Summary
I motsetning til det som var observert for eukaryoter, er det sparsomt med studier som detalj membran depolarisering og ione konsentrasjonsendringer i bakterier, i første rekke som deres lille størrelse gjør konvensjonelle metoder for måling vanskelig. Her vi detalj protokoller for å overvåke slike hendelser i betydelig Gram-positive patogene Streptococcus pneumoniae benytte fluorescens-teknikker.
Abstract
Membran depolarisering og ion flukser er hendelser som har blitt studert mye i biologiske systemer på grunn av deres evne til dypt påvirke cellulære funksjoner, inkludert energetikk og signal transductions. Mens begge lysrør og elektrofysiologiske metoder, inkludert elektroden bruk og patch-klemming, har blitt godt utviklet for måling av disse hendelsene i eukaryote celler, har metoden for måling av tilsvarende hendelser mikroorganismer vist seg vanskeligere å utvikle gitt deres lille størrelse i kombinasjon med de mer komplekse ytre overflaten av bakterier som skjerming membranen. Under våre studier av døden-innvielse i Streptococcus pneumoniae (pneumokokker), ønsket vi å belyse den rollen av membran hendelser, inkludert endringer i polaritet, integritet, og intracellulære ionekonsentrasjoner. Søke litteraturen, fant vi at svært få studier foreligger. Andre etterforskere hadde overvåket radioisotop opptak eller likevekt å måle ion influensaxes og membranpotensialet, og et begrenset antall studier, hovedsakelig i Gram-negative organismer hadde sett en viss suksess ved hjelp carbocyanine eller oxonol fluorescerende fargestoffer for å måle membranpotensialet, eller lasting bakterier med celle-permeant acetoksymetyl (AM) ester versjoner av ione-sensitive fluorescerende indikator fargestoffer. Vi har derfor etablert og optimalisert protokoller for å måle membranpotensialet, brudd, og ione-transport i det gram-positive organisme S. pneumoniae. Vi utviklet protokoller ved hjelp av bis-oxonol fargestoff DiBAC 4 (3), og celle-impermeant fargestoff propidium jodid for å måle membran depolarisering og brudd, henholdsvis, så vel som fremgangsmåter for optimalt å laste pneumokokker med AM estere av de fargestoffer ratiometrisk Fura-2, PBFI og BCECF for å detektere endringer i de intracellulære konsentrasjonene av Ca 2 +, K + og H +, henholdsvis, ved hjelp av en fluorescens-deteksjonsplateleser. Disse protokollene er den første av sitt slag for pneumococcusog de fleste av disse fargestoffer som ikke har vært brukt i andre bakteriearter. Selv om våre protokoller har blitt optimalisert for S. pneumoniae, mener vi disse metodene bør danne et godt utgangspunkt for tilsvarende undersøkelser i andre bakteriearter.
Introduction
Vårt laboratorium har identifisert et protein-lipid kompleks fra morsmelk oppkalt HAMLET (for Menneskelig Alpha-lactalbumin Made dødelig for Kreftceller) som induserer apoptose i tumorceller, men er også i stand til å drepe en rekke bakteriearter 1,2. De artene som ble funnet å være spesielt følsomme var de som målrette luftveiene, med Streptococcus pneumoniae (den pneumococcus) viser størst følsomhet og en apoptose-lignende fenotype døds 2,3. Membran depolarisering og spesifikk ione transportarrangementer er godt beskrevet og viktige hendelser i apoptose i eukaryote celler, spesielt i mitokondriene, hvor radioaktive TPP +-ioner og fluorescerende fargestoffer inkludert JC-1 og TMRE har blitt brukt for å demonstrere depolarisering av mitokondriemembranen 3 -5. Dermed forsøkte vi å lære mer om effekten av HAMLET på disse membranrelaterte funksjoner i pneumococcus som vi fokusert vår innsats for åutvikle en bedre forståelse av de mekanistiske komponenter av apoptose-lignende fenotype i bakterier, med et stort potensial for identifisering av nye antibakterielle behandling eller vaksinekandidater i prosessen.
