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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

झिल्ली Polarity, झिल्ली अखंडता, और intracellular आयन सांद्रता में निगरानी परिवर्तन Published: February 17, 2014 doi: 10.3791/51008
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3
1Department of Microbiology and Immunology, University at Buffalo, State University of New York, 2Witebsky Center for Microbial Pathogenesis and Immunology, University at Buffalo, State University of New York, 3New York State Center of Excellence in Bioinformatics and Life Sciences, University at Buffalo, State University of New York
* These authors contributed equally

Summary

Eukaryotes के लिए देखा है कि विपरीत, मुख्य रूप से अपने छोटे आकार के रूप में बैक्टीरिया में विस्तार झिल्ली विध्रुवण और आयन एकाग्रता परिवर्तन, माप मुश्किल के परंपरागत तरीकों में आता है कि पढ़ाई का एक कमी है. यहाँ, हम प्रतिदीप्ति तकनीक के उपयोग महत्वपूर्ण ग्राम पॉजिटिव रोगज़नक़ स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया में इस तरह की घटनाओं की निगरानी के लिए विस्तार प्रोटोकॉल.

Abstract

झिल्ली विध्रुवण और आयन अपशिष्टों के कारण गहराई से ऊर्जा और संकेत transductions सहित सेलुलर कार्यों, को प्रभावित करने की उनकी क्षमता को जैविक प्रणालियों में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है कि घटनाओं रहे हैं. इलेक्ट्रोड के उपयोग और पैच clamping सहित दोनों फ्लोरोसेंट और electrophysiological तरीकों,, अच्छी तरह से कोशिकाओं में इन घटनाओं को मापने के लिए विकसित किया गया है, सूक्ष्मजीवों में इसी तरह की घटनाओं को मापने के लिए कार्यप्रणाली को और अधिक जटिल के साथ संयोजन में उनके छोटे आकार दिया विकसित करने के लिए और अधिक चुनौतीपूर्ण साबित किया झिल्ली परिरक्षण जीवाणुओं की बाहरी सतह. स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया (pneumococcus) में मौत दीक्षा के हमारे अध्ययन के दौरान, हम ध्रुवता में परिवर्तन, अखंडता, और intracellular आयन सांद्रता सहित झिल्ली घटनाओं, की भूमिका को स्पष्ट करना चाहता था. साहित्य खोज, हम बहुत कुछ अध्ययनों कि मौजूद पाया. अन्य जांचकर्ताओं आयन फ्लू को मापने के लिए रेडियो आइसोटोप तेज या संतुलन नजर रखी थीXES और झिल्ली क्षमता और अधिकतर ग्राम नकारात्मक जीवों में पढ़ाई की एक सीमित संख्या, झिल्ली क्षमता को मापने के लिए carbocyanine या oxonol फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग कर, या की (AM) एस्टर संस्करणों सेल permeant acetoxymethyl साथ बैक्टीरिया लोड हो रहा है कुछ सफलता देखा था आयन के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट सूचक रंगों. इसलिए हम ग्राम पॉजिटिव जीव एस में झिल्ली क्षमता, टूटना, और आयन परिवहन मापने के लिए प्रोटोकॉल स्थापित और अनुकूलित निमोनिया. हम तरीकों बेहतर ratiometric रंगों का AM एस्टर साथ pneumococci लोड करने के रूप में क्रमश: झिल्ली विध्रुवण और टूटना उपाय के रूप में अच्छी तरह से करने के लिए बीआईएस oxonol डाई DiBAC 4 (3) और सेल impermeant डाई propidium आयोडाइड का उपयोग प्रोटोकॉल विकसित Fura-2, PBFI, और BCECF एक प्रतिदीप्ति पता लगाने प्लेट रीडर का उपयोग, सीए 2 +, + K, और क्रमशः एच +, के intracellular सांद्रता में परिवर्तन का पता लगाने के लिए. इन प्रोटोकॉल pneumococcus के लिए अपनी तरह का पहला हैंऔर इन रंगों के बहुमत किसी भी अन्य बैक्टीरियल प्रजातियों में इस्तेमाल नहीं किया गया है. हमारे प्रोटोकॉल एस के लिए अनुकूलित किया गया है निमोनिया, हम इन तरीकों अन्य बैक्टीरियल प्रजातियों में इसी तरह के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट शुरुआती बिंदु फार्म चाहिए.

Introduction

हमारी प्रयोगशाला ट्यूमर कोशिकाओं में apoptosis लाती है (ट्यूमर कोशिकाओं के लिए घातक मेड मानव अल्फा-lactalbumin के लिए) हेमलेट नामित मानव दूध से एक प्रोटीन लिपिड परिसर की पहचान की है, लेकिन यह भी बैक्टीरियल प्रजातियों 1,2 की एक किस्म मार करने में सक्षम है. विशेष रूप से संवेदनशील होना पाया गया है कि प्रजातियों सबसे बड़ी संवेदनशीलता और मौत 2,3 की एक apoptosis की तरह phenotype प्रदर्शित स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया (pneumococcus) के साथ, श्वसन तंत्र लक्ष्य है कि उन थे. झिल्ली विध्रुवण और विशिष्ट आयन परिवहन घटनाओं अच्छी तरह से वर्णित हैं और रेडियोधर्मी टीपीपी + आयनों और जे.सी. -1 और TMRE सहित फ्लोरोसेंट रंगों mitochondrial झिल्ली 3 के विध्रुवण प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, जहां mitochondria, में विशेष कोशिकाओं में apoptosis के दौरान महत्वपूर्ण घटनाओं -5. इस प्रकार, हम हम करने के लिए हमारे प्रयासों पर ध्यान केंद्रित के रूप में pneumococcus में इन झिल्ली से संबंधित सुविधाओं पर हेमलेट के प्रभाव के बारे में अधिक जानने की मांग कीप्रक्रिया में उपन्यास जीवाणुरोधी चिकित्सा या वैक्सीन उम्मीदवारों की पहचान करने के लिए महान क्षमता के साथ बैक्टीरिया में apoptosis की तरह phenotype के यंत्रवत घटकों की एक बेहतर समझ विकसित करना.

