Introduction
Los modelos animales proporcionan información sobre la patología de la enfermedad que no puede ser adquirida mediante el análisis in vitro. Para proporcionar los resultados más eficaces, es importante utilizar un modelo animal que está estrechamente relacionado con la enfermedad y de las especies de interés. Por ejemplo, el muntjac Reeves (Muntiacus reevesi), un pequeño ciervo de Asia 1,2, y los ratones transgénicos que expresan la proteína priónica cérvido (CerTgPrP) 3 son los modelos animales útiles para las especies de cérvidos. Ambas especies son poliestro, lo que permite la cría durante todo el año, y por lo tanto una fuente constante de tejidos y fluidos relacionadas con el embarazo para estudiar mecanismos específicos en la biología cérvido. Los estudios de la leche tienen una amplia gama de aplicaciones que son más simplemente (y barata) realizados en modelos animales que en los seres humanos. Los investigadores podrían investigar la leche y el calostro como fuente potencial de 1) la transmisión de enfermedades infecciosas, 2) las inmunoglobulinas transferidos de madre a hijo en el desarrollo de ciertasllo de la inmunidad pasiva 4 y 3) la lactoferrina, una proteína presente en la leche materna humana implicada en la inmunidad pasiva que los investigadores están tratando actualmente para producir comercialmente 5.
La recolección de una cantidad sustancial de la leche de animales pequeños puede llegar a ser una tarea difícil. Rogers propone un enfoque para recoger la leche de ratas 6, que se utilizó posteriormente en ratones. De Peters y Hovey proponen dos métodos para la recogida de leche, uno utilizando un vacío generado manualmente-producida por un bulbo de pipeta de goma en una pipeta Pasteur, y una segunda que requiere la construcción de una unidad de ordeño, que luego se une a una fuente de vacío (tales como un grifo) para cosechar la leche del ratón 7. Aquí proponemos un método simple y económica para la recogida de leche de ambos ratones y ciervos muntjac Reeves, que requiere equipos de laboratorio sólo disponibles y habilidades técnicas básicas. Nuestro método proporciona un volumen suficiente de leche para variosaplicaciones.
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Protocol
1. Protocolo de ordeño Ratón
Los métodos descritos en este protocolo fue aprobado por el IACUC.
1. Separación de la presa de Offspring
- Seleccione la presa para ser ordeñadas. Elija una presa con una camada de 4 o más crías que es 8-12 días post parto para proporcionar leche máxima de recogida, aunque la colección es posible en cualquier punto después del parto hasta 21 días.
- Separe la presa de su camada por lo menos 2 horas antes del ordeño.
Nota: En caso de un deseo a la leche más de una presa en un determinado período de tiempo, es aceptable para albergar las presas separadas en la misma jaula con una alimentación adecuada y el suministro de agua.
2. La administración de oxitocina, Anestesia y lubricantes para ojos
- Administrar 2 UI / kg de oxitocina por vía intraperitoneal (IP). La oxitocina es una hormona que actúa sobre las glándulas mamarias de hembras lactantes para estimular la liberación de la leche. La oxitocina puede ser adquirido from un veterinario.
- Administrar una mezcla anestésica que contiene 80-100 mg / kg de ketamina en combinación con 5-10 mg / kg IP xilazina. Por ejemplo, una mezcla de 10 ml de solución madre anestesia se podría preparar con antelación para los ratones con un peso aproximado de 30 g e incluiría 0,1 ml de xilazina, 8,9 ml de H2O y 1,0 ml de ketamina. 0.25 anestésica ml se sedar a un ratón de este tamaño por aproximadamente 20 a 30 min, que debe proporcionar el tiempo adecuado para la recogida de leche.