I arbeidet med å etablere protokoller for våre mekanistiske studier, oppdaget vi at i kontrast til den godt beskrevet metodikk i eukaryote systemer, er det svært få publiserte studier detaljering elektrofysiologi og ion transportmekanismer av bakteriemembranen 6,7. Dette skyldes primært den mindre størrelse av mikroorganismer og deres overflate-arkitektur, spesielt tilstedeværelsen av cellevegg, som begrenser tilgjengeligheten av membranen for bruk av konvensjonelle metoder som eukaryote patch klem, selv om noen studier ved hjelp av store protoplaster er blitt utført med blandet suksess 8,9. Som arbeid med disse gigantiske protoplaster er ikke en ideell eller praktisk metode for de fleste bakteriearter siden det krever mannipulated bakterier i en unaturlig og biologiske mekanismer tilstand, har den fastsatte studier av bakteriell membran polaritet som er blitt utført primært anvendt strømningscytometri og bruk av Cyanine og oxonol fluorescerende fargestoffer 10-16.
I stedet for flowcytometri, som samler de enkelte fluorescens avlesninger fra en bakterie til en enkelt tidspunkt, valgte vi å bruke en fluorescens-deteksjonsplateleser for å detektere fluorescens intensiteten av bakteriesuspensjoner i en 96-brønn plate-format over tid. Dette gjorde oss i stand til å behandle en populasjon av bakterier på ulike tidspunkter med mye større enkelhet og brukervennlighet, og kontinuerlig overvåke fluorescens kinetikk av hele befolkningen i lengre perioder av gangen, noe som er vanskelig å oppnå ved hjelp av flowcytometri. Etter testing av en rekke av de potensielle-sensitive fluorescerende fargestoffer (inkludert de som er nevnt ovenfor for bruk med mitokondrier) oppnådde vi den beste tekniske og praktiske suksess ved hjelpbis-oxonol fargestoff kalt DiBAC 4 (3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric syre) trimethine oxonol) for å overvåke endringer i polaritet.
Vi har også funnet det nyttig å samtidig overvåke forstyrrelser i integriteten av membranen ved hjelp av propidium jodid (PI). Dette fargestoff fluorescerer ved binding til nukleinsyre, men er bare i stand til å gjøre det når integriteten av den bakterielle membran er kompromittert, slik at det er den populære komponent som brukes for å detektere døde celler i levende døde flekker assays. I tillegg til PI, SYTOX grønn og TIL-PRO-1 er fluorescerende fargestoffer som er like i aksjon, og har tidligere blitt brukt for bakterier i noen studier med flowcytometri deteksjonsmetoder 17. Vi valgte å bruke PI grunn av sin eksitasjonsbølgelengde som tillot oss å overvåke fluorescens samtidig med DiBAC i en gitt prøve.
I våre undersøkelser har vi observert at Hamlet, samt en annen relatert protein-lipid-kompleks med baktericid aktivitetkjent som Eloa, indusert depolarisering og brudd av den bakterielle membran som indikert ved økningen i fluorescens over begge fargestoffer ved behandling av pneumococci 3,18,26. For begge komplekser, observerte vi at det fluorescens-intensiteten av DiBAC 4 (3) øket forut for økning av intensiteten av PI, noe som indikerer at depolarisering oppsto før brudd, og er derfor et spesielt arrangement indusert av våre bakteriedrepende protein-lipid-komplekser ifølge interesse. Dette skillet er viktig å gjøre, som ruptur av membranen kan selv forårsake uspesifikke depolarisering. Måle og analysere både DiBAC 4 (3) og PI fluorescens kinetikk samtidig mulig for oss å undersøke dette forholdet mellom de to membran hendelser, noe som er en ekstra fordel av å bruke fluorometri stedet for flowcytometri.
For å overvåke bakteriell ion flux, har det vært noen tidligere suksess med å bruke radioisotoper, inkludert måling opptak av45 Ca 2 + i pneumococcus 19,20, som vi også har brukt i våre nyere studier 18, 21. Men å jobbe med disse radioaktive ioner har flere ulemper. De kan være kostbart, tidkrevende og rotete, og kan også eksponere individet som utfører eksperimentet for å skade, avhengig av isotop av interesse. I tillegg er det vanskelig å overvåke raske endringer over tid. Således vi slått mot en alternativ metode for måling som anvender acetoksymetyl (AM) ester versjoner av ione-sensitive fluorescerende indikator fargestoffer. I seg selv, er indikatorfargestoff belastet og som ikke passerer gjennom membranen lett, men med tilsetningen av de lipofile ester-gruppe, kan den nå ladet molekyl som passerer gjennom membranen av bakterien. Ved å skrive inn det indre, bakterielle esteraser kløve estergruppen, slik at fargestoffet fritt inne i cellen og siktet igjen, i betydelig grad reduserer dens evne til å gå ut av cellen, og at fargestoffet to samle seg over tid. Imidlertid har bruken av disse esterfargestoffer bare blitt beskrevet i noen få bakteriearter for å detektere endringer i intracellulær Ca 2 + 22-24 og H-+ 16, med varierende fremgangsmåter for lasting, deteksjon og suksess.