हमारे यंत्रवत अध्ययनों के लिए प्रोटोकॉल स्थापित करने की मांग में, हम यूकेरियोटिक प्रणालियों में अच्छी तरह से वर्णित पद्धति के विपरीत, बैक्टीरियल झिल्ली 6,7 के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और आयन परिवहन तंत्र का ब्यौरा बहुत कुछ प्रकाशित अध्ययन कर रहे हैं कि पता चला. यह मुख्य रूप से छोटे सूक्ष्मजीवों का आकार और उनकी सतह वास्तुकला, विशाल protoplasts का उपयोग करते हुए कुछ अध्ययनों मिश्रित सफलता के साथ प्रदर्शन किया गया है, हालांकि विशेष रूप से सेल की दीवार की उपस्थिति, कि, पैच clamping तरह पारंपरिक यूकेरियोटिक तरीकों के उपयोग के लिए झिल्ली की पहुंच को प्रतिबंधित करने के लिए जिम्मेदार ठहराया है 8,9. यह आदमी की आवश्यकता है, क्योंकि इन विशाल protoplasts साथ काम सबसे बैक्टीरियल प्रजातियों के लिए एक आदर्श या भी व्यावहारिक तरीका नहीं हैipulated बैक्टीरिया एक अप्राकृतिक और अजैव राज्य में, प्रदर्शन किया गया है कि जीवाणु झिल्ली polarity के सीमित अध्ययन मुख्य रूप से प्रवाह cytometry कार्यरत है और जाती है और oxonol फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग 10-16.

एक ही समय बिंदु पर एक जीवाणु से व्यक्तिगत प्रतिदीप्ति रीडिंग बटोरता है, जो प्रवाह cytometry के बजाय, हम समय के साथ एक 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में जीवाणु निलंबन की प्रतिदीप्ति तीव्रता का पता लगाने के लिए एक प्रतिदीप्ति पहचान प्लेट रीडर का उपयोग करने के लिए चुना है. यह बहुत अधिक सादगी के साथ विभिन्न बिंदुओं पर समय बैक्टीरिया की आबादी के इलाज और आसानी से, और लगातार प्रवाह cytometry का उपयोग को प्राप्त करने के लिए मुश्किल है जो समय की विस्तारित अवधि के लिए पूरी आबादी की प्रतिदीप्ति कैनेटीक्स नजर रखने के लिए सक्षम होना चाहिए. (Mitochondria के साथ प्रयोग के लिए उपर्युक्त उन सहित) क्षमता के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंगों की एक विस्तृत विविधता के परीक्षण के बाद, हम प्रयोग सर्वोत्तम तकनीकी और व्यावहारिक सफलता हासिल कीDiBAC 4 बुलाया बीआईएस oxonol डाई (3) (बीआईएस (1,3 dibutylbarbituric एसिड) trimethine oxonol) ध्रुवता में परिवर्तन की निगरानी करने के लिए.

हम भी यह बहुमूल्य समवर्ती propidium आयोडाइड (पीआई) का उपयोग झिल्ली की अखंडता में अवरोधों की निगरानी करने के लिए मिला. इस डाई न्यूक्लिक एसिड के लिए बाध्य करने पर fluoresces, लेकिन बैक्टीरियल झिल्ली की अखंडता यह रहते मृत धुंधला assays में मृत कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया लोकप्रिय घटक है, जिससे समझौता किया है जब ऐसा करने में सक्षम है. गड़बड़ी के अलावा, Sytox हरे और करने के लिए प्रो 1 कार्रवाई में समान हैं और पहले से तरीकों का पता लगाने 17 प्रवाह cytometry का उपयोग कुछ अध्ययनों में बैक्टीरिया के लिए इस्तेमाल किया गया है कि फ्लोरोसेंट रंगों हैं. हम कारण हमें किसी नमूने में DiBAC साथ समवर्ती अपने प्रतिदीप्ति की निगरानी करने की अनुमति दी है कि अपनी उत्तेजना तरंगदैर्ध्य को गड़बड़ी का उपयोग करने के लिए चुना है.

हमारे अध्ययन में, हम है कि पुरवा, साथ ही साथ जीवाणुनाशक गतिविधि के साथ एक अन्य संबंधित प्रोटीन लिपिड जटिल मनायाpneumococci 3,18,26 के इलाज पर दोनों रंगों के प्रतिदीप्ति में वृद्धि के संकेत के रूप में बैक्टीरियल झिल्ली के ELOA, प्रेरित विध्रुवण और टूटना के रूप में जाना जाता है. दोनों परिसरों के लिए, हम DiBAC 4 की प्रतिदीप्ति तीव्रता (3) विध्रुवण संबंध विच्छेद करने से पहले हुई यह दर्शाता है कि पिछले गड़बड़ी की तीव्रता में वृद्धि करने के लिए वृद्धि हुई है और, देखा गया है कि इसलिए, हमारे जीवाणुनाशक प्रोटीन लिपिड परिसरों के द्वारा प्रेरित एक विशिष्ट घटना ब्याज. यह भेद झिल्ली के फटने के रूप में खुद को अविशिष्ट विध्रुवण पैदा कर सकता है, बनाने के लिए महत्वपूर्ण है. DiBAC 4 दोनों को मापने और विश्लेषण (3) और पीआई प्रतिदीप्ति कैनेटीक्स समवर्ती हमें fluorometry उपयोग करने के बजाय प्रवाह cytometry का एक अतिरिक्त लाभ है जो दो झिल्ली घटनाओं के बीच इस संबंध की जांच करने की अनुमति दी.

बैक्टीरियल आयन प्रवाह पर नजर रखने के लिए, के तेज मापने सहित, radioisotopes का उपयोग के साथ पिछले कुछ सफलता कर दिया गया है45 सीए हम भी अपने हाल के अध्ययनों से 18, 21 में इस्तेमाल किया है जो pneumococcus 19,20, में 2. हालांकि, इन रेडियोधर्मी आयनों के साथ काम कर रहे कई कमियां हैं. वे महंगा हो सकता है, समय लेने वाली है, और गंदा, और भी ब्याज की आइसोटोप के आधार पर, नुकसान पहुँचाने की प्रयोग का प्रदर्शन व्यक्ति को बेनकाब कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, यह समय के साथ तेजी से बदलाव पर नजर रखने के लिए मुश्किल है. इस प्रकार, हम आयन के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट सूचक रंगों का acetoxymethyl (AM) एस्टर संस्करणों है कि रोजगार माप की एक वैकल्पिक विधि की ओर मुड़े. वैसे, सूचक डाई का आरोप लगाया है और आसानी से झिल्ली के माध्यम से पारित नहीं होता है, लेकिन lipophilic एस्टर समूह के अलावा के साथ, अब uncharged अणु जीवाणु की झिल्ली के माध्यम से पारित कर सकते हैं. इंटीरियर में प्रवेश करने पर, जीवाणु esterases आरोप लगाया फिर, काफी सेल से बाहर निकलने के लिए अपनी क्षमता को धीमा और अनुमति डाई टी सेल के अंदर मुक्त डाई छोड़ने, एस्टर समूह फोड़ना औरओ समय के साथ अंदर जमा. हालांकि, इन एस्टर रंगों का उपयोग केवल लोड हो रहा है, का पता लगाने, और सफलता के अलग तरीकों के साथ, intracellular सीए 2 + 22-24 और एच + 16 में परिवर्तन का पता लगाने के लिए कुछ बैक्टीरियल प्रजातियों में वर्णित किया गया है.

