Introduction
Животные модели обеспечить понимание болезни патологии, которые не могут быть получены путем анализа ин витро. Для обеспечения наиболее эффективных результатов, важно использовать животную модель, которая тесно связана с болезнью и видов, представляющих интерес. Например, мунтжака в Ривза (Muntiacus reevesi), небольшой азиатские олени 1,2 и трансгенные мыши, экспрессирующие оленевых прионных белков (CerTgPrP) 3 являются полезными животных моделей для оленевых видов. Оба вида polyestrous, что позволяет круглый год разведение, и, следовательно, в соответствии источником для связанных с беременностью тканях и жидкостях для изучения конкретных механизмов в оленевых биологии. Исследования молока имеют широкий спектр приложений, которые являются более просто (и недорого), совершенных в животных моделях, чем у человека. Исследователи могли исследовать молоко и молозиво, как потенциального источника 1) инфекционного передачи болезни, 2) иммуноглобулины, переданные от матери к потомству в развитмат ветствующую защитную эк пассивного иммунитета 4 и 3) лактоферрина, белок, содержащийся в грудном молоке человека, участвующего в пассивного иммунитета, что исследователи в настоящее время пытается коммерчески производить 5.
Сбор значительное количество молока от мелких животных может оказаться трудной задачей. Роджерс был предложен подход для сбора молока от крыс 6, который впоследствии был использован в мышах. DePeters и Hovey предложены два способа сбора молока, один вручную с помощью вакуум-сгенерированный создаваемое каучук пипетки грушей на пипеткой Пастера и второй требующей строительство доильного аппарата, который затем прилагается к источнику вакуума (такие как кран) чтобы собрать мыши молоко 7. Здесь мы предлагаем простой, низкий затратный метод для сбора молока от мышей и Ривза олень мунжтак, что требует единственную имеющуюся лабораторного оборудования и основные технические навыки. Наш метод дает достаточные объемы молока для различныхприложений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Мышь Доение протокол
Методы, описанные в этом протоколе были утверждены IACUC.
1. Разделение плотины от Offspring
- Выберите плотину, чтобы доить. Выберите плотина с помете 4 и более щенков, которая 8-12 дней после родов, чтобы обеспечить максимальное молоко коллекции хотя коллекция можно в любой момент времени после родов до 21 дней.
- Отделите плотину с ее помета, по крайней мере 2 часа перед доением.
Примечание: В случае, если одно желание доить более одного плотину в данный период времени, это приемлемо для размещения разделенных плотин в одной клетке с достаточное питание и водоснабжение.
2. Администрация окситоцина, анестезии и глаз смазки
- Администрирование 2 МЕ / кг окситоцина внутрибрюшинно (IP). Окситоцин является гормоном, который действует на молочных железах кормящих женщин стимулирует высвобождение молока. Окситоцин можно приобрести фром ветеринар.
- Администрирование обезболивающий смеси, содержащей 80-100 мг / кг кетамина в комбинации с 5-10 мг / кг ксилазина IP. Например, в 10 мл основного анестетика смесь может быть подготовлен заранее для мышей весом около 30 г и будет включать 0,1 мл ксилазина, 8,9 мл H 2 O и 1,0 мл кетамина. 0,25 мл общее анестезирующее будет степенный мышь такого размера в течение примерно 20-30 мин, которая должна обеспечить достаточное время для сбора молока.
Примечания: Чтобы определить, что животное было успешно наркозом, осторожно положите ее на живот на твердую поверхность; она не должна двигаться ноги или попытки подняться на ноги, если она полностью под наркозом. В случае мышь не полностью наркозом с исходной дозы, исследователь может управлять другой ¼ или ½ от первоначальной дозы анестетика смесь в зависимости от размера мыши и / или уровня седации, что мышь уже достиг . Тем не менее, это могло бы яncrease вероятность неблагоприятной реакции на анестезию, а также может привести к мышь будучи более глубоко под наркозом и / или под наркозом в течение более длительного периода времени.
Примечание: Если доения более одного дамбу, необходимо, чтобы поразить окситоцин и анестезии инъекции в связи с коротким периодом полураспада окситоцина и время седации для кетамина и ксилазина. - Нанесите небольшое количество смазки глаз к углу каждого глаза и распространяются для предотвращения глаза мыши от высыхания в то время как под наркозом.
3. Коллекция Молоко
Коллекция молоко наиболее легко осуществляется с двух исследователей: один исследователь провести наркозом мышь, вручную выражая молоко (именуемые R1) и один исследователь собирать молоко (R2). Этот метод также может быть выполнена с одним человеком, если мышь закреплен на плоской поверхности, чтобы избежать повреждений.
