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Immunology and Infection

La surveillance des changements dans la membrane de polarité, Membrane intégrité, et intracellulaires d'ions concentrations dans Published: February 17, 2014 doi: 10.3791/51008
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3
1Department of Microbiology and Immunology, University at Buffalo, State University of New York, 2Witebsky Center for Microbial Pathogenesis and Immunology, University at Buffalo, State University of New York, 3New York State Center of Excellence in Bioinformatics and Life Sciences, University at Buffalo, State University of New York
* These authors contributed equally

Summary

Contrairement à celle observée pour les eucaryotes, il ya un manque d'études qui dépolarisation de la membrane de détail et de la concentration d'ions changements dans les bactéries, principalement que leur petite taille rend les méthodes conventionnelles de mesure difficile. Ici, nous avons des protocoles détaillés pour le suivi de ces événements dans le Gram-positif important agent pathogène Streptococcus pneumoniae en utilisant des techniques de fluorescence.

Abstract

Membrane dépolarisation et les flux ioniques sont des événements qui ont été largement étudiés dans des systèmes biologiques en raison de leur capacité à influer profondément fonctions cellulaires, y compris l'énergétique et des transductions de signaux. Bien que les deux méthodes fluorescentes et électrophysiologiques, y compris l'utilisation de l'électrode et patch-clamp, ont été bien développés pour mesurer ces événements dans les cellules eucaryotes, la méthodologie de mesure des événements similaires dans des micro-organismes ont prouvé plus difficile à développer en raison de leur petite taille en combinaison avec la plus complexe surface externe de la membrane des bactéries de blindage. Au cours de nos études de mort initiation à Streptococcus pneumoniae (pneumocoque), nous voulions élucider le rôle des événements de la membrane, y compris les changements de polarité, l'intégrité et la concentration des ions intracellulaires. Recherche de la littérature, nous avons constaté que très peu d'études existent. D'autres chercheurs ont suivi l'absorption de radio-isotopes ou d'équilibre pour mesurer la grippe ionxes et potentiel de membrane et un nombre limité d'études, principalement dans des organismes Gram-négatifs, avaient connu un certain succès en utilisant carbocyanine ou oxonol colorants fluorescents pour mesurer le potentiel de membrane, ou le chargement des bactéries avec acétoxyméthylique cellulaire infiltrant (AM) versions d'ester de sensible aux ions colorants indicateurs fluorescents. Nous avons donc créé et optimisé les protocoles de mesure du potentiel de membrane, la rupture, et d'ions de transport dans l'organisme Gram-positif S. pneumoniae. Nous avons développé des protocoles utilisant le bis-oxonol colorant DiBAC 4 (3) et le colorant iodure de propidium cellulaire-imperméant pour mesurer dépolarisation de la membrane et de la rupture, respectivement, ainsi que des méthodes pour charger de manière optimale le pneumocoque avec les esters AM des colorants ratiométriques Fura-2, PBFI, BCECF et à détecter des changements dans les concentrations intracellulaires de Ca2 +, K + et H +, respectivement, en utilisant un lecteur de plaque par fluorescence détection. Ces protocoles sont les premiers de leur genre pour le pneumocoqueet la majorité de ces colorants n'ont pas été utilisés dans d'autres espèces bactériennes. Bien que nos protocoles ont été optimisés pour S. pneumoniae, nous croyons que ces approches devraient constituer un excellent point de départ pour des études similaires dans d'autres espèces bactériennes.

Introduction

Notre laboratoire a identifié un complexe protéine-lipide à partir de lait humain nommé Hamlet (pour Human Alpha-lactalbumine Fait létale pour les cellules tumorales) qui induit l'apoptose dans les cellules tumorales, mais est également capable de tuer une variété d'espèces bactériennes 1,2. Les espèces qui ont été jugées particulièrement sensibles sont ceux qui ciblent les voies respiratoires, avec Streptococcus pneumoniae (le pneumocoque) affichant la plus grande sensibilité et un phénotype de l'apoptose comme la mort de 2,3. Événements de transport dépolarisation de la membrane et d'ions spécifique sont bien décrits et événements cruciaux lors de l'apoptose dans des cellules eucaryotes, en particulier dans les mitochondries, où TPP + ions et des colorants fluorescents, dont le JC-1 et TMRE radioactives ont été utilisées pour démontrer la dépolarisation de la membrane mitochondriale 3 -5. Ainsi, nous avons cherché à en savoir plus sur l'effet de HAMLET sur ces fonctionnalités liées à la membrane dans le pneumocoque que nous avons concentré nos efforts pourdévelopper une meilleure compréhension des composants mécaniques du phénotype de l'apoptose comme les bactéries, avec un grand potentiel pour l'identification de nouveaux traitements antibactériens ou candidats vaccins dans le processus.