Intracellular सीए में परिवर्तन की निगरानी करने की इच्छा के साथ 2 और एस में भी कश्मीर + और ​​एच + स्तर निमोनिया हेमलेट और अन्य यौगिकों के साथ उपचार करने पर, हम सफलतापूर्वक कुशलतापूर्वक बैक्टीरियल कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट सूचक रंगों लोड करने के लिए प्रोटोकॉल बनाया. आयनों ट्रांसपोर्टरों और PowerLoad, लदान क्षमता बढ़ जाती है कि जीवन टेक्नोलॉजीज से एक मालिकाना यौगिक अवरुद्ध करके डाई प्रतिधारण बढ़ जाती है कि दोनों प्रोबेनेसिड आवश्यक बैक्टीरिया में प्रभावी लोड हो रहा है. (+ K का पता लगाने) Fura-2/AM (सीए 2 + का पता लगाने), PBFI / हूँ, और BCECF / AM (एच + का पता लगाने) सफलतापूर्वक unencapsulated और समझाया दोनों न्यूमोकोकल सेंट में भरी हुई थीएक प्रतिदीप्ति पहचान प्लेट पाठक 18, 21 का उपयोग (कश्मीर + uncoupler) और CCCP (एच + uncoupler) valinomycin ऐसे ionomycin (सीए 2 + uncoupler) के रूप में ionophores, के अलावा के बाद परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति पैटर्न की माप सक्षम करने से बारिश.

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Protocol

1. बैक्टीरियल संस्कृतियों की तैयारी

  1. प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए संस्कृति के बढ़ते
    1. एक 37 डिग्री सेल्सियस ताप ब्लॉक में, एस के एक जमे हुए शेयर शीशी पिघलना निमोनिया और ताजा के 9 मिलीलीटर के लिए अपनी सामग्री जोड़ने के लिए, एक गिलास संस्कृति ट्यूब में 10 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए 0.5% खमीर निकालने (तेरा) के साथ टोड-हेविट शोरबा prewarmed.
    2. संस्कृति के मध्य लॉग चरण (एबीएस 600nm ≈ 0.5-0.6) तक पहुँच जाता है जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रुप से सेते हैं.

2. झिल्ली विध्रुवण और टूटना का पता लगा

  1. तैयारी अभिकर्मकों
    1. DiBAC 4 के एक 50 माइक्रोन शेयर (3) 100% DMSO में, और DDH 2 ओ में गड़बड़ी की 2 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक तैयार DiBAC 4 (3) के शेयर में कम से कम 6 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है. गड़बड़ी स्टॉक कम से कम 6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है.
    2. प्रकाश से बचाने के लिए पन्नी में शेयरों लपेटें.
  2. लदानबैक्टीरिया
    1. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 2400 XG पर centrifugation द्वारा कदम 1.2.2 से बैक्टीरियल कोशिकाओं गोली और 2,400 XG पर फिर 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस), और अपकेंद्रित्र के 10 एमएल में गोली resuspending, सतह पर तैरनेवाला हटाने के द्वारा दो बार धोना 10 मिनट के लिए.
    2. मूल मात्रा पीबीएस में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली निकालें. इस मिलीलीटर प्रति बैक्टीरिया के लगभग 10 8 कॉलोनी के गठन इकाइयों के लिए उपलब्ध कराएगा. धोया कोशिकाओं (5 नमूने लिए पर्याप्त) 1 मिलीलीटर निकालें और एक microcentrifuge ट्यूब में जगह है.
    3. इन कोशिकाओं के लिए, 25 मिमी ग्लूकोज की एक अंतिम एकाग्रता के लिए ग्लूकोज की एक 1 एम फिल्टर निष्फल शेयर समाधान (DDH 2 ओ में तैयार और एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर्ड) के 25 μl जोड़ने के लिए, और एक 37 डिग्री सेल्सियस ताप ब्लॉक में सेते पंद्रह मिनट के लिए. नोट: यह सब एटीपी निर्भर झिल्ली चैनलों और सेलुलर घटकों के लिए ऊर्जा प्रदान करता है. इस चरण के लिए आवश्यकता के प्रयोग पर निर्भर करते हुए भिन्न हो सकते हैं.
    4. 50 माइक्रोन DiBAC 4 (3) के शेयर के 5 μl और 2 मिलीग्राम / एमएल पीआई स्टॉक के 10 μl जोड़ें. यह क्रमश: अंतिम 250 एनएम की सांद्रता और 20 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर के लिए प्रदान करता है. ऊपर pipetting द्वारा और कई बार नीचे अच्छी तरह से मिलाएं. एक स्पष्ट 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक नमूने अच्छी तरह से करने के लिए इस सेल निलंबन के 200 μl जोड़ें.
  3. प्रतिदीप्ति का पता लगाने के
    1. एक prewarmed (37 डिग्री सेल्सियस) प्रतिदीप्ति पहचान प्लेट रीडर में जगह थाली.
    2. उपयुक्त फिल्टर DiBAC 4 (3) (490 एनएम उत्तेजना, 516 एनएम उत्सर्जन) और पीआई (535 एनएम उत्तेजना, 617 एनएम उत्सर्जन) का पता लगाने के लिए जगह में हैं सुनिश्चित करें.
    3. पढ़ने स्थिर जब तक (3) झिल्ली से अधिक है, के बारे में 30-40 मिनट के लिए हर मिनट प्रतिदीप्ति माप लेने के लिए पाठक सेट, या DiBAC 4 का संतुलन (और समवर्ती की निगरानी) के लिए अनुमति देने के लिए, यह एक "pretreatment" पढ़ने के रूप में कार्य करता है.
    4. थाली निकालें और चुनाव की प्रयोगात्मक एजेंट जोड़ने और immediately DiBAC 4 समय के वांछित लंबाई के लिए (3) और पीआई प्रतिदीप्ति निगरानी जारी रखने के लिए पाठक में वापस प्लेट रखें. एक multichannel विंदुक का उपयोग, एक ही बार में कई नमूने के इलाज के सभी कुओं के लिए एक साथ एजेंट को जोड़ने के लिए सहायक हो सकता है.
    5. Microsoft एक्सेल जैसे एक डेटा विश्लेषण कार्यक्रम के लिए रीडिंग निर्यात करें. झिल्ली विध्रुवण और टूटना का मूल्यांकन करने के लिए समय के साथ प्लॉट प्रतिदीप्ति. DiBAC और गड़बड़ी की बढ़ती प्रतिदीप्ति विध्रुवण और टूटना उत्पन्न कर रहे हैं कि इंगित करता है.