- R2 должны быть оборудованы стерильных колодки алкоголя приготовительные, пипс Р-200Etman, чистый наконечник пипетки для каждой мыши, и контейнер для хранения молока, такой как 1,5 мл пробирку Эппендорфа или 1,2 мл криопробирку (см. таблицу материалов).
- Как окситоцин начинает вступать в силу, молоко разочарование станет видимым в молочной области мыши (см. рисунок 1А). R1: Берем стерильный алкоголь подготовительную площадку и аккуратно протрите молочной площадь мыши, чтобы очистить площадь перед доением. Вручную выразить молоко из соска при помощи большим и указательным пальцами, чтобы массируют и отжать ткань молочной железы в движении вверх, пока шарик видно из молока не начинает формироваться на основании соска.
- Нажмите P-200 Pipetman поршень, чтобы его первой остановки, чтобы выпустить воздух из кончика пипетки и подготовиться к сбора молока.
- Поместите наконечник пипетки в верхней части капле молока и осторожно тянуть молоко в наконечником пипетки медленно выпуская давление на поршень. Будьте осторожны, не вставляйте конец слишком близко к соску или кожи (см.Фигура 1В). Это не обязательно, чтобы полностью освободить поршень, так как это будет тянуть молоко вплоть до верхней части кончика пипетки и будет трудно изгнать часто вязкой молоко в холдинговой контейнера.
- Выгнать молоко в контейнере с помощью большой палец, чтобы нажать на поршень мимо первой остановки (см. рисунок 1С). Чтобы облегчить изгнание небольших объемах, нажмите пипетки против стороне трубки так, чтобы жидкость не теряется.
- Продолжить вручную сцеживать молоко из каждого соска, двигаясь в любом направлении по часовой стрелке или против часовой стрелки, чтобы не пропускать любые соски. Это и приемлемым и полезным вернуться к и постоянно сцеживать молоко из той же соска, если она производит больше молока, чем другой.
4. Обезболивающий Восстановление в плотины
- В большинстве случаев, он является общим для плотина начать, чтобы начать просыпаться во время процесса доения. Если это не так, разместить плотину в CAGэ косвенно под источником тепла, например, подогревом циркулирующей одеяло, пока она не начинает просыпаться.
Примечание: Как плотина начинает просыпаться, держать тщательное наблюдение ее деятельности, пока она не в состоянии идти о ее клетке на ее собственную. - После того, как плотина движется по клетке без борьбы, поместите ее обратно в ее оригинальной клетки с ее помета. Нет болезненных ощущений не было по отношению к способности щенков ", чтобы кормить после сбора молока отметил.
2. Muntjac Доение протокол
Методы, описанные в этом протоколе были утверждены IACUC.
1. Разделение Doe от Offspring
- Выберите лань доить. Ривза олень мунжтак обычно рождают одного палевый 2. Молоко лань на следующий день после родов, чтобы позволить палевый возможность получить доступ к основных питательных веществ в молозиве 8.
Примечание: палевый обычно скрывает и не появляется в течение прокedure; Разделение пары мать-потомок не является необходимым.
2. Администрация окситоцина, анестезии и глаз смазки
- Администрирование 10 МЕ / кг окситоцина внутримышечно (IM). Окситоцин является гормоном, который действует на молочных железах кормящих женщин, чтобы стимулировать ухудшением молока. Окситоцин можно приобрести от ветеринара.
- Администрирование анестетика BAM IM 11, содержащий буторфанола 0,45 мг / кг, azaperone 0,25 мг / кг, medetomadine 0,07 мг / кг. Одна доза анестетика смеси БАМ будет степенный в Muntjac примерно 20-30 мин, что обеспечивает достаточно времени для полного сбора молока. Еще один вариант для анестезии является мидазолам на 1-2 мг / кг, которая будет степенный в Muntjac примерно 10-15 мин. Хотя это обеспечивает достаточное время для сбора молока, это анестетик метаболизируется быстрее, чем BAM и животное может попытаться избежать в конце короткого периода времени.
Примечание: Минимальный реакция на боль, Незначительные рефлексы при прикосновении уши, после чего способности R1 для удержания МДж без борьбы показывает, что животное было успешно наркозом.