Notas: Para determinar que el animal ha sido anestesiado con éxito, coloque suavemente su boca abajo sobre una superficie sólida; ella no debe estar en movimiento sus pies o intentar ponerse de pie si ella está totalmente anestesiado. En el caso de un ratón no está totalmente anestesiado con la dosis original, el investigador puede administrar otra de ¼ o ½ de la dosis original de la mezcla anestésica dependiendo del tamaño del ratón y / o el nivel de sedación que el ratón ya ha alcanzado . Sin embargo, esto podría iaumentar la cant posibilidad de una reacción adversa a la anestesia, y también puede resultar en el ratón está más profundamente anestesiados y / o anestesiado durante un período de tiempo más largo.
Nota: Si el ordeño más de una presa, es necesario escalonar la oxitocina y las inyecciones anestésicas debido a la corta vida media de la oxitocina y los tiempos de sedación para la ketamina y xilazina. - Aplique una pequeña cantidad de lubricante ocular a la esquina de cada ojo y se extendió a prevenir los ojos del ratón se seque mientras está bajo anestesia.
3. Recogida de Leche
La recogida de la leche se realiza más fácilmente con dos investigadores: un investigador para sostener el ratón anestesiado al tiempo que expresa manualmente la leche (denominado R1), y un investigador para recoger la leche (R2). Este método también se puede realizar con una sola persona, si el ratón está fijado sobre una superficie plana para evitar daño.
- R2 debe estar equipado con almohadillas con alcohol estériles, un pip P-200Etman, una punta de pipeta limpia para cada ratón, y un recipiente para contener la leche, tal como un tubo Eppendorf de 1,5 ml o 1,2 ml criovial (véase la Tabla de Materiales).
- Como la oxitocina empieza a hacer efecto, bajada de la leche se hará visible en la zona mamaria del ratón (véase la Figura 1 A). R1: Separar una almohadilla con alcohol estéril y frote suavemente la zona mamaria del ratón para limpiar la zona antes del ordeño. Expresar manualmente la leche de la teta utilizando el pulgar y el índice para masajear suavemente y apretar el tejido mamario en un movimiento hacia arriba hasta que una gota visible de la leche empieza a formar en la base de la tetina.
- Pulse el Pipetman émbolo P-200 a su primera parada para liberar el aire de la punta de la pipeta y prepararse para la recogida de leche.
- Coloque la punta de la pipeta en la parte superior de la gota de leche, y tire suavemente de la leche en la punta de la pipeta al liberar lentamente la presión sobre el émbolo. Tenga cuidado de no poner la punta demasiado cerca del pezón o la piel (verFigura 1B). No es necesario para liberar completamente el émbolo como este se tire de la leche todo el camino hasta la parte superior de la punta de pipeta y hará que sea difícil para expulsar la leche a menudo viscoso en el recipiente de retención.
- Expulsar la leche en el contenedor utilizando el pulgar para presionar el émbolo más allá de la primera parada (véase la Figura 1C). Para facilitar la expulsión de pequeños volúmenes, presione la punta de la pipeta contra el lado del tubo, de manera que no se pierda líquido.
- Continuar expresar manualmente la leche de cada pezón, moviéndose en sentido horario o en sentido contrario para que no se salte ninguna pezones. Es aceptable y útil para volver y expresar continuamente la leche de la misma teta debería producir más leche que el otro.
4. Reversión anestésico en la presa
- En la mayoría de los casos, es común que la presa para empezar a comenzar a despertar durante el proceso de ordeño. Si este no es el caso, coloque la presa en una cage indirectamente por debajo de una fuente de calor, como una frazada que circula calienta, hasta que comienza a despertar.
Nota: Como la presa comienza a despertar, mantener una estrecha observación de su actividad hasta que ella es capaz de caminar sobre su jaula por su cuenta. - Una vez que la represa se está moviendo alrededor de la jaula sin lucha, colocarla de nuevo en su jaula original con su camada. No hay efectos nocivos se han observado con respecto a la capacidad de las crías a alimentarse después de la recogida de leche.