3. Intracellular सीए 2 + या + K सांद्रता में परिवर्तन का पता लगाने

  1. तैयारी अभिकर्मकों और लदान बफर
    1. निम्नलिखित अभिकर्मकों तैयार: आयन के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई के 5 मिमी शेयर (Fura-2/AM या PBFI / हूँ, डाई की 50 ग्राम युक्त ट्यूब DMSO की उचित मात्रा में जोड़ने), "100x" प्रोबेनेसिड (1 जोड़ें एक 77 मिलीग्राम शीशी पीबीएस के मिलीलीटर). solubilizedरंगों -20 डिग्री सेल्सियस बार में जमे हुए हैं और प्रोबेनेसिड 6 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर समाधान में स्थिर है, जबकि 3 महीने के लिए समाधान में स्थिर किया जा सकता है.
    2. इस प्रकार के रूप 2x बफर लोडिंग के 1 मिलीलीटर की तैयारी: एक 15 मिलीलीटर की प्लास्टिक शंक्वाकार ट्यूब के नीचे में, 5 मिमी आयन के 2 μl द्वारा पीछा किया (6 माह के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर) 100x PowerLoad ध्यान केंद्रित करने के 20 μl, बांटना सीधे PowerLoad में संवेदनशील डाई. भंवर संक्षिप्त मिश्रण करने के लिए. 100x प्रोबेनेसिड के 20 μl द्वारा पीछा पीबीएस के 960 μl जोड़ें. मिश्रण एक अंतिम समय भंवर. प्रकाश से बचाने के लिए पन्नी में लपेटें.
  2. डाई के साथ बैक्टीरिया लोड हो रहा है
    1. गोली और 2.2.1 में वर्णित के रूप में मध्य लॉग चरण जीवाणु संस्कृति धो लो. एक "2x" सेल निलंबन बनाने के लिए पीबीएस के 5 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली निकालें.
    2. 2x लोड हो रहा है बफर करने के लिए 2x सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर जोड़ें. यह एक 2 एमएल के अंतिम मात्रा और अंतिम concentr के लिए प्रदान करेगा1x PowerLoad, 5 माइक्रोन फ्लोरोसेंट रंजक, और 1x प्रोबेनेसिड की ations. नोट: माप के लिए प्रत्येक नमूना अच्छी तरह से 200 μl में शामिल होंगे, क्योंकि यह निलंबन 10 नमूने लिए पर्याप्त मात्रा में हैं.
    3. प्रकाश से सुरक्षित 75 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते हैं. नोट: डाई किसी भी ग्लाइकोलाइटिक substrates के अभाव में और डाई की तपका कम करने के लिए प्रोबेनेसिड की उपस्थिति में बैक्टीरियल कोशिकाओं में भरी हुई है.
    4. धोने 1: 10 मिनट के लिए 2400 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं के सतह पर तैरनेवाला निकालें, और 2 मिलीलीटर पीबीएस में Resuspend 1x प्रोबेनेसिड युक्त. धो 2, 3: दोहराएँ कदम 3.2.4 2x. एक और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. यह जीवाणु esterases के लिए समय दूर भाँति फ्लोरोसेंट रंगों से हूँ एस्टर समूह hydrolyze के लिए अनुमति देगा.
    5. धोने 4: 10 मिनट के लिए 2400 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं के सतह पर तैरनेवाला हटाने, और resuspend 1x प्रोबेनेसिड युक्त पीबीएस के 2 मिलीलीटर में. नोट: experime पर निर्भर करता हैNT, ग्लूकोज फिर से energize बैक्टीरिया को यहाँ वापस जोड़ा जा सकता है.
  3. प्रतिदीप्ति का पता लगाने के
    1. 37 डिग्री सेल्सियस के प्रतिदीप्ति पहचान प्लेट रीडर प्लेट रीडर Prewarm
    2. प्रत्येक वांछित नमूना के लिए, एक 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं के लिए (कदम 3.2.8 से) लोड कोशिकाओं के 200 μl जोड़ें. (एक समय में एक अच्छी तरह / नमूना के लिए पूरा करने के लिए निम्न चरण).
    3. पर ("मान 1 'और' मान 2" के लिए 380 एनएम उत्तेजना / 510 एनएम उत्सर्जन के लिए 340 एनएम उत्तेजना / 510 एनएम उत्सर्जन) प्रतिदीप्ति मापने के लिए प्रतिदीप्ति पहचान प्लेट रीडर में एक अच्छी तरह से, जगह प्लेट के लिए पढ़ना एक आधारभूत स्थापित करने के लिए एक मिनट के लिए हर सेकंड.
    4. , थाली निकालें (लगभग 5 μl की एक छोटी मात्रा में) है कि अच्छी तरह से करने के लिए पसंद का इलाज जोड़ने, जल्दी विंदुक और एक बार कुछ नीचे मिश्रण करने के लिए, और तुरंत वांछित लिए हर सेकंड पढ़ने के लिए प्रतिदीप्ति पहचान प्लेट रीडर में वापस जगह समय की लंबाई. (यदि मेंप्लेट रीडर के साथ जुड़े jectors) ये भी seamlessly पढ़ना बंद करो और प्लेट बेदखल करने के लिए आवश्यकता को नष्ट करने, वांछित उपचार जोड़ने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, उपलब्ध हैं.
    5. Microsoft एक्सेल जैसे एक डेटा विश्लेषण कार्यक्रम के लिए रीडिंग निर्यात करें. मूल्य 2 से मूल्य 1 विभाजित करके प्रत्येक समय बिंदु के लिए प्रतिदीप्ति मूल्यों के अनुपात की गणना, और एक ग्राफ पर अनुपात मूल्यों साजिश है.