Примечание: В случае мунжтак не полностью наркозом с исходной дозы, исследователь может управлять другой ¼ или ½ от первоначальной дозы анестетика смеси в зависимости от размера животного и / или уровня седации, который уже был достигнуты. Тем не менее, это может увеличить вероятность неблагоприятной реакции на анестезию, а также может привести к мунтжака быть более глубоко под наркозом и / или под наркозом в течение более длительного периода времени. - Нанесите небольшое количество смазки на углу каждого глаза и распространения, чтобы предотвратить глаза Muntjac от высыхания в то время как под наркозом.
3. Коллекция Молоко
Коллекция молоко наиболее легко осуществляется с двух исследователей; один исследователь провести наркозом Muntjac вколенях в то время как вручную выражая молоко (именуемые R1), и второй исследователь, чтобы держать голову Muntjac в удобной и безопасной позиции и собирать молоко (R2).
- В зависимости от анестетика, доения должна быть выполнена либо 1) в своих ручек, чтобы обеспечить безопасное место для них, если они просыпаются во время процедуры (мидазолам, вызванной) или 2) в постельных принадлежностей без прихожей поддерживать чистоту (БАМ- индуцированной).
- R1 и R2 должен быть оснащен этанола пропитанной марли и несколько 15 мл конические полипропиленовые пробирки, чтобы удерживать молоко.
- Как окситоцин начинает вступать в силу, молоко разочарование станет видимым в молочной площади Muntjac в. R1: Sanitize в перчатках руки и пальцы, а также весь вымени и сосков каждого отдельного животного с этанолом пропитанной марли. R2: Держите голову Muntjac в безопасном и удобном положении, чтобы обеспечить легкость дыхания и помочь предотвратить рубца срыгивание. Держите кл коллекция трубок OSE, чтобы соска доят, не касаясь его, чтобы предотвратить возможное загрязнение.
- Экспресс молока из одной соска с помощью большого и указательного пальцев, чтобы аккуратно сожмите ткань молочной железы в восходящем движении, пока сосок не наливается молоко, и аккуратно свернуть молоко из соска и в трубку, что R2 держит (см. рисунок 2 ).
- Примечание: молоко выходит в потоке, поэтому очень важно для R2 иметь набор трубка расположены так, что практически не будет молока впустую.
- Вымя в Muntjac делится на сектора. R1: Продолжайте сцеживать молоко из каждого квадранта, пока молоко больше не течет легко. Если молоко не может быть выражено с одного соска, выразить от всех других сосков, прежде чем вернуться к первой. Это и приемлемым и полезным вернуться к и постоянно сцеживать молоко из той же соска, если она производит больше молока, чем другой.
4. Обезболивающий Восстановление в Доу
т "> Она является общей для мидазолама, вызванной лань, чтобы начать просыпаться во время процесса доения. В большинстве случаев самка попытается сбежать, прежде чем все молоко было выражено. Малой сдержанность используется в целях повышения молоко Выход, однако безопасность и комфорт как для исследователей и самки одинаково важны.- Администрирование атипамезол на 2,5 мг / мг medetomadine подкожно для быстрого разворота БАМа наркозом лань.
Примечание: При обоих видах анестезии, необходимо поддерживать тесное наблюдение за самку, пока она не в состоянии идти самостоятельно, не спотыкаясь или падения, и в состоянии есть и пить, не опасаясь аспирации или удушья. Нет болезненных ощущений не было по отношению к способности палевый, чтобы медсестра после сбора молока отметил.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мышь
От наших экспериментах, мы определили, что можно собрать около 100-400 мкл молока от одной лабораторной мыши, в зависимости от нескольких переменных. Эти переменные включают в себя 1) количество времени, отведенных для сбора, 2) дозу окситоцина ведении, 3), сколько щенков плотина в настоящее время ухода и 4) количество времени после родов. Наши исследования показали, что наибольший выход получается, когда плотины отделены от их потомства, по крайней мере 2 ч, и по крайней мере 45 мин до часа отведено на мышь для доения. Максимальные объемы молока собирали 8-12 дней после родов с помощью 2 МЕ / кг окситоцина. Наши результаты в основном в соответствии с другими исследованиями, где размер помета положительно коррелирует с удоем 9 (см. рисунок 3).