2. Protocolo de ordeño Muntjac
Los métodos descritos en este protocolo fue aprobado por el IACUC.
1. Separación de los Pérez de Offspring
- Seleccione la gama de ser ordeñadas. Ciervos muntjac Reeves general dan a luz a un cervatillo 2. Ordeñar la cierva el día después del parto para permitir la oportunidad cervatillo para ganar acceso a los nutrientes esenciales en el calostro 8.
Nota: El cervatillo suele ocultar y no vuelve a aparecer durante el procedure; la separación del par madre-descendencia no es necesario.
2. La administración de oxitocina, Anestesia y lubricantes para ojos
- Administrar 10 UI / kg de oxitocina por vía intramuscular (IM). La oxitocina es una hormona que actúa sobre las glándulas mamarias de las hembras lactantes para estimular la bajada de la leche. La oxitocina puede ser adquirido de un veterinario.
- Administrar el anestésico BAM IM 11 que contiene butorfanol 0,45 mg / kg, azaperona 0,25 mg / kg, medetomadine 0,07 mg / kg. Una dosis de la mezcla anestésica BAM sedar un muntjac por aproximadamente 20 a 30 min, que proporciona el tiempo suficiente para la recolección de la leche completa. Otra opción para anestesia es de midazolam en 1-2 mg / kg, que sedar un muntjac de aproximadamente 10-15 minutos. Si bien esto proporciona un tiempo adecuado para la recogida de leche, este anestésico se metaboliza más rápidamente que BAM y el animal pueden intentar escapar al final del período de tiempo más corto.
Nota: respuesta mínima al dolor, Reflejos menores al tocar los oídos, seguidos por la capacidad de R1 para mantener el MJ sin lucha indica que el animal ha sido anestesiado con éxito.
Nota: En el caso de un muntjac no está totalmente anestesiado con la dosis original, el investigador puede administrar otra de ¼ o ½ de la dosis original de la mezcla anestésica dependiendo del tamaño del animal y / o el nivel de sedación que ya ha sido alcanzado. Sin embargo, esto podría aumentar la posibilidad de una reacción adversa a la anestesia, y también puede resultar en la muntjac ser más profundamente anestesiados y / o anestesiado durante un período de tiempo más largo. - Aplicar una pequeña cantidad de lubricante a la esquina de cada ojo y propagación para evitar que los ojos del muntjac de la desecación, mientras que bajo anestesia.
3. Recogida de Leche
La recolección de la leche se realiza más fácilmente con dos investigadores; uno de los investigadores para mantener el muntjac anestesiado enla vuelta al tiempo que expresa manualmente la leche (Conocida como R1), y un segundo investigador para mantener la cabeza del muntjac en una posición cómoda y segura y para recoger la leche (R2).
- Dependiendo de la anestesia utilizada, el ordeño debe llevarse a cabo ya sea 1) en sus corrales para proporcionar un lugar seguro para ellos en caso de que despierta durante el procedimiento (midazolam-inducida) 2) en una antesala-ropa de cama de forma gratuita o de mantener la limpieza (BAM- inducida).
- R1 y R2 deben estar equipados con una gasa empapada en etanol y varios tubos de 15 ml de polipropileno cónicos para mantener la leche.
- Como la oxitocina empieza a hacer efecto, bajada de la leche se hará visible en la zona mamaria del muntjac. R1: Desinfectar las manos y los dedos enguantados, así como toda la ubre y cada pezón individual del animal con la gasa empapada en etanol. R2: Sostenga la cabeza del muntjac en una posición segura y cómoda para permitir la facilidad de la respiración y ayudar a prevenir la regurgitación rumen. Mantenga los cl tubo de recogida OSE al pezón ordeñada sin tocarlo para evitar la contaminación potencial.
- Extraiga la leche de un pezón con los dedos pulgar e índice para apretar suavemente el tejido mamario en un movimiento hacia arriba hasta que el pezón se hincha con la leche, y rodar suavemente la leche del pezón y en el tubo que R2 está llevando a cabo (véase la Figura 2 ).