En cherchant à établir des protocoles pour nos études mécanistes, nous avons découvert que, contrairement à la méthodologie bien décrite dans les systèmes eucaryotes, il existe très peu d'études publiées en détail les mécanismes de la membrane bactérienne de 6,7 électrophysiologie et de transport d'ions. Ceci est principalement attribuable à la petite taille des micro-organismes et leur architecture de surface, en particulier la présence de la paroi cellulaire, qui limite l'accessibilité de la membrane pour l'utilisation de méthodes eucaryotes classiques comme patch clamp, bien que certaines études utilisant des protoplastes géants ont été effectués avec un succès mitigé 8,9. Comme le travail avec ces protoplastes géants n'est pas une méthode idéale ou même pratique pour la plupart des espèces bactériennes car il exige de l'hommebactéries ipulated dans un état ​​anormal et abiotique, les études limitées de polarité de la membrane bactérienne qui ont été réalisées ont principalement utilisé la cytométrie en flux et l'utilisation de cyanine et oxonol fluorescentes 10-16.

Au lieu de la cytométrie en flux, qui rassemble les lectures de fluorescence individuels d'une bactérie à un point de temps unique, nous avons choisi d'utiliser un lecteur de plaques de détection de fluorescence pour détecter l'intensité de fluorescence des suspensions de bactéries dans un format de plaque de 96 puits au cours du temps. Cela nous a permis de traiter une population de bactéries à différents points dans le temps avec beaucoup plus de simplicité et de facilité, de contrôler la cinétique de fluorescence de l'ensemble de la population pour de longues périodes de temps, ce qui est difficile à réaliser en utilisant la cytométrie de flux. Après avoir testé une grande variété de colorants fluorescents sensibles au potentiel (y compris ceux mentionnés ci-dessus pour une utilisation avec les mitochondries), nous avons obtenu les meilleurs succès technique et pratique à l'aide de l'colorant bis-oxonol appelé DiBAC 4 (3) (bis-(acide 1,3-dibutylbarbituric) triméthine oxonol) de surveiller les changements de polarité.

Nous avons aussi trouvé utile de surveiller simultanément les perturbations dans l'intégrité de la membrane en utilisant l'iodure de propidium (PI). Ce colorant fluorescent lors de la liaison à l'acide nucléique, mais n'est en mesure de le faire lorsque l'intégrité de la membrane bactérienne est compromise, ce qui en fait la composante populaire utilisé pour détecter les cellules mortes dans des essais vivants morts coloration. En plus de PI, SYTOX vert et TO-PRO-1 sont des colorants fluorescents qui sont similaires dans l'action et ont déjà été utilisés pour les bactéries dans quelques études utilisant la cytométrie de flux des méthodes de détection 17. Nous avons choisi d'utiliser PI en raison de sa longueur d'onde d'excitation qui nous a permis de suivre sa fluorescence en même temps que DiBAC dans un échantillon donné.

Dans nos études, nous avons observé que HAMLET, ainsi qu'un autre complexe de protéines-lipides est associée avec une activité bactéricideconnue sous le nom ELOA, induite par la dépolarisation et la rupture de la membrane bactérienne comme indiqué par l'augmentation de la fluorescence des deux colorants lors d'un traitement de la pneumocoques 3,18,26. Pour les deux complexes, nous avons observé que l'intensité de fluorescence de DiBAC 4 (3) a augmenté avant l'augmentation de l'intensité de PI, ce qui indique que la dépolarisation est survenu avant la rupture et est, par conséquent, un événement spécifique induite par les complexes bactéricides protéine-lipide d' intérêt. Cette distinction est importante à faire, comme la rupture de la membrane peut se faire dépolarisation non spécifique. Cinétique mesurer et d'analyser à la fois DiBAC 4 (3) et PI fluorescence simultanément nous a permis d'examiner cette relation entre les deux événements de la membrane, ce qui est un avantage supplémentaire de l'utilisation de la fluorimétrie à la place de la cytométrie de flux.

Pour contrôler le flux d'ions bactérienne, il ya eu un certain succès avec l'utilisation de radio-isotopes précédente, y compris la mesure de l'absorption de45 Ca 2 + dans le pneumocoque 19,20, que nous avons également utilisé dans nos études récentes 18, 21. Cependant, travailler avec ces ions radioactifs présente plusieurs inconvénients. Ils peuvent être coûteux, fastidieux et salissant, et peut également exposer la personne effectuant l'expérience de nuire, en fonction de l'isotope d'intérêt. En outre, il est difficile de surveiller des changements rapides dans le temps. Ainsi, nous nous sommes tournés vers une méthode de mesure alternative qui emploie versions acétoxyméthylique (AM) d'esters de l'indicateur fluorescent colorants sensibles aux ions. Par lui-même, le colorant indicateur est chargé et ne passe pas facilement à travers la membrane, mais avec l'addition du groupe ester lipophile, la molécule non chargée peut maintenant passer à travers la membrane de la bactérie. En entrant dans l'habitacle, les estérases bactériennes cliver le groupe ester, en laissant libre le colorant à l'intérieur de la cellule et à nouveau chargé, ce qui ralentit considérablement sa capacité à sortir de la cellule et en permettant au colorant to s'accumuler à l'intérieur au fil du temps. Cependant, l'utilisation de ces colorants ester n'a été décrite que dans quelques espèces bactériennes à détecter les changements dans intracellulaire de Ca 2 + et H + 22-24 16, avec diverses méthodes de chargement, de détection et de succès.