4. Intracellular पीएच में पता लगाने के परिवर्तन

  1. तैयारी अभिकर्मकों और अंशांकन बफ़र्स
    1. निम्नलिखित अभिकर्मकों तैयार: BCECF / बजे से 5 मिमी शेयर (. डाई की 50 ग्राम युक्त ट्यूब DMSO की उचित मात्रा में करें इस शेयर में 3 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है); 100x प्रोबेनेसिड (1 मिलीलीटर का जोड़ पीबीएस एक 77 मिलीग्राम शीशी);. इथेनॉल में nigericin की 1 मिमी शेयर तैयारी आसपास बफर का पीएच के लिए कक्षों की (intracellular पीएच (पीएच मैं संतुलित करने के लिए आवश्यक) इस शेयर की है6 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस) पर तालिका;. DMSO (प्रोटॉन मकसद बल अलग करना protonophore में कार्बोनिल साइनाइड 3 chlorophenylhydrazone (CCCP) की 0.5 मिमी शेयर इस शेयर में 6 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है)
    2. 135 मिमी के.एच. 2 पीओ 4/20 मिमी NaOH (समाक्षारीय) और 110 मिमी कश्मीर 2 HPO 4/20 मिमी NaOH (द्विक्षारकीय): निम्नलिखित उच्च पोटेशियम बफ़र्स की 10 मिलीलीटर की तैयारी. तक एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर बाँझ. (इन बफ़र्स उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है).
    3. 6.5-8.0 लेकर कम से कम 5-6 पीएच मान के साथ उच्च पोटेशियम बफ़र्स बनाने के लिए आवश्यक अनुपात में उच्च पोटेशियम बफ़र्स मिलाएं.
    4. इस प्रकार के रूप 2x बफर लोडिंग के 1 मिलीलीटर की तैयारी: एक 15 मिलीलीटर की प्लास्टिक शंक्वाकार ट्यूब के नीचे में, सीधे PowerLoad में 5 मिमी आयन के प्रति संवेदनशील डाई के 20 μl द्वारा पीछा 100x PowerLoad के 40 μl, बांटना. भंवर संक्षिप्त मिश्रण करने के लिए. 100x प्रोबेनेसिड के 40 μl द्वारा पीछा पीबीएस के 900 μl जोड़ें. Vortपूर्व मिश्रण एक अंतिम समय. प्रकाश से बचाने के लिए पन्नी में लपेटें.
  2. डाई के साथ बैक्टीरिया लोड हो रहा है
    1. गोली और 2.2.1 में वर्णित के रूप में मध्य लॉग चरण जीवाणु संस्कृति के 8 एमएल धो लो. एक "4x" सेल निलंबन बनाने के लिए पीबीएस के 2 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला, resuspend गोली निकालें.
    2. 2x लोड हो रहा है बफर करने के लिए 4x सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर जोड़ें. यह एक 2 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा, और 2x कोशिकाओं के अंतिम सांद्रता, 2x PowerLoad, 50 माइक्रोन फ्लोरोसेंट रंजक, और 2x प्रोबेनेसिड के लिए प्रदान करेगा.
    3. प्रकाश से सुरक्षित 40 मिनट के लिए एक 30 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते हैं. नोट: डाई 30 डिग्री सेल्सियस के तापमान कम और डाई की तपका कम करने के लिए किसी भी ग्लाइकोलाइटिक substrates के अभाव में बैक्टीरियल कोशिकाओं में भरी हुई है.
    4. धोने 1: गोली 10 मिनट के लिए 2400 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं, अतिरिक्त रंग से छुटकारा पाने के लिए सतह पर तैरनेवाला हटाने, और 4 मिलीलीटर पीबीएस में Resuspend 2x प्रोबेनेसिड एक युक्तएन डी 1 मिमी ग्लूकोज (बैक्टीरिया reenergize के लिए). धो 2, 3: 2x प्रोबेनेसिड और 10 मिमी ग्लूकोज युक्त (1x कोशिकाओं के अंतिम एकाग्रता के लिए) 4 मिलीलीटर पीबीएस में अंतिम मेजबान के साथ दो बार दोहराएँ कदम 4.2.7,.
    5. 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. यह कोशिकाओं को पूरी तरह energize और दूर भाँति BCECF से हूँ एस्टर समूह फोड़ना बैक्टीरियल esterases के लिए समय की अनुमति के लिए अनुमति देगा.
  3. पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति की स्थापना और इन विवो अंशांकन वक्र में
    1. 37 डिग्री सेल्सियस के प्रतिदीप्ति पहचान प्लेट रीडर प्लेट रीडर Prewarm
    2. पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का निर्धारण करने के लिए, बैक्टीरिया को दूर करने के लिए (कदम 4.2.7 से) भरा हुआ है और सक्रिय जीवाणु निलंबन के बारे में 500 μl फिल्टर बाँझ, और 96 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से करने के लिए छानना के 200 μl जोड़ें.
    3. (के लिए 490 एनएम उत्तेजना / 530 एनएम उत्सर्जन प्रतिदीप्ति मापने के लिए प्रतिदीप्ति पहचान प्लेट रीडर में थाली प्लेस"मान 1" और 1 मिनट के लिए "मूल्य 2") के लिए 440 एनएम उत्तेजना / 530 एनएम उत्सर्जन. इस पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति अंशांकन वक्र और प्रयोगात्मक नमूने दोनों के लिए अनुपात की गणना से पहले घटा दिया जाना चाहिए.
    4. एक Vivo में अंशांकन वक्र प्राप्त करने के लिए, (6.5-8.0) लेकर अलग पीएच मान पर उच्च पोटेशियम बफ़र्स में एक बार और resuspend कदम 4.2.7 से भरी हुई है और सक्रिय कोशिकाओं के 500 μl aliquots धो लो.
    5. आसपास बफर का पीएच को कोशिकाओं के intracellular पीएच संतुलित करना और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते नमूने के 20 माइक्रोन nigericin जोड़ें. एक 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं के लिए बैक्टीरिया / पीएच बफर संयोजन के 200 μl जोड़ें.
    6. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए एक स्थिर पढ़ने स्थापित करने के लिए कुछ मिनट के लिए प्रतिदीप्ति मापने के लिए प्रतिदीप्ति पहचान प्लेट रीडर में थाली प्लेस. Microsoft एक्सेल जैसे एक डेटा विश्लेषण कार्यक्रम के लिए रीडिंग निर्यात करें.
    7. बीए घटाकर बादckground प्रतिदीप्ति मान, मान 2 से मूल्य 1 विभाजित करके प्रतिदीप्ति मूल्यों के अनुपात की गणना. अंशांकन वक्र बनाने के लिए प्रत्येक पीएच बफर के लिए अनुपात मूल्यों प्लॉट. (बैक्टीरिया में भरी हुई है कि फ्लोरोसेंट रंग की राशि हर बार भिन्न हो सकते हैं के रूप में एक अंशांकन वक्र, लोड कोशिकाओं के हर नए बैच के लिए उत्पन्न किया जाना चाहिए).
  4. Intracellular पीएच में मापने परिवर्तन
    1. प्रत्येक वांछित नमूना के लिए, एक 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं के लिए (कदम 4.2.7 से) भरा हुआ है और सक्रिय कोशिकाओं के 200 μl जोड़ें.
    2. प्रतिदीप्ति पहचान प्लेट रीडर में थाली प्लेस और 5 मिनट के लिए हर 5 सेकंड के नमूनों की प्रतिदीप्ति उपाय.
    3. थाली निकालें और एक अच्छी तरह से (intracellular पीएच कम करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है) और अन्य कुओं के लिए ब्याज की प्रयोगात्मक एजेंट (एस) को 10 माइक्रोन CCCP जोड़ें. सही समय पर उनके प्रभाव की तुलना AM उपयोग कर एक ही समय में CCCP और पसंद के एजेंटों को जोड़ने के लिएultichannel पिपेट.
    4. तुरंत प्लेट पाठक को थाली लौटने और प्रतिदीप्ति 10 मिनट के लिए हर 5 सेकंड मापने जारी है. एक अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में, प्लेट बेदखल और आसपास बफर का पीएच को बैक्टीरिया का पीएच मैं संतुलित करने के लिए सभी नमूनों को 20 माइक्रोन Nigericin जोड़ने, और 5 मिनट के लिए पढ़ें.
    5. पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति मूल्यों घटाने के बाद प्रत्येक नमूने के लिए प्रतिदीप्ति के अनुपात की गणना. अंशांकन वक्र से प्रत्येक पढ़ने के लिए पीएच मैं बैठाना.