Med et ønske om å overvåke endringer i intracellulær Ca 2 + og også K + og H + nivåer i S. pneumoniae ved behandling med HAMLET og andre forbindelser, vi opprettet protokoller for å effektivt laste fluorescerende indikatorfargestoffer inn i bakterieceller. Effektiv lasting til bakterier som kreves både probenecid som øker fargestoff oppbevaring ved å blokkere Anion-transportører og PowerLoad, en proprietær sammensatt fra Life Technologies som øker lasteeffektivitet. Fura-2/AM (oppdage Ca 2 +), PBFI / AM (oppdage K +), og BCECF / AM (oppdage H +) ble lastet inn både ukapslet og innkapslet pneumokokk stregnet som muliggjør måling av de resulterende fluorescens mønstre etter tilsetning av ionophores, slik som ionomycin (Ca 2 + uncoupler), Valinomycin (K + uncoupler) og CCCP (H + uncoupler) ved hjelp av en fluorescens-deteksjonsplateleser 18, 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Forbereder bakteriekulturer
- Voksende kultur for anvendelse i forsøk
- I en 37 ° C varmeblokk, tine en frossen lager-hetteglass med S. pneumoniae og legge til innholdet i 9 ml frisk, forvarmet Todd-Hewitt-buljong med 0,5% gjærekstrakt (THY) i et samlet volum på 10 ml i en glassrøret kultur.
- Inkuber statisk ved 37 ° C inntil kulturen har nådd midt-log fase (Abs 600nm ≈ 0,5-0,6).
2. Oppdager Membran depolarisering og Rupture
- Forbereder reagenser
- Forbered en 50 mikrometer lager av DiBAC 4 (3) i 100% DMSO, og en 2 mg / ml lager av PI i DDH 2 O. Den DiBAC 4 (3) lager er stabil ved -20 ° C i minst 6 måneder. PI lager er stabilt ved 4 ° C i minst seks måneder.
- Pakk aksjer i folie for å beskytte mot lys.
- Loadingbakterier
- Pellet bakteriecellene fra trinn 1.2.2 ved sentrifugering ved 2400 xg i 10 min ved romtemperatur og vaskes to ganger ved å fjerne den overliggende væske, resuspendering av pelleten i 10 ml 1x fosfatbuffret saltoppløsning (PBS), og sentrifuger på nytt ved 2400 xg i 10 min.
- Fjern supernatant og resuspender pelleten i PBS til det opprinnelige volum. Dette vil gi omtrent 10 8 koloni-dannende enheter av bakterier per ml. Fjern 1 ml (nok for 5 prøver) av de vaskede celler, og plasser det i et mikrosentrifugerør.
- Til disse cellene, tilsett 25 pl av en 1 M filter-sterilisert stamløsning av glukose (fremstilt i DDH 2 O og filtrert gjennom et 0,45 um filter) for en endelig konsentrasjon på 25 mM glukose, og inkuberes i en 37 ° C varmeblokk for femten min. MERK: Dette gir energi for alle ATP-avhengige membrankanaler og cellulære komponenter. Behovet for dette trinnet, kan variere, avhengig av forsøket.
- Tilsett 5 mL av 50 mikrometer DiBAC 4 (3) lager og 10 mL av 2 mg / ml PI lager. Dette gir sluttkonsentrasjoner på 250 nM og 20 mikrogram / ml, henholdsvis. Bland grundig ved pipettering opp og ned flere ganger. Tilsett 200 ul av denne cellesuspensjon til hver prøvebrønnen av en klar 96-brønns plate.
- Oppdager fluorescens
- Sett platen i en forvarmet (37 ° C) fluorescensdeteksjon plateleser.
- Sikre at passende filtre er på plass for DiBAC 4 (3) (490 nm eksitasjon, 516 nm utslipp) og PI (535 nm eksitasjon, 617 nm utslipp) deteksjon.
- For å gi rom for (og samtidig overvåke) ekvilibreringen av DiBAC 4 (3) over membranen, sette leseren til å ta fluorescens målinger hver min for ca 30-40 minutter, eller til lesing stabiliserer, og dette fungerer som en "forbehandling" lesing.