Avec le désir de suivre l'évolution de Ca 2 + intracellulaire et aussi les niveaux K + et H + dans S. pneumoniae lors du traitement avec Hamlet et d'autres composés, nous avons créé avec succès des protocoles pour charger efficacement colorants indicateurs fluorescents dans des cellules bactériennes. Chargement efficace dans des bactéries nécessaires à la fois probénécide qui augmente la rétention de colorant en bloquant d'anions transporteurs et PowerLoad, un composé exclusif de Life Technologies qui augmente l'efficacité de chargement. Fura-2/AM (détection Ca 2 +), PBFI / AM (détection K +), et BCECF / AM (détection H +) ont été chargés avec succès à la fois non encapsulé et encapsulé pneumocoque stpluies permettant la mesure des motifs de fluorescence résultant après l'addition d'ionophores, tels que l'ionomycine (Ca 2 + découpleur), la valinomycine (K + découpleur) et CCCP (H + découpleur) en utilisant un lecteur de plaques de détection de fluorescence 18, 21.

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Protocol

Une. Préparation cultures bactériennes

  1. Stimuler la culture pour une utilisation dans des expériences
    1. Dans un bloc de chauffage à 37 ° C, décongeler un stock-flacon congelé de S. pneumoniae et ajouter son contenu à 9 ml de frais, préchauffé bouillon de Todd-Hewitt avec de l'extrait de levure à 0,5% (THY) pour un volume total de 10 ml dans un tube de culture en verre.
    2. Incuber statiquement à 37 ° C jusqu'à ce que la culture atteigne la phase semi-log (Abs 600 nm ≈ 0,5-0,6).

2. Détection de dépolarisation de la membrane et de rupture

  1. Préparation des réactifs
    1. Préparer un bilan de 50 uM DiBAC 4 (3) dans 100% de DMSO, et à 2 mg / ml actions de PI dans le trou DDH 2 O. Le DiBAC 4 (3) stock est stable à -20 ° C pendant au moins 6 mois. Le PI actions est stable à 4 ° C pendant au moins 6 mois.
    2. Enveloppez les stocks de papier à l'abri de la lumière.
  2. Chargementbactéries
    1. Pellet les cellules bactériennes de l'étape 1.2.2 par centrifugation à 2400 xg pendant 10 min à température ambiante et laver deux fois en éliminant le surnageant, remettre en suspension le culot dans 10 ml de 1 x tampon phosphate salin (PBS), et centrifuger à nouveau à 2400 xg pendant 10 min.
    2. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans du PBS au volume d'origine. Cela fournira environ 10 8 unités par ml de bactéries formant des colonies. Retirer 1 ml (suffisant pour 5 échantillons) des cellules lavées et placer dans un tube à centrifuger.
    3. Pour ces cellules, ajouter 25 ul d'une solution mère 1 M, stérilisée par filtration de glucose (préparé dans le trou DDH 2 O et filtré à travers un filtre de 0,45 um) pour une concentration finale de 25 mM de glucose, et incuber dans un bloc chauffant à 37 ° C pour quinze minutes. NOTE: Ceci permet d'obtenir l'énergie pour tous les canaux de la membrane dépendant de l'ATP et des composants cellulaires. La nécessité de cette étape peut varier en fonction de l'expérience.
    4. Ajouter 5 ul de 50 uM DiBAC 4 (3) stock et 10 pi de 2 mg / ml PI actions. Ceci permet d'obtenir pour les concentrations finales de 250 nM et de 20 pg / ml, respectivement. Mélanger soigneusement par aspiration et à plusieurs reprises. Ajouter 200 pi de cette suspension cellulaire dans chaque puits d'échantillon d'une plaque de 96 puits clair.
  3. Détecter la fluorescence
    1. Placer la plaque dans un préchauffé (37 ° C) lecteur de plaques de détection de fluorescence.
    2. Assurez-vous que les filtres appropriés sont en place pour DiBAC 4 (3) (490 nm excitation, 516 nm émission) et PI (535 nm excitation, 617 nm émission) de détection.
    3. Pour permettre (et en même temps surveiller) équilibrage des DiBAC 4 (3) sur la membrane, mettre le lecteur à prendre des mesures de fluorescence chaque min environ 30-40 min, ou jusqu'à ce que la lecture se stabilise, ce qui sert de "pré-traitement" lecture.
    4. Éjecter la plaque et ajouter l'agent expérimental de choix et immediately placer la plaque arrière dans le lecteur de continuer à surveiller DiBAC 4 (3) et PI fluorescence pour la durée souhaitée. Si le traitement de plusieurs échantillons à la fois, à l'aide d'une pipette multicanaux peut être utile d'ajouter l'agent simultanément à tous les puits.
    5. Exporter les lectures d'un programme d'analyse de données telles que Microsoft Excel. Terrain fluorescence au cours du temps pour évaluer dépolarisation de la membrane et de la rupture. L'augmentation de la fluorescence de DiBAC et PI indique que la dépolarisation et la rupture se produisent.

