P. Transfer of antibody via mother's milk. Vaccine. 21 (24), 3374-3376 (2003).
- Maden, C. Genetically modified mice produce human milk protein. BioNews. , (2009).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- Depeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
- Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: effects of litter size and lactation. 84 (1), 127-133 (1986).
- Hedrich, H. J., Bullock, G. R. The laboratory mouse. , 735-736 (2004).
- Nishimori, K., Young, L. J., Guo, Q., Wang, Z., Insel, T. R., Matzuk, M. M. Oxytocin is required for nursing but is not essential for parturition or reproductive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (21), 11699-11704 (1996).
- Miller, B. F., Osborn, D. A., Lance, W. R., Howze, M. M., Warren, R. J., Miller, K. V. Butorphanol-azaperone-medetomidine for immobilization of captive white-tailed deer. 45 (2), 457-467 (2009).