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Representative Results

सभी प्रयोगों के लिए, एक नमूना और प्रत्येक कुएं में वर्तमान परिस्थितियों के सेट है. इस प्रकार, प्रत्येक ट्रेसिंग समय के साथ जीवाणुओं की एक पूरी आबादी की प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है. परिणाम इलाज के नमूने और अनुपचारित नियंत्रण की कि प्रतिदीप्ति के बीच एक स्पष्ट अंतर के साथ, आसानी से व्याख्या की जानी चाहिए. प्रतिदीप्ति में एक मनाया परिवर्तन के कैनेटीक्स और डिग्री नजर रखी जा रही घटना के संभावित तंत्र और सीमा के बारे में जानकारी प्रदान कर सकता है.

झिल्ली ध्रुवता की खोज करते हैं, बैक्टीरिया उपचार करने से पहले लगातार कमी और चित्रा 1 ए में प्रतिदीप्ति के बाद लेवलिंग से संकेत के रूप में, झिल्ली पर डाई के संतुलन के लिए अनुमति देने के बारे में 40 मिनट के लिए DiBAC साथ incubated करने की आवश्यकता है. चित्रा 1 बी में प्रदर्शन के रूप में अपनी फ्लोरोसेंट संकेत पहले 40 मिनट ऊष्मायन, बू भर में स्थिर है, के रूप में गड़बड़ी, संतुलन की आवश्यकता नहीं हैDiBAC के साथ अपनी उपस्थिति टी polarity के साथ समवर्ती झिल्ली टूटना नजर रखने के लिए उपयोगी है. विध्रुवण और बैक्टीरिया का टूटना दोनों रंगों के प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि के संकेत है. ऐसे डिटर्जेंट (सोडियम deoxycholate 18), uncouplers, या ionophores (CCCP) के रूप में विध्रुवण और टूटना करने में सक्षम अन्य एजेंटों ने भी इस पद्धति का उपयोग कर इन घटनाओं को प्रदर्शित करने के लिए जोड़ा जा जा सकता है.

Fura-2/AM, PBFI / हूँ, और BCECF / हूं, दो फ्लोरोसेंट संकेतों के अनुपात की गणना है, और इस अनुपात में वृद्धि या कमी intracellular सीए 2 + (चित्रा 2) से मेल खाती है, कश्मीर + (चित्रा 3 ), और एच + क्रमशः (चित्रा 4) सांद्रता. कैल्शियम ionophore ionomycin के अलावा पर, सीए 2 + प्रतिदीप्ति अनुपात में वृद्धि हुई है (चित्रा 2) के कारण सेल में बहती है. Valinomycin के अलावा कश्मीर के कारण विपरीत प्रभाव पड़ता है+ सेल के बाहर प्रवाह और प्रतिदीप्ति अनुपात में कमी (चित्रा 3) ने संकेत दिया है जो intracellular एकाग्रता में कमी. BCECF पहली ज्ञात पीएच के विभिन्न बफ़र्स की उपस्थिति में एक अंशांकन वक्र (चित्रा -4 ए) बनाकर intracellular पीएच की माप के लिए अनुमति देता है. प्रोटॉन ढाल (चित्रा 4 बी) गिर जो protonophores CCCP या nigericin, के अलावा निम्नलिखित के रूप में देखा डाई प्रतिदीप्ति अनुपात में कमी, पीएच में कमी से मेल खाती है.