3. Détection des changements dans intracellulaire de Ca 2 + ou K + concentrations

  1. Préparation des réactifs et du tampon de charge
    1. Préparer les réactifs suivants: 5 mM du colorant fluorescent sensible aux ions (Fura-2/AM ou PBFI / AM, ajouter la quantité appropriée de DMSO dans un tube contenant 50 pg de colorant), "100x" probénécide (ajouter 1 ml de PBS à un flacon de 77 mg). Le solubiliséles colorants peuvent être congelées à -20 ° C une fois et sont stables en solution pendant 3 mois, alors que la probénécide est stable en solution à -20 ° C pendant 6 mois.
    2. Préparer 1 ml de 2 x tampon de charge comme suit: Dans le fond d'un tube conique en matière plastique de 15 ml, verser 20 pl de 100x PowerLoad concentré (stable à 2-8 ° C pendant 6 mois), suivie de 2 ul de l'ion de 5 mM sensible colorant directement dans le PowerLoad. Vortex brièvement pour mélanger. Ajouter 960 pi de PBS suivis par 20 pi de 100x probénécide. Vortex le mélange une dernière fois. Envelopper dans du papier d'aluminium pour protéger de la lumière.
  2. Chargement des bactéries avec de la teinture
    1. Pellet et laver la culture bactérienne milieu de la phase de journal comme décrit au point 2.2.1. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 5 ml de PBS pour faire un "2x" suspension cellulaire.
    2. Ajouter 1 ml de la suspension cellulaire 2x au 2x Loading Buffer. Cela permettra d'avoir un volume final de 2 ml, et concentr finaletions de 1x PowerLoad, 5 uM colorant fluorescent, et 1x probénécide. NOTE: Cette suspension offre un volume suffisant pour 10 échantillons depuis chaque puits d'échantillon pour la mesure contiendra 200 pi.
    3. Incuber dans un bain d'eau à 37 ° pendant 75 min, à l'abri de la lumière. NOTE: Le colorant est chargé dans les cellules bactériennes en l'absence de n'importe quels substrats glycolytiques et en présence de probénécide pour minimiser l'efflux du colorant.
    4. WASH 1: Pellet les cellules par centrifugation à 2400 g pendant 10 min, retirer le surnageant et remettre en suspension dans 2 ml de PBS contenant probénécide 1x. WASH 2, 3: Répétez l'étape 3.2.4 2x. Incuber à 37 ° C pendant encore 30 min. Cela donnera le temps pour les estérases bactériennes pour hydrolyser le groupe ester d'AM à l'écart des colorants fluorescents internalisées.
    5. WASH 4: sédimenter les cellules par centrifugation à 2400 xg pendant 10 minutes, éliminer le surnageant et remettre en suspension dans 2 ml de PBS contenant du probénécide 1x. NOTE: Selon le experiment, le glucose peut être rajouté ici pour redynamiser les bactéries.
  3. Détecter la fluorescence
    1. Préchauffer la détection de fluorescence lecteur de plaque plaque de lecture à 37 ° C.
    2. Pour chaque échantillon on le souhaite, ajouter 200 ul de cellules chargées de l'étape (3.2.8) dans les puits d'une plaque à 96 puits. (Effectuez les étapes suivantes pour la fin pour un bien / échantillon à la fois).
    3. Pour établir une base de lecture pour un bien, place plaque dans la détection de la fluorescence lecteur de plaques pour mesurer la fluorescence (340 nm d'excitation / 510 nm émission pour "Valeur 1" et 380 nm d'excitation / 510 nm émission pour "Valeur 2") à toutes les secondes pendant une minute.
    4. Éjecter la plaque, ajouter le traitement de choix pour que le bien (dans un petit volume d'environ 5 pi), la pipette rapidement de haut en bas plusieurs fois pour mélanger et placer immédiatement de retour dans la détection de la fluorescence lecteur de plaques à lire toutes les secondes pendant souhaitée longueur de temps. (Si l'eninjecteurs associés au lecteur de plaques sont disponibles, ceux-ci pourraient également être utilisés pour ajouter de façon transparente le traitement désiré, ce qui élimine la nécessité d'arrêter la lecture et éjecter la plaque).
    5. Exporter les lectures d'un programme d'analyse de données telles que Microsoft Excel. Calculer le rapport des valeurs de fluorescence pour chaque point de temps en divisant la valeur 1 par la valeur 2, et tracer les valeurs de rapport sur un graphique.