- Nota: La leche sale en un arroyo, por lo que es importante para el R2 para que el tubo de extracción colocado de manera que poco o nada de leche será en vano.
- La ubre de la muntjac se divide en cuadrantes. R1: Continuar para expresar la leche de cada cuadrante hasta que la leche ya no fluye fácilmente. Si la leche no se puede expresar de una teta, expresa de todas las otras tetinas antes de regresar a la primera. Es aceptable y útil para volver y expresar continuamente la leche de la misma teta debería producir más leche que el otro.
4. Inversión de anestésico en el DOE
t "> Es común que doe inducida midazolam-para empezar a despertar durante el proceso de ordeño. En la mayoría de los casos, la cierva intentará escapar antes de que toda la leche se ha expresado. moderación Minor se utiliza en un esfuerzo por aumentar la leche rendimiento; sin embargo, la seguridad y el confort tanto de los investigadores y la hembra son igualmente importantes.- Administrar atipamezol a 2,5 mg / mg medetomadine subcutánea para la rápida reversión de BAM anestesiado doe.
Nota: Con ambos tipos de anestesia, es necesario mantener una estrecha observación de la hembra hasta que ella es capaz de caminar por sí misma sin tropezar o caer, y es capaz de comer y beber sin temor a la aspiración o atragantamiento. No hay efectos nocivos se han observado con respecto a la capacidad del cervatillo para amamantar después de la recogida de leche.
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Representative Results
Ratón
Desde nuestros experimentos, hemos determinado que es posible recoger aproximadamente 100-400 l de leche de un ratón de laboratorio, dependen de diversas variables. Estas variables incluyen: 1) la cantidad de tiempo dedicado a la recolección, 2) la dosis de oxitocina administrada, 3) el número de crías de la presa es actualmente de enfermería y 4) el importe de la post parto vez. Nuestros estudios han demostrado que se obtiene el máximo rendimiento cuando las presas son separados de sus hijos por lo menos durante 2 horas, y por lo menos 45 minutos a una hora se ha reservado por ratón para el ordeño. Volúmenes máximos de leche fueron recolectadas 8-12 días después del parto por medio de 2 UI / kg de oxitocina. Nuestros resultados son en su mayoría de acuerdo con otros estudios en los que el tamaño de camada se correlacionó positivamente con la producción de leche 9 (véase la Figura 3).
Muntjac
Aunque la cantidad de Har lechecreados desde el muntjac fue variable en el día a día, hemos sido capaces de recoger 5 a 30 ml de leche / presa / sesión, dependiendo de la anestesia utilizada y / o post momento del parto. Ciervos Muntjac son poliestro; la leche se pueden recoger en diversos puntos temporales durante todo el año 2 (ver Tabla 1). Doe inducida Midazolam-permaneció bajo anestesia para tan poco como 10 minutos, lo que permite para las colecciones de menor volumen (normalmente 5-30 ml), mientras que la gama inducida BAM sufrió un período más largo del efecto anestésico (20-30 min), lo que permite la extracción de leche completa (15-130 ml). Colecciones de leche se interrumpieron cuando la leche ya no se produce en cantidades suficientes por el DOE y el cervatillo correspondiente se nutría en una dieta de forraje principalmente heno.
Figura 1. (A) La presa217; s pezones se congestionan con leche después de la inyección de oxitocina (B) Recogida de la leche de una madre anestesiada mediante un Pipetman P-200 (C) de eyección de la leche en un 1,2 ml criovial...
Figura 2. Leche Muntjac se recoge en un tubo cónico de 15 ml.
Figura 3. Producción de leche aproximado obtiene de ratones basado en el tamaño de camada, y la edad de las crías.
Tabla 1. Coll Lecheección iniciar y terminar las fechas para lactantes presas muntjac Reeves.