चित्रा 1
चित्रा 1. झिल्ली perturbations निगरानी. एस 40 मिनट मीटर से अधिक DiBAC के संतुलन के लिए अनुमति देने के लिए निमोनिया एक साथ (ए) DiBAC और (बी) पीआई के साथ incubated थाembrane. इस ऊष्मायन (तीर) के अंत में, पीबीएस (इलाज) या हेमलेट (इलाज) जोड़ा गया है और नमूनों एक अतिरिक्त घंटे के लिए पढ़ रहे थे. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. Intracellular कैल्शियम के स्तर में परिवर्तन का पता लगाने. Pneumococci Fura-2/AM साथ भरी हुई है और (इलाज) पीबीएस या कैल्शियम ionophore ionomycin (सकारात्मक नियंत्रण) के साथ (तीर) इलाज किया गया. प्रतिदीप्ति मूल्यों के अनुपात में प्रस्तुत किया है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3 चित्रा 3. Intracellular पोटेशियम के स्तर में परिवर्तन का पता लगाने. Pneumococci PBFI / पूर्वाह्न साथ भरी हुई है और पीबीएस (इलाज) या पोटेशियम ionophore valinomycin (सकारात्मक नियंत्रण) के साथ (तीर) इलाज किया गया. प्रतिदीप्ति मूल्यों के अनुपात में प्रस्तुत किया है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. Intracellular प्रोटॉन के स्तर में परिवर्तन का पता लगाने. Intracellular पीएच अंशांकन के लिए (ए) मानक वक्र. (बी) pneumococci पीएच संवेदनशील डाई BCECF-AM के साथ भरी हुई है, और थेधोया और पीबीएस + ग्लूकोज में resuspended. आधारभूत रीडिंग दर्ज करने के बाद पहले तीर पर, पीबीएस (काला), protonophore CCCP (100 माइक्रोन), या हेमलेट (100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर या 6 माइक्रोन), बैक्टीरिया को जोड़ा गया था और प्रतिदीप्ति समय के साथ मापा गया था. दूसरा तीर nigericin पर (20 ​​माइक्रोन) पूरी तरह से नमूने के सभी के transmembrane प्रोटॉन ढाल फैलने के लिए जोड़ा गया है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

आकार polarity और झिल्ली और बैक्टीरिया के भीतर आयन सांद्रता में परिवर्तन की अखंडता में परिवर्तन का पता लगाने के लिए क्लासिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी तरीकों का उपयोग कर के लिए प्रस्तुत करता है कि सीमा के बावजूद, हम एस में इन घटनाओं को मापने के लिए एक तरह से वर्णित है निमोनिया फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग कर. हमारे प्रोटोकॉल pneumococcus और सामान्य में बैक्टीरियल प्रजातियों के लिए वर्णित कुछ में से एक के लिए वर्णित अपनी तरह का पहला है. एक प्रतिदीप्ति पहचान प्लेट रीडर का उपयोग करके, इन घटनाओं के समय के साथ बैक्टीरिया के व्यक्तिगत आबादी से पता चला प्रतिदीप्ति साथ, बैक्टीरिया के छोटे, 200 μl मात्रा नमूनों में मापा जा सकता है. प्रतिदीप्ति तीव्रता में कैनेटीक्स और परिवर्तन गुणात्मक ध्रुवता या अखंडता झिल्ली क्या हो रहा है यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या सीए 2 +, + K, या बैक्टीरिया के भीतर एच + का स्तर. मात्रात्मक बोल, प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों को भी रवानगी की डिग्री की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैolarization, टूटना, कैल्शियम तेज, पोटेशियम तपका, या पीएच परिवर्तन रुचि का एक तंत्र के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करने, एक अन्य की तुलना में एक नमूने में मनाया. इसके अतिरिक्त, हमारे प्रोटोकॉल बैक्टीरियल प्रजातियों में से एक किस्म में अन्य सेलुलर घटनाओं की एक किस्म के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, अन्य AM फ्लोरोसेंट रंगों लोड करने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में उपयोगी होना चाहिए. हम पहले से ही Staphylococcus aureus 21 में इन प्रोटोकॉल से कुछ को लागू करने में सफल रहे हैं.

AM रंगों का उपयोग करते हैं, पर्याप्त ऊष्मायन समय डाई लोड हो रहा है और बैक्टीरिया के भीतर लक्ष्य आयनों का जवाब और इसी प्रतिदीप्ति परिवर्तन उपज के लिए डाई के लिए आवश्यक बाद हाइड्रोलिसिस को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. लोड हो रहा है कैनेटीक्स कारण बैक्टीरियल सतह वास्तुकला में मतभेद (तपका पंप के कैप्सूल उपस्थिति, झिल्ली तरलता, उपस्थिति, आदि.) सहित कई कारकों को और रासायनिक संरचना ओ में जीवाणु उपभेदों के बीच भिन्न हो सकते हैंच डाई. ऊष्मायन अवधि, ऊष्मायन तापमान, पोषक तत्वों की उपलब्धता, PowerLoad एकाग्रता, और प्रोबेनेसिड एकाग्रता: बैक्टीरियल तनाव और ब्याज की डाई के लिए अधिक से अधिक लदान को प्राप्त करने के लिए, सहित मॉडुलन की आवश्यकता हो सकती है कि हमारे प्रोटोकॉल के कई मापदंडों हैं. सफल लदान प्राप्त करने के लिए, प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता ऐसे ionophores के अतिरिक्त के रूप में सकारात्मक नियंत्रण, सही दिशा और / या अंशांकन वक्र में linearity दिखा में एक संकेत प्रदान दिखा रहा है कि कम से कम महत्वपूर्ण है. एक डाई के बाहर निकालना से बचने के लिए तापमान को कम करने के द्वारा पीछा एक PowerLoad में वृद्धि और Probenicide एकाग्रता लोड करने का अनुकूलन करने के लिए संकेत उलझाना होगा कि बाह्य धुंधला में हो सकता है कि डाई एकाग्रता बढ़ाने के लिए बेहतर है. हमारे प्रोटोकॉल के विकास के दौरान, हम सफलतापूर्वक जंगली प्रकार समझाया न्यूमोकोकल तनाव D39 और unencapsulated तनाव R36A 25 दोनों में हमारे हित के रंगों को लोड करने में सक्षम थे.हालांकि, हम 37 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन तापमान का उपयोग Fura-2 और PBFI प्रयोगों के लिए R36A का उपयोग बढ़ अनुपात के लिए अग्रणी फ्लोरोसेंट रीडिंग के संकेत के रूप में उच्च PowerLoad और प्रोबेनेसिड सांद्रता के साथ मिलकर एक कम ऊष्मायन तापमान के लिए बेहतर काम किया है, जबकि हम इष्टतम लदान को प्राप्त कर सकता है D39 में BCECF की लोडिंग. विशिष्ट संकेत तीव्रता प्रयोगों के बीच अंतर हो सकता है, माप की ratiometric प्रकृति उच्च reproducibility और छोटे प्रसार के साथ परिणाम प्रदान की.