4. Détecter des changements dans pH intracellulaire

  1. Préparation des réactifs et des tampons d'étalonnage
    1. Préparer les réactifs suivants: 5 mM de BCECF / AM (. Ajouter la quantité appropriée de DMSO dans un tube contenant 50 pg de colorant Ce stock est stable à -20 ° C pendant 3 mois); 100x probénécide (ajouter 1 ml de PBS à un flacon 77 mg);. 1 mM préparation de nigéricine dans l'éthanol (requis pour équilibrer le pH intracellulaire (pH i) des cellules au pH du tampon entourant Ce stock est stable à -20 ° C pendant 6 mois);. mM de cyanure de carbonyle 3 chlorophénylhydrazone (CCCP) dans le DMSO (protonophore de découpler la force proton motrice 0,5 Ce stock est stable à -20 ° C pendant 6 mois)
    2. Préparer 10 ml de tampons de potassium élevés suivants: NaOH 135 mM KH 2 PO 4/20 mM (de monobasique), et 110 mM de NaOH K 2 HPO 4/20 mM (de dibasique). Stériliser par filtration en utilisant un filtre de 0,45 um. (Ces tampons peuvent être stockés à 4 ° C jusqu'à utilisation).
    3. Mélanger les tampons riches en potassium dans les proportions nécessaires pour créer des tampons riches en potassium, avec au moins des valeurs de pH de 5 à 6 allant de 6,5 à 8,0.
    4. Préparer 1 ml de tampon de charge 2x comme suit: Dans le fond d'un tube conique en matière plastique de 15 ml, verser 40 pl de 100x PowerLoad, suivis par 20 ul de la 5 mM sensible aux ions colorant directement dans le PowerLoad. Vortex brièvement pour mélanger. Ajouter 900 pi de PBS suivis par 40 pi de 100x probénécide. Vortex mélange une dernière fois. Envelopper dans du papier d'aluminium pour protéger de la lumière.
  2. Chargement des bactéries avec de la teinture
    1. Pellet et laver les 8 ml de la culture bactérienne milieu de la phase de journal comme décrit au point 2.2.1. Retirer le surnageant, remettre le culot dans 2 ml de PBS pour faire un "4x" suspension cellulaire.
    2. Ajouter 1 ml de la suspension cellulaire 4x 2x à l'Loading Buffer. Cela permettra d'avoir un volume final de 2 ml, et des concentrations finales de cellules 2x, 2x PowerLoad, 50 uM de colorant fluorescent, et 2x probénécide.
    3. Incuber dans un bain d'eau à 30 ° pendant 40 minutes, à l'abri de la lumière. NOTE: Le colorant est chargé dans les cellules bactériennes à la température inférieure de 30 ° C et en l'absence de n'importe quels substrats glycolytiques pour réduire au minimum l'efflux du colorant.
    4. WASH 1: Pellet les cellules par centrifugation à 2400 g pendant 10 min, retirer le surnageant de se débarrasser de l'excès de colorant, et remettre en suspension dans 4 ml de PBS contenant 2x probénécide unemM de glucose e 1 (à redynamiser les bactéries). LAVAGE 2, 3: Répétez l'étape 4.2.7 deux fois, avec remise en suspension finale dans 4 ml de PBS (pour une concentration finale de cellules 1x) 2x contenant du probénécide et 10 mM de glucose.
    5. Incuber à 37 ° C pendant 5 min. Cela permettra aux cellules pour exciter complètement et laisser le temps pour les estérases bactériennes pour cliver le groupe ester AM de l'BCECF intériorisé.
  3. Établissant la fluorescence de fond et dans la courbe d'étalonnage vivo
    1. Préchauffer la détection de fluorescence lecteur de plaque plaque de lecture à 37 ° C.
    2. Pour déterminer la fluorescence de fond, stériliser par filtration à environ 500 pi de la suspension bactérienne et chargé sous tension (de l'étape 4.2.7) pour éliminer les bactéries, et ajouter 200 ul de filtrat pour le puits de la plaque à 96 puits.
    3. Placer la plaque dans la détection de la fluorescence lecteur de plaques pour mesurer la fluorescence (excitation 490 nm / 530 nm pour l'émission"Valeur 1" et 440 nm d'excitation / émission 530 nm pour "Valeur 2") pendant 1 min. Cette fluorescence d'arrière-plan doit être soustrait avant le calcul des rapports à la fois pour la courbe d'étalonnage et les échantillons expérimentaux.
    4. Pour obtenir une courbe d'étalonnage in vivo, laver aliquotes de 500 ul des cellules chargées et alimentés à partir de l'étape 4.2.7 fois et remettre en suspension dans les tampons riches en potassium à des pH différents (allant de 6,5 à 8,0).
    5. Ajouter 20 uM nigéricine pour les échantillons s'équilibrer le pH intracellulaire des cellules au pH du tampon environnant et incuber à 37 ° C pendant 5 min. Ajouter 200 ul de tampon combinaisons de bactéries / de pH dans les puits d'une plaque à 96 puits.
    6. Placer la plaque dans la détection de la fluorescence lecteur de plaques pour mesurer la fluorescence pendant quelques minutes pour établir une valeur stable pour chaque puits. Exporter les lectures d'un programme d'analyse de données telles que Microsoft Excel.
    7. Après soustraction de la baLes valeurs de fluorescence de ckground, calculer le rapport des valeurs de fluorescence en divisant la valeur 1 par la valeur 2. Tracer les valeurs de rapport pour chaque tampon de pH pour créer la courbe d'étalonnage. (Une courbe d'étalonnage doit être généré pour chaque nouveau lot de cellules chargées, comme la quantité de colorant fluorescent qui est chargé dans les bactéries peut varier à chaque fois).
  4. Mesurer les changements de pH intracellulaire
    1. Pour chaque échantillon désiré, ajouter 200 ul de cellules chargées et sous tension (de l'étape 4.2.7) pour les puits d'une plaque de 96 puits.
    2. Placer la plaque dans la détection de la fluorescence lecteur de plaques et mesurer la fluorescence des échantillons toutes les 5 sec pendant 5 min.
    3. Éjecter la plaque et ajouter 10 uM CCCP pour un bien (sert de contrôle positif pour la diminution du pH intracellulaire) et l'agent expérimental (s) d'intérêt pour les autres puits. Pour comparer avec précision leurs effets au fil du temps, ajouter le CCCP et agents de choix dans le même temps en utilisant hpipette ultichannel.
    4. Remettre immédiatement la plaque à la plaque-lecteur et continuer à mesurer la fluorescence toutes les 5 sec pendant 10 minutes. En tant que contrôle supplémentaire, éjecter la plaque et ajouter 20 uM nigéricine à tous les échantillons s'équilibrer à la i pH de la bactérie pour le pH du tampon environnant, et de lire pendant 5 min.
    5. Après soustraction des valeurs de fluorescence d'arrière-plan, calculer les rapports de fluorescence pour chaque échantillon. Interpoler le pH i pour chaque lecture à partir de la courbe d'étalonnage.