- Løs ut plate og legge den eksperimentelle agent for valg og immediately Sett platen tilbake i leseren til å fortsette å overvåke DiBAC 4 (3) og PI fluorescens for ønsket tidsrom. Ved behandling av flere prøver på en gang, ved hjelp av en multikanal pipette kan være nyttig å legge agenten samtidig til alle brønner.
- Eksportere målingene til en dataanalyseprogram som Microsoft Excel. Plot fluorescens over tid for å evaluere membran depolarisering og ruptur. Økende fluorescens av DiBAC og PI indikerer at depolarisering og brudd forekommer.
Tre. Oppdager Endringer i intracellulær Ca 2 + eller K + Konsentrasjoner
- Forbereder reagenser og lasting buffer
- Forbered følgende reagenser: 5 mM lager av ion-sensitive fluorescerende fargestoff (Fura-2/AM eller PBFI / AM, legge til riktig mengde DMSO til et rør som inneholder 50 mikrogram av fargestoff), "100x" probenecid (legg en ml av PBS til en 77 mg ampulle). Den oppløstefargestoffer som kan fryses ved -20 ° C en gang, og er stabilt i oppløsning i 3 måneder, mens probenecid er stabil i løsning ved -20 ° C i 6 måneder.
- Tilbered en ml av 2x Last buffer som følger: I bunnen av en 15 ml plast-konisk rør, dispensere 20 pl av 100x PowerLoad konsentrat (stabil ved 2-8 ° C i 6 måneder), etterfulgt av 2 ul av 5 mM ione følsomt fargestoff direkte i PowerLoad. Vortex kort for å blande. Legg 960 mL PBS etterfulgt av 20 pl av 100x probenecid. Vortex blandingen en siste gang. Pakk inn i folie for å beskytte mot lys.
- Legge bakterier med fargestoff
- Pellet-og vaske den mid-log fase bakteriekultur som beskrevet i 2.2.1. Fjern supernatant og resuspender pelleten i 5 ml PBS for å lage en "2x" cellesuspensjon.
- Tilsett 1 ml av 2x cellesuspensjon til det 2x lastes buffer. Dette vil gi et sluttvolum på 2 ml, og endelig konsentrasjonerasjon av 1x PowerLoad, 5 mikrometer fluorescerende fargestoff, og 1x probenecid. MERK: Dette fjæring gir nok volum for 10 prøver siden hver prøvebrønnen for måling vil inneholde 200 mL.
- Inkuber i et 37 ° C vannbad i 75 min, beskyttet mot lys. MERK: Fargestoffet er lastet inn i de bakterielle celler i fravær av eventuelle glykolytiske substrat, og i nærvær av probenecid for å minimalisere utstrømning av fargestoffet.
- WASH 1: Pellet cellene ved sentrifugering ved 2400 xg i 10 minutter, fjern supernatanten og resuspender i 2 ml PBS inneholdende 1 x probenecid. VASK 2, 3: Gjenta trinn 3.2.4 2x. Inkuber ved 37 ° C i ytterligere 30 min. Dette vil gi tid for bakterielle esteraser til å hydrolysere estergruppen AM bort fra internalis fluorescerende fargestoffer.
- WASH 4: Pellet cellene ved sentrifugering ved 2400 xg i 10 minutter, fjern supernatanten og resuspender i 2 ml PBS inneholdende 1 x probenecid. MERK: Avhengig av experiment, kan glukose legges tilbake hit til ny energi bakterier.
- Oppdager fluorescens
- Prewarm fluorescens-deteksjonsplateleser plateleser til 37 ° C.
- For hver ønsket prøven, tilsett 200 pl av de lastede celler (fra trinn 3.2.8) til brønner i en 96-brønns plate. (Utfør følgende trinn til ferdigstillelse for en brønn / prøve om gangen).
- Å etablere en baseline lesing for en brønn, plass plate i fluorescensdeteksjon plate-leser for å måle fluorescens (340 nm eksitasjon / 510 nm utslipp for "Verdi 1" og 380 nm eksitasjon / 510 nm utslipp for "Value 2") på hvert sekund for ett min.
- Løs ut plate, tilsett behandling av valget til at godt (i et lite volum på ca 5 mL), raskt pipetter opp og ned et par ganger for å blande, og umiddelbart plassere tilbake i fluorescensdeteksjon plate-leseren til å lese hvert sekund for ønsket lang tid. (Hvis det ijectors forbundet med plate-leser, er tilgjengelige, kan disse også brukes for å legge sømløst den ønskede behandling, noe som eliminerer behovet for å stoppe skrive og løse ut plate).