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Discussion
Ratón
Hay varios factores a tener en cuenta en la recogida de leche de un ratón, incluyendo 1) la cantidad de tiempo dedicado a la recolección, 2) la dosis de oxitocina administrada, 3) el número de crías de la presa es actualmente de enfermería y 4) la cantidad de tiempo que ha pasado desde el parto en el momento de la recolección. A partir de estudios anteriores como guía, nos dispusimos a optimizar las condiciones para la producción de leche.
Investigaciones anteriores han correlacionado directamente la producción de leche con el tamaño de camada 8. Desafortunadamente, tamaño de la camada es una variable que no se puede controlar. Sin embargo, el momento de la post parto de ordeño puede ser controlado. De acuerdo con el Laboratorio de Ratón máxima secreción de la leche que está en 8-10 días después de la parición 9. Nuestra experiencia es en congruencia con esta norma.
Se ha demostrado que la oxitocina desempeña un papel insustituible en la leche de post producciónparto 10. Dosis de oxitocina que van desde 0,1 UI / kg 9-4 UI / kg 6 se han reportado para la recogida de la leche de los roedores 6,7,9. Comenzamos nuestro estudio mediante la administración de la dosis mínima sugerida, 0,1 UI / kg 9. Usando esta dosis, la cantidad de leche producida por el ratón era demasiado pequeña para medir o recoger. Al aumentar la dosis de oxitocina a 2 UI / kg 6,7, la producción de leche fue considerablemente mayor en aproximadamente 120 l. Porque queríamos utilizar la dosis más baja de oxitocina para lograr la recolección de leche óptima, no administramos dosis superiores a 2 UI / kg.
La producción de leche depende también de la cantidad de tiempo dedicado a la colección. Hemos determinado que un mínimo de 3 horas es necesario para la óptima recolección hr-2 para los cachorros para ser separados de la presa y de 1 hora para la preparación y recogida de material. Recopilación de la leche de varias presas en una sesión disminuirá el tiempo total necesario paracosechar un volumen específico de la leche, es decir, 2 horas para separar las crías, 30 min a materiales de instalación y 20-30 min para recoger la leche de cada presa. Cada presa debe ser monitoreado hasta que esté despierto antes de ser colocado de nuevo con sus cachorros. Hemos tomado nota de que, cuanto más tiempo reservado para el ordeño conduce a mayor producción de leche, debido a que el ratón puede ser ordeñada hasta que recupere la conciencia.
Los casos surgen con modelos animales que afectará a la producción de leche. Un problema común es la presencia de sangre o exudado en la leche de madres de mayor edad que han sido criados en repetidas ocasiones y tienen camadas grandes, o en presas que están amamantando a su primera camada. Si esto ocurre, le sugerimos interrumpida la recogida de leche de esa teta particular. Es aconsejable cambiar las puntas de pipeta en este momento, y descartar cualquier exudado o sangre.
Los investigadores que llevan a cabo este método también debe ser consciente de que, como suele ser el caso cuando se utilizan modelos animales, los resultados varían (Figura3). Si se recoge una cantidad óptima de menos de leche en una sesión, es preferible repetir el procedimiento en un momento posterior (por ejemplo, 24-48 h) en lugar de alterar las condiciones experimentales a fuerza de liberación de la leche.
Muntjac
El volumen de leche obtenida de presas muntjac Reeves dependía de la anestesia utilizada. Nuestro anestésico de elección inicial fue el midazolam. Midazolam proporcionó suficiente sedación para permitir la restricción por períodos cortos de tiempo, es decir, si R1 tenía un carácter tranquilo y pudo mantener la calma muntjac, R2 podría hacerse cargo del ordeño para aumentar el rendimiento antes de que el muntjac despertaría-la seguridad y comodidad de ambos animales y manejador eran de suma importancia y que abandonaron el esfuerzo de ordeño si nos sentimos bien fue comprometida. Descubrimos que doe muntjac convierten rápidamente en tolerantes al midazolam y que dosis más altas serían necesarios después de la exposición repetida, haciendo acopio de leche dos veces por semana cada vez más difícil.