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Representative Results

Pour toutes les expériences, il existe une série d'échantillons et les conditions présentes dans chaque puits. Ainsi, chaque tracé représente l'intensité de fluorescence d'une population entière de bactéries au cours du temps. Les résultats devraient être faciles à interpréter, avec une distinction claire entre la fluorescence des échantillons traités et que des témoins non traités. La cinétique et le degré de changement observé dans fluorescence pourraient fournir des informations sur le mécanisme possible et l'ampleur de l'événement surveillé.

Lors de l'exploration polarité de la membrane, les bactéries ont besoin d'être mis à incuber avec DiBAC pendant environ 40 min pour permettre l'équilibrage de la teinture au cours de la membrane, comme indiqué par la diminution constante et de nivellement subséquente de la fluorescence dans la Figure 1A avant le traitement. Comme le montre la figure 1B, PI ne nécessite pas l'équilibre, comme son signal fluorescent est stable tout au long de la première 40 minutes d'incubation, but sa présence avec DiBAC est utile de surveiller la rupture de la membrane en même temps que la polarité. La dépolarisation et la rupture de la bactérie est indiqué par une augmentation de l'intensité de fluorescence des deux colorants. D'autres agents capables de dépolarisation et la rupture, tels que des détergents (désoxycholate de sodium), 18 découpleurs, ou des ionophores (CCCP), peuvent être également ajoutés pour démontrer ces événements à l'aide de cette méthodologie.

Pour Fura-2/AM, PBFI / AM, et BCECF / AM, le rapport des deux signaux fluorescents est calculée, et une augmentation ou une diminution de ce rapport correspond à la concentration intracellulaire de Ca 2 + (figure 2), K + (Figure 3 ), et H + (figure 4), les concentrations, respectivement. Lors de l'addition de l'ionomycine ionophore de calcium, le flux de Ca 2 + dans la cellule provoquant une augmentation du rapport de fluorescence (figure 2). Ajout de valinomycine a l'effet inverse, provoquant K+ De s'écouler hors de la cellule et de réduire la concentration intracellulaire, qui est indiquée par une diminution du rapport de fluorescence (Figure 3). BCECF permet la mesure du pH intracellulaire en créant d'abord une courbe d'étalonnage (Figure 4A) en présence de différents tampons de pH connu. Une diminution du rapport de la fluorescence du colorant correspond à une diminution du pH, comme le montre la suite de l'addition ou de la nigéricine protonophores CCCP, qui fractionne le gradient de protons (Figure 4B).