सबसे उन्नत प्लेट पाठकों के साथ सॉफ्टवेयर के उपयोग के लिए कुछ नाम, पता लगाने गति, संवेदनशीलता का पता लगाने और अवधि पढ़ा सहित पता लगाने के मापदंडों की एक किस्म के समायोजन के लिए अनुमति देता है नमूनों की प्रतिदीप्ति माप के लिए. इस शोधकर्ता नजर रखी जा रही है कि विशेष घटना का पता लगाने के लिए इष्टतम संवेदनशीलता को खोजने के लिए अनुमति देता है. परिणाम के इष्टतम व्याख्या के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि स्त्राव के स्थिर baselinesescence और रैखिक मानक घटता झिल्ली से अधिक equilibrated मौजूद है कि डाई की राशि में अंतर - परख भिन्नता हो सकती है, के रूप में स्थापित किया है, या बैक्टीरिया में लोड और hydrolyzed कर रहे हैं. (3) पहले इलाज के लिए एक स्थिर प्रतिदीप्ति स्तर के लिए अनुमति देने के लिए DiBAC 4 का उपयोग करते समय पहले किसी भी तरह का इलाज करने के लिए जीवाणु झिल्ली पर डाई संतुलन के लिए समय की अनुमति विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. परीक्षण किया जाना जीवाणु निलंबन में पेश कर रहे हैं कि प्रयोगात्मक additives खुद को पता लगाने की तरंग दैर्ध्य विशेष पर autofluoresce सकता है या unspecifically की प्रतिदीप्ति संशोधित कर सकता है के रूप में इसके साथ ही, प्रत्येक व्यक्ति के विश्लेषण में उचित नियंत्रण के सभी सहित, सटीक डाटा के विश्लेषण के लिए आवश्यक है सूचक प्रत्यक्ष बातचीत के माध्यम से डाई.

हम यहाँ वर्णित है कि तरीकों के साथ जुड़े चिंता के कुछ संभावित क्षेत्रों को पहचानते हैं. Carbocyanine डाई DiOC 2 (3), DiBAC 4 (विपरीत3) carbocyanine डाई सेल की मात्रा में परिवर्तन, DiBAC 4 (3) नहीं कर सकते हैं के लिए खाते में कर सकते हैं तो, जबकि ratiometric नहीं है कि एक bisoxonol डाई है. इस प्रकार, सेल की मात्रा में परिवर्तन के अनुरूप है कि प्रतिदीप्ति के स्तर में परिवर्तन हो सकता है. Pneumococcus बैक्टीरिया rupturing बिना मात्रा में महत्वपूर्ण परिवर्तन की अनुमति नहीं देता है कि एक कठोर कोशिका दीवार के रूप में हम फिर भी, यह एक महत्वपूर्ण समस्या हो ध्यान नहीं दिया. बैक्टीरियल आयन अपशिष्टों की जांच के लिए, आयन के प्रति संवेदनशील रंगों की संवेदनशीलता ब्याज की आयन और अपनी एकाग्रता में परिवर्तन की डिग्री के आधार पर भिन्न हो सकती हैं. इसके अतिरिक्त, फ्लोरोसेंट रंगों के उपयोग के रूप में प्रत्यक्ष प्रयोगात्मक radioisotopes के उपयोग के रूप में एक विधि नहीं है. Radioisotopes के उपयोग के साथ शामिल दोनों वित्तीय और सुरक्षा संबंधी सीमाओं पर विचार हालांकि, जब ब्याज की आयन पर निर्भर करता है, प्रतिदीप्ति की जांच एक और अधिक व्यावहारिक विकल्प है. इस प्रकार, इस पांडुलिपि में वर्णित के तरीके नए और सुसंगत दृष्टिकोण प्रदानबेहतर अध्ययन झिल्ली ध्रुवता, अखंडता, और परिवहन की घटनाओं के लिए और बैक्टीरियल सिस्टम में ते.

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Disclosures

लेखकों घोषित करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.

Acknowledgments

इस काम के बिल और मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन (अनुदान 53,085), जे आर Oishei फाउंडेशन, और अमेरिकन लंग एसोसिएशन (अनुदान आरजी 123,721 एन) APH करने, और पूर्वी वायु कमान के लिए एनआईएच (NIDCD) फैलोशिप F31DC011218 द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Todd-Hewitt broth Bacto, BD Diagnostics 249240
Yeast Extract Bacto, BD Diagnostics 212750
Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2) Invitrogen (GIBCO)
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D5879 DMSO
DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol) Molecular Probes B-438
Propidium Iodide Sigma-Aldrich P4170 Make up in deionized water
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich
PowerLoad Molecular Probes P10020 100x concentrate
Probenecid Molecular Probes P36400 Make 100x stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial
Fura-2/AM Molecular Probes F1221 Special packaging (50 µg aliquots)
PBFI/AM Molecular Probes P1267 Special packaging (50 µg aliquots)
Nigericin Sigma-Aldrich N7143
KH2PO4 JT Baker 3246-01 monobasic
NaOH JT Baker 5565-01
K2HPO4 JT Baker 4012-01 dibasic
BCECF/AM Molecular Probes B1170 Special packaging (50 µg aliquots)
CCCP Sigma-Aldrich Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm, dissipating the electrical potential and the H+ gradient.
Culture tube  VWR 53283-802 Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass
Spectrophotometer Thermo Scientific Spectronic 20D+
15 ml Plastic conical tube Corning 430790
Clear 96-well polystyrene microtiter plate Fisher Scientific 12-565-501
Plate reader BioTek Synergy 2 Multi-Mode
Gen5 software BioTek Gen5™ Software

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 84, Pneumococcus क्षमता के प्रति संवेदनशील रंगों DiBAC Propidium आयोडाइड acetoxymethyl (AM) एस्टर झिल्ली टूटना आयन परिवहन बैक्टीरियल आयन सांद्रता आयन के प्रति संवेदनशील प्रतिदीप्ति
झिल्ली Polarity, झिल्ली अखंडता, और intracellular आयन सांद्रता में निगरानी परिवर्तन<em&gt; स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया</em&gt; फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग
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Clementi, E. A., Marks, L. R., Roche-Håkansson, H., Håkansson, A. P. Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (84), e51008, doi:10.3791/51008 (2014).

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