La escasez de midazolam, junto con una tolerancia de construcción, nos llevó a investigar un anestésico alternativa. Una mezcla de butorfanol, Azaperona y Medetomadine (BAM) es utilizado con eficacia para la inmovilización de venado cola blanca 11. En nuestras manos, el cóctel de BAM proporcionado anestesia suficientes para permitir la recogida de volúmenes aceptables de leche de una manera segura, con menor tolerancia a las drogas después del uso repetido, y con un mejor control en la reversión de los efectos de la anestesia.
Algunas presas muntjac sufrieron ubres sensibles y / o eran madres primerizas. Estos muntjac desarrolló moretones en los pezones durante el ordeño, y el flujo de leche disminuye o se detiene por completo, impulsándonos a suspender la sesión en curso. Si esto ocurre, se debe utilizar una técnica de ordeño más suave, en un intento para evitar molestias o contusiones en los pezones.
e_content "> La producción de leche parecía aumentar y disminuir en varias ocasiones. cosechas bajas de leche puede ser causada por 1) los cervatillos haber amamantado justo antes de colecciones o 2) una disminución en la producción de leche debido al proceso natural de destete cervatillo.Si bien puede ser un proceso de tratar de obtener un volumen considerable de la leche de los pequeños modelos animales, nuestro trabajo muestra que sí es una posibilidad para los modelos muntjac ratón y; ni que requiera extensa habilidad ni mucho dinero, simplemente perseverancia.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials—Mouse | |||
| Ketamine (KetaVed 100 mg/ml) (dose: 80-100 mg/kg) | MWI/Vedco | 011075 | |
| Xylazine (TranquiVed 100 mg/ml) (dose: 5-10 mg/kg) | MWI/Vedco | NADA 139236 | |
| Eye lubricant | MWI/Apexa | 701013 | |
| Oxytocin (2 IU/kg) | Vet One | 501013 | |
| Materials—Muntjac | |||
| Midazolam (1-2 mg/kg) | Amerisource Bergen Drug Corp | 924326 | Optional: researcher can either use Midazolam on its own or BAM combination as an anesthetic |
| Butorphanol tartrate (Torbugesic) (0.45 mg/kg) | Fort Dodge Animal Health | NADA 135-780 | |
| Azaperone tartrate (0.25 mg/kg) | ZooPharm | ||
| Medetomadine HCl (0.07 mg/kg) | ZooPharm | ||
| Antipamezol hydrochloride (Antisedan) (dose: 0.25 mg/kg) | Orion Corporation | NADA 141-033 | |
| Oxytocin (10 IU/kg) | Vet One | 501013 | |
| Equipment—Mouse | |||
| P-200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μl pipette tips | Light Labs | B-2004-SH | |
| 1 ml syringes | MWI | 005427 | |
| 27 G needles | MWI | 002031 | |
| Equipment—Muntjac | |||
| 15 ml conical tubes | VWR | 21008-918 | |
| 22 G needles | MWI | 873 | |
| 3 ml luer lock syringes | MWI | 001377 | |
References
- Dueling, S. Muntiacus reevesi. Animal Diversity Web. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Muntiacus_reevesi (2004).
- Pei, K., Taber, R., O'Gara, B., Wang, Y. Breeding cycle of the Formosan Reeves muntjac (Muntiacus reevesi micrurus) in northern Taiwan, Republic of China. Mammalia. 59 (2), 223-228 (1995).
- Browning, S. R. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J. Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
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- Miller, B. F., Osborn, D. A., Lance, W. R., Howze, M. M., Warren, R. J., Miller, K. V. Butorphanol-azaperone-medetomidine for immobilization of captive white-tailed deer. 45 (2), 457-467 (2009).