- Eksportere målingene til en dataanalyseprogram som Microsoft Excel. Beregn forholdet av de fluorescens-verdier for hver gang-punkt ved å dividere en verdi på verdi 2, og plotte forholdsverdiene på en graf.
4. Oppdage endringer i intracellulær pH
- Forbereder reagenser og buffere kalibrerings
- Forbered de følgende reagenser: 5 mM lager av BCECF / AM (. Tilsett passende mengde DMSO til et rør inneholdende 50 ug av fargestoffet Dette lager er stabil ved -20 ° C i 3 måneder); 100x probenecid (tilsett 1 ml PBS til en 77 mg ampulle),. 1 mM stock fremstilling av nigericin i etanol (nødvendig for å stabilisere den intracellulære pH (pH i) av cellene til pH i området buffer Dette lager er sbordet ved -20 ° C i 6 måneder),. 0,5 mM lager av Carbonyl cyanid 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) i DMSO (protonophore å koble sig proton drivkraften Dette lager er stabil ved -20 ° C i 6 måneder)
- Forbered 10 ml av følgende høye kalium buffere: 135 mm KH 2 PO 4/20 mM NaOH (enbasisk) og 110 mm K 2 HPO 4/20 mM NaOH (dibasic). Filter sterilisere med en 0,45 mikrometer filter. (Disse buffere kan lagres ved 4 ° C før bruk).
- Bland høye kalium buffere ved de nødvendige mengder for å lage høye kalium buffere med minst 5-6 pH-verdier i området 6,5 til 8,0.
- Tilbered en ml av 2x Last buffer som følger: I bunnen av en 15 ml plast-konisk rør, dispensere 40 pl av 100x PowerLoad, etterfulgt av 20 pl av den 5 mM ione-følsomt fargestoff direkte i PowerLoad. Vortex kort for å blande. Legg 900 mL PBS etterfulgt av 40 mL av 100x probenecid. Vortex blandingen en siste gang. Pakk inn i folie for å beskytte mot lys.
- Legge bakterier med fargestoff
- Pellet-og vaske de 8 ml av den mid-log fase bakteriekultur, som beskrevet i 2.2.1. Fjern supernatanten, resuspender pelleten i 2 ml PBS for å lage en "4x" cellesuspensjon.
- Tilsett 1 ml av cellesuspensjonen 4x til 2x lastes buffer. Dette vil gi et sluttvolum på 2 ml, og sluttkonsentrasjonen av 2x celler, 2x PowerLoad, 50 pM fluorescerende fargestoff, og 2 x probenecid.
- Inkuber i et 30 ° C vannbad i 40 min, beskyttet mot lys. MERK: Fargestoffet er lastet inn i de bakterielle celler ved den nedre temperatur på 30 ° C og i fravær av eventuelle glykolytiske substrat for å minimalisere utstrømning av fargestoffet.
- WASH 1: Pellet cellene ved sentrifugering ved 2400 xg i 10 min, fjern supernatanten å kvitte seg med overskuddsfarge, og resuspender i 4 ml PBS som inneholder 2x probenecid ennd en mM glukose (for å revitalisere bakterier). WASH 2, 3: Gjenta trinn 4.2.7 to ganger, med endelig resuspensjon i 4 ml PBS (for en endelig konsentrasjon på 1 x-celler) inneholdende 2 x probenecid og 10 mM glukose.
- Inkuber ved 37 ° C i 5 min. Dette vil tillate cellene og full energi og tillate tid for bakterielle esteraser for å spalte AM ester-gruppen fra den internalisert BCECF.
- Etablering bakgrunnsfluoresens og in vivo kalibreringskurve
- Prewarm fluorescens-deteksjonsplateleser plateleser til 37 ° C.
- For å bestemme bakgrunnsfluorescens, filtersteriliser omtrent 500 pl av den innlastede og energisk bakteriell suspensjon (fra trinn 4.2.7) for å fjerne bakteriene, og tilsett 200 ul av filtratet til brønn av 96-brønns plate.
- Plasser plate i fluorescens deteksjon plate-leser til å måle fluorescens (490 nm eksitasjon / emisjon 530 nm for"Verdi 1" og 440 nm eksitasjon / 530 nm utslipp for "Value 2") i 1 min. Denne bakgrunnsfluorescens skal trekkes før beregningen av forhold for både kalibreringskurven og de eksperimentelle prøver.