Figure 1
Figure 1. Surveillance des perturbations membranaires. S. pneumoniae a été incubé avec (A) et DiBAC (B) PI simultanément pendant 40 min pour permettre l'équilibrage de DiBAC sur le membrane. A la fin de cette incubation (flèche), PBS (non traité) ou HAMLET (traité) a été ajouté et les échantillons ont été lus pendant une heure supplémentaire. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 2
Figure 2. Détection des changements dans les niveaux de calcium intracellulaire. Pneumocoques ont été chargés avec Fura-2/AM et traitée (flèche) avec du PBS (non traité) ou de l'ionomycine ionophore de calcium (témoin positif). Le rapport des valeurs de fluorescence est présenté. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 3 Figure 3. Détection des changements dans les taux de potassium intracellulaire. Pneumocoques ont été chargés avec PBFI / h et traitée (flèche) avec du PBS (non traité) ou la valinomycine ionophore de potassium (témoin positif). Le rapport des valeurs de fluorescence est présenté. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 4
Figure 4. Détection des changements dans les niveaux de protons intracellulaires. (A) Courbe standard pour l'étalonnage du pH intracellulaire. (B) Les pneumocoques ont été chargées avec le colorant sensible au pH BCECF-AM, et étaientlavé et remis en suspension dans du PBS + glucose. Après l'enregistrement de valeurs de référence, à la première flèche, PBS (noir), le CCCP de protonophore (100 uM), ou d'un hameau (100 pg / ml ou 6 uM), ont été ajoutés aux bactéries et la fluorescence a été mesurée au cours du temps. Lors de la deuxième flèche nigéricine (20 M) a été ajouté à dissiper complètement le gradient de protons transmembranaire de tous les échantillons. Cliquez ici pour agrandir l'image.

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Discussion

Malgré la limitation de cette taille présente de en utilisant des procédés classiques d'électrophysiologie pour détecter les changements de polarité et de l'intégrité de la membrane et des changements dans les concentrations d'ions à l'intérieur des bactéries, nous avons décrit une manière de mesurer ces événements dans S. pneumoniae en utilisant des colorants fluorescents. Nos protocoles sont les premiers de leur genre décrit pour le pneumocoque et l'un des rares décrits pour les espèces bactériennes en général. En utilisant un lecteur de plaques de détection de fluorescence, ces événements peuvent être mesurés dans de petits échantillons de volume de 200 ul de bactéries, avec la fluorescence détectée à partir de la population de bactéries individu au cours du temps. Les cinétiques et les changements d'intensité de fluorescence peuvent être utilisés pour déterminer qualitativement ce qui se passe à la membrane ou à l'intégrité de polarité, ou des niveaux de Ca2 +, K + ou H + à l'intérieur de la bactérie. Sur le plan quantitatif, les valeurs d'intensité de fluorescence peuvent aussi être utilisés pour calculer le degré de depolarization, la rupture, l'absorption de calcium, l'efflux de potassium, ou un changement de pH observées dans un échantillon par rapport à l'autre, fournissant des informations critiques sur un mécanisme d'intérêt. En outre, notre protocole devrait être utile en tant que point de départ pour le chargement d'autres colorants fluorescents AM, ce qui permet l'étude d'une variété d'autres événements cellulaires dans une variété d'espèces bactériennes. Nous avons déjà réussi à l'application de certaines de ces protocoles dans Staphylococcus aureus 21.

Lors de l'utilisation des colorants AM, largement le temps d'incubation est important pour le chargement de colorant et la réalisation de l'hydrolyse ultérieure nécessaire pour le colorant de répondre aux ions cibles à l'intérieur de la bactérie et produire des changements de fluorescence correspondant. La cinétique de chargement peuvent varier entre les souches bactériennes dues à plusieurs facteurs, y compris des différences dans l'architecture de la surface bactérienne (présence de la capsule, la fluidité de la membrane, la présence de pompes à efflux, etc.) Et dans la structure chimique of le colorant. Pour réaliser le chargement maximal de la souche bactérienne et le colorant d'intérêt, il existe plusieurs paramètres de notre protocole qui peut nécessiter modulation comprenant: durée d'incubation, la température d'incubation, la disponibilité des nutriments, PowerLoad concentration, et la concentration du probénécide. Pour obtenir chargement réussi, l'intensité du signal de fluorescence est moins important que de montrer que les contrôles positifs, tels que l'ajout d'ionophores, fournissent un signal dans la direction et / ou montrant la linéarité de la courbe d'étalonnage correct. Pour optimiser le chargement d'une augmentation de la concentration Probenicide PowerLoad et suivi d'un abaissement de la température pour éviter l'extrusion du colorant est préférable à l'augmentation de la concentration de colorant qui peut entraîner une coloration extracellulaire qui se confondre le signal. Lors du développement de nos protocoles, nous avons pu charger avec succès nos colorants d'intérêt à la fois le type sauvage encapsulé D39 souche pneumococcique et la souche non encapsulé R36A 25.Cependant, nous avons constaté que nous pourrions réaliser un chargement optimal, comme indiqué par des lectures fluorescentes conduisant à une augmentation des ratios utilisant R36A pour Fura-2 et PBFI expériences utilisant 37 ° C la température d'incubation, tandis qu'une température d'incubation inférieure couplée avec PowerLoad supérieur et concentrations probénécide a mieux fonctionné pour chargement de BCECF en D39. Bien que l'intensité du signal spécifique peut varier entre les expériences, la nature des mesures ratiométrique fourni les résultats avec une reproductibilité élevée et peu répandu.