Muntjac
Хотя количество молока гарзакрепленный с мунжтак была переменной со дня на день, мы смогли собрать от 5 до 30 мл молока / плотины / сессии, в зависимости от используемой анестезии и / или время после родов. Muntjac олени polyestrous; молока могут быть собраны в различные моменты времени в течение всего 2 года (см. таблицу 1). Мидазолам вызванной лань оставался под наркозом всего за 10 мин, что позволяет для небольших коллекций объема (обычно 5-30 мл), в то время как БАМ-индуцированной лань выдержал длительный период обезболивающего эффекта (20-30 мин), что позволяет выражение полной молока (15-130 мл). Коллекции Молоко не было прекращено, когда молоко было более не производятся в достаточном количестве на лань, и соответствующий палевый в настоящее время питается на диете из основном сена корма.
Рисунок 1. (А) Плотина217; ы соски становятся переполненными с молоком при инжекции окситоцина (В) Коллекция молока из анестезированной плотины с помощью Р-200 Pipetman (С) Выброс молоко в 1,2 мл криопробирку...
Рисунок 2. Muntjac молоко собирают в 15 мл коническую трубку.
Рисунок 3. Ориентировочная надой молока собраны из мышей в зависимости от размера помета, и возраст щенков.
Таблица 1. Молоко сбАЗДЕЛ даты начала и окончания для кормящих Muntjac плотин Ривза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мышь
Есть несколько факторов, чтобы принять во внимание при сборе молока от мыши, в том числе 1) количество времени, отведенных для сбора, 2) дозу окситоцина вводили, 3), сколько щенков плотина в настоящее время ухода и 4) сумма времени, которое прошло с родов во время сбора. Использование предыдущие исследования в качестве руководства, мы приступаем к оптимизации условий для надоев.
Предыдущие исследования напрямую связана надои с плодовитостью 8. К сожалению, размер помета является переменной, которая не может контролироваться. Тем не менее, время доения сообщению родов можно контролировать. По секрецию максимальная молока Лаборатория мыши находится на 8-10 дней после родов 9. Наш опыт показывает, в сравнения с этим утверждением.
Было показано, что окситоцин играет незаменимую роль в молочной продукции сообщениюроды 10. Окситоцин дозы от 0,1 МЕ / кг 9 до 4 МЕ / кг 6 были зарегистрированы для сбора молока от грызунов 6,7,9. Мы начали наше исследование путем введения самую низкую дозу предложил, 0,1 МЕ / кг 9. Используя эту дозировку, количество молока, производимого с помощью мыши была слишком мала, чтобы измерить или собирать. При увеличении дозы окситоцина до 2 МЕ / кг 6,7, надой молока была значительно выше примерно в 120 мкл. Потому что мы хотели использовать самую низкую дозу окситоцина для достижения оптимального сбора молока, мы не вводить дозу, превышающую 2 МЕ / кг.
Надой молока также зависит от количества времени, отведенного на сбор. Мы определили, что как минимум на 3 часа необходимо для оптимального коллекция-2 часов для щенков, чтобы быть отделен от плотины и 1 час для подготовки материала и сбора. Сбор молока от нескольких плотин в одной сессии будет сократить общее время, необходимое дляурожай определенного объема молока, т. е. 2 час, чтобы отделить щенков, от 30 мин до установки материалов и 20-30 мин для сбора молока от каждой плотины. Каждый плотины необходимо контролировать, пока они не проснулись перед помещением обратно со своими щенками. Мы отметили, что чем больше времени отводится для доения приводит к более высоким надоев, потому что мышь можно доить, пока она не приходит в сознание.
Экземпляры возникают с животных моделях, что повлияет на надои. Один общий вопрос, является наличие крови или экссудата в молоке старых плотин, которые были выведены неоднократно и имеют большие пометы, или в плотин, которые нянчат их первый помет. Если это произойдет, мы предлагаем прекращение сбора молока от этого конкретного соска. Желательно, чтобы перейти советы пипетки в это время, и отказаться от любых экссудата или крови.
Исследователи, осуществляющие этот метод также должны знать, что, как это часто бывает при использовании животных моделей, результаты различаются (рис.3). Если меньше, чем оптимальное количество молока, собранные в одной сессии, предпочтительно повторить процедуру в более позднее время (например, 24-48 ч), а не изменять условия эксперимента, чтобы заставить высвобождение молока.
Muntjac
Объем молока, собранной из Muntjac плотин Ривза зависела от анестетика. Наша первоначальная анестетик выбора был мидазолам. Мидазолам условии достаточной седации, чтобы позволить сдержанность в течение коротких периодов времени-то есть, если R1 был спокойным нравом и мог держать Muntjac спокойствие, R2 может взять на себя доение увеличить выход до того, мунтжака бы пробудить-безопасность и комфорт как животных и обработчик были первостепенное значение, и мы отказались от доения усилия, если мы чувствовали либо была нарушена. Мы обнаружили, что мунтжака лань быстро стать терпимыми к мидазолама и что более высокие дозы будет необходимо после многократного воздействия, делает сбора молока два раза в неделю все труднее.