- For å få en in vivo kalibreringskurve, vaske 500 mL prøver av de belastede og strømførende celler fra trinn 4.2.7 gang og resuspender i høye kalium buffere ved ulike pH-verdier (som spenner 6,5 til 8,0).
- Til 20 uM nigericin til prøvene til likevekt den intracellulære pH av cellene til pH i området buffer og inkuberes ved 37 ° C i 5 min. Tilsett 200 ul av bakterier / pH-buffer-kombinasjoner til brønnene i en 96-brønns plate.
- Plasser plate i fluorescens deteksjon plate-leser til å måle fluorescens for noen få minutter for å etablere en jevn avlesning for hver brønn. Eksportere målingene til en dataanalyseprogram som Microsoft Excel.
- Etter å trekke baBAKGRUNN fluorescens verdier, beregne forholdet mellom fluorescens verdier ved å dele Verdi 1 av Verdi 2. Plott forholdsverdiene for hver pH-buffer for å lage kalibreringskurven. (En kalibreringskurve bør bli generert for hver ny batch av lastet celler, som mengden av fluorescerende fargestoff som er lastet inn i bakteriene kan variere hver gang).
- Måle endringer i intracellulær pH
- For hver ønsket prøven, tilsett 200 pl av de belastede og energiserte cellene fra trinn (4.2.7) til brønner i en 96-brønns plate.
- Plasser plate i fluorescens deteksjon plate-leser og måle fluorescensen av prøvene hver 5 sekunder i 5 min.
- Utløs plate og tilsett 10 uM CCCP til en brønn (tjener som en positiv kontroll for å redusere intracellulære pH-verdien), og den eksperimentelle middel (er) av interesse i andre brønner. Til nøyaktig sammenligne deres effekter over tid, legger CCCP og agenter for valg samtidig ved hjelp amultichannel pipette.
- Umiddelbart returnere platen til plate-leser og fortsette å måle fluorescens hvert 5. sek i 10 minutter. Som en ytterligere kontroll, ta ut platen og tilsett 20 uM Nigericin på alle prøver for å stabilisere pH i av bakteriene til pH i området buffer, og lest i 5 min.
- Etter å trekke bakgrunnsfluoresens verdier, beregne prosenter av fluorescens for hver prøve. Interpoler pH i for hver avlesning fra kalibreringskurven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For alle eksperimentene er det en sample-og sett av betingelser som er tilstede i hver brønn. Dermed representerer hver tracing fluorescens intensiteten av en hel populasjon av bakterier over tid. Resultatene bør være lett tolkbare, med et klart skille mellom fluorescensen av de behandlede prøver og at av de ubehandlede kontroller. Kinetikken og graden av en observert endring i fluorescens kunne gi informasjon om den mulige mekanisme og omfanget av hendelsen som overvåkes.
Ved utforsking av membranen polaritet, bakteriene trenger å bli inkubert med DiBAC i ca 40 min for å tillate likevektsinnstilling av fargestoffet over membranen, som indikert av den stadige reduksjon og påfølgende utjevning av fluorescens i figur 1A før behandling. Som vist i figur 1B, betyr PI krever ekvilibrering, som dets fluoriserende signal er jevn over hele den første 40 min inkubering, but sin tilstedeværelse sammen med DiBAC er nyttig å overvåke membran ruptur samtidig med polaritet. Depolarisering og ruptur av bakteriene er indikert ved en økning i fluorescens intensiteten av både fargestoffer. Andre midler som kan depolarisering og brudd, slik som vaskemidler (natriumdeoksycholat 18), uncouplers eller ionophores (CCCP), kan også tilsettes for å demonstrere disse hendelsene ved hjelp av denne metodikken.
For Fura-2/AM, PBFI / AM, og BCECF / AM, er forholdet mellom to fluorescerende signaler beregnet, og en økning eller nedgang i denne andelen tilsvarer den intracellulære Ca 2 + (figur 2), K + (Figur 3 ), og H + (figur 4) konsentrasjoner henholdsvis. Ved tilsetningen av kalsium ionophore ionomycin, Ca 2 + strømmer inn i cellen som forårsaker en økning i fluorescens-forhold (figur 2). Tilsetting av Valinomycin har motsatt effekt, forårsaker K+ Til å strømme ut av cellen og redusere den intracellulære konsentrasjon, noe som er indikert ved en reduksjon i fluorescens-forhold (fig. 3). BCECF tillater måling av intracellulære pH ved først å lage en kalibreringskurve (fig. 4