Pour les mesures de fluorescence des échantillons, l'utilisation du logiciel accompagnant lecteurs de plaques les plus avancées permet des ajustements d'une variété de paramètres de détection, y compris la vitesse de détection, la sensibilité de détection, et de lire durée, pour n'en nommer que quelques-uns. Ceci permet au chercheur de trouver la sensibilité optimale pour la détection de l'événement particulier qui est surveillé. Pour une interprétation optimale des résultats, il est essentiel que les lignes de base stables de fluorLes courbes de escence et standards linéaire sont établis, comme il peut y avoir des variations inter-dosage de la quantité de colorant qui est présent, équilibrée au cours de la membrane, ou chargés dans les bactéries et hydrolyses. Laisser du temps pour l'équilibrage de colorant sur ​​la membrane bactérienne avant le traitement de tout type est particulièrement important lors de l'utilisation DiBAC 4 (3) pour permettre un niveau de fluorescence stabilisée avant le traitement. De plus, y compris toutes les commandes appropriées dans chaque analyse individuelle est indispensable pour une analyse précise des données, comme les additifs expérimentales qui sont introduites dans la suspension bactérienne à tester peuvent eux-mêmes une autofluorescence aux longueurs d'onde particulières de la détection ou peuvent non spécifique modifier la fluorescence de l' Indicateur de colorant par des interactions directes.

Nous reconnaissons quelques sujets de préoccupation potentiels associés aux méthodes que nous avons décrit ici. Contrairement à la carbocyanine colorant Dioc 2 (3), DiBAC 4 (3) est un colorant bisoxonol qui n'est pas quotientométrique, et bien que le colorant carbocyanine peut tenir compte des changements dans le volume des cellules, DiBAC 4 (3) ne peut pas. Ainsi, il peut y avoir des changements dans le niveau de fluorescence qui correspondent à des changements de volume de la cellule. Cependant, nous n'avons pas remarqué qu'il s'agit d'un problème important, comme le pneumocoque a une paroi cellulaire rigide qui ne permet pas de changements importants dans le volume sans rompre les bactéries. Pour examiner les flux ioniques bactériennes, la sensibilité des colorants sensibles aux ions peut varier en fonction de l'ion d'intérêt et le degré de variation de sa concentration. En outre, l'utilisation de colorants fluorescents est expérimentalement pas aussi directe d'un procédé tel que l'utilisation de radio-isotopes. Toutefois, en fonction de l'ion d'intérêt, l'examen de la fluorescence est une option beaucoup plus pratique lorsque l'on considère les deux limites financières et en matière de sécurité liés à l'utilisation de radio-isotopes. Ainsi, les méthodes décrites dans ce manuscrit fournissent approche nouvelle et cohérentees à mieux polarité de la membrane de l'étude, de l'intégrité, et les événements de transport et dans des systèmes bactériens.

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Disclosures

Les auteurs n'ont aucun intérêt financier concurrents à déclarer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la Fondation Bill et Melinda Gates (subvention 53 085), la Fondation JR Oishei, et l'American Lung Association (Grant RG-123721-N) à APH, et les NIH (NIDCD) bourse F31DC011218 à CAE.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Todd-Hewitt broth Bacto, BD Diagnostics 249240
Yeast Extract Bacto, BD Diagnostics 212750
Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2) Invitrogen (GIBCO)
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D5879 DMSO
DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol) Molecular Probes B-438
Propidium Iodide Sigma-Aldrich P4170 Make up in deionized water
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich
PowerLoad Molecular Probes P10020 100x concentrate
Probenecid Molecular Probes P36400 Make 100x stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial
Fura-2/AM Molecular Probes F1221 Special packaging (50 µg aliquots)
PBFI/AM Molecular Probes P1267 Special packaging (50 µg aliquots)
Nigericin Sigma-Aldrich N7143
KH2PO4 JT Baker 3246-01 monobasic
NaOH JT Baker 5565-01
K2HPO4 JT Baker 4012-01 dibasic
BCECF/AM Molecular Probes B1170 Special packaging (50 µg aliquots)
CCCP Sigma-Aldrich Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm, dissipating the electrical potential and the H+ gradient.
Culture tube  VWR 53283-802 Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass
Spectrophotometer Thermo Scientific Spectronic 20D+
15 ml Plastic conical tube Corning 430790
Clear 96-well polystyrene microtiter plate Fisher Scientific 12-565-501
Plate reader BioTek Synergy 2 Multi-Mode
Gen5 software BioTek Gen5™ Software

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References

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La surveillance des changements dans la membrane de polarité, Membrane intégrité, et intracellulaires d&#39;ions concentrations dans<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Utilisation des colorants fluorescents
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Clementi, E. A., Marks, L. R., Roche-Håkansson, H., Håkansson, A. P. Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (84), e51008, doi:10.3791/51008 (2014).

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