Нехватка мидазолама, в сочетании с допуском строительного, привело нас к исследованию альтернативный анестетик. Смесь Буторфанол, Azaperone и Medetomadine (БАМ) эффективно используется для иммобилизации белый хвост оленя 11. В наших руках, коктейль БАМ при условии достаточных анестезии, чтобы позволить коллекцию приемлемых объемов молока в безопасной манере, с меньшим допуском наркотиков после многократного использования, и с лучшим контролем в ликвидации последствий наркоза.
Некоторые Muntjac плотины пострадали от чувствительных вымени и / или были в первый раз матери. Эти мунтжака разработан кровоподтеки на соски во время процесса доения, и поток молока замедляется или полностью остановлен, побуждая нас прекратить текущий сеанс. Если это произойдет, следует использовать более мягкий метод доения в попытке предотвратить дискомфорт или кровоподтеки в сосках.
e_content "> Производство молока, казалось, воска и уменьшаться несколько раз. Низкие урожаи молоко может быть вызвано: 1) телята завершения ухода непосредственно перед коллекций или 2) снижение производства молока за счет естественного процесса палевый отъема.Хотя это может быть процесс пытается получить значительную объем молока от небольших животных моделях, наша работа показывает, что это действительно возможность для обоих мыши и моделей Muntjac; ни требуются обширные навыки, ни глубокие карманы, просто упорство.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials—Mouse | |||
| Ketamine (KetaVed 100 mg/ml) (dose: 80-100 mg/kg) | MWI/Vedco | 011075 | |
| Xylazine (TranquiVed 100 mg/ml) (dose: 5-10 mg/kg) | MWI/Vedco | NADA 139236 | |
| Eye lubricant | MWI/Apexa | 701013 | |
| Oxytocin (2 IU/kg) | Vet One | 501013 | |
| Materials—Muntjac | |||
| Midazolam (1-2 mg/kg) | Amerisource Bergen Drug Corp | 924326 | Optional: researcher can either use Midazolam on its own or BAM combination as an anesthetic |
| Butorphanol tartrate (Torbugesic) (0.45 mg/kg) | Fort Dodge Animal Health | NADA 135-780 | |
| Azaperone tartrate (0.25 mg/kg) | ZooPharm | ||
| Medetomadine HCl (0.07 mg/kg) | ZooPharm | ||
| Antipamezol hydrochloride (Antisedan) (dose: 0.25 mg/kg) | Orion Corporation | NADA 141-033 | |
| Oxytocin (10 IU/kg) | Vet One | 501013 | |
| Equipment—Mouse | |||
| P-200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μl pipette tips | Light Labs | B-2004-SH | |
| 1 ml syringes | MWI | 005427 | |
| 27 G needles | MWI | 002031 | |
| Equipment—Muntjac | |||
| 15 ml conical tubes | VWR | 21008-918 | |
| 22 G needles | MWI | 873 | |
| 3 ml luer lock syringes | MWI | 001377 | |
References
- Dueling, S. Muntiacus reevesi. Animal Diversity Web. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Muntiacus_reevesi (2004).
- Pei, K., Taber, R., O'Gara, B., Wang, Y. Breeding cycle of the Formosan Reeves muntjac (Muntiacus reevesi micrurus) in northern Taiwan, Republic of China. Mammalia. 59 (2), 223-228 (1995).
- Browning, S. R. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J. Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
- Van de perre, P. Transfer of antibody via mother's milk. Vaccine. 21 (24), 3374-3376 (2003).
- Maden, C. Genetically modified mice produce human milk protein. BioNews. , (2009).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- Depeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
- Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: effects of litter size and lactation. 84 (1), 127-133 (1986).
- Hedrich, H. J., Bullock, G. R. The laboratory mouse. , 735-736 (2004).
- Nishimori, K., Young, L. J., Guo, Q., Wang, Z., Insel, T. R., Matzuk, M. M. Oxytocin is required for nursing but is not essential for parturition or reproductive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (21), 11699-11704 (1996).
- Miller, B. F., Osborn, D. A., Lance, W. R., Howze, M. M., Warren, R. J., Miller, K. V. Butorphanol-azaperone-medetomidine for immobilization of captive white-tailed deer. 45 (2), 457-467 (2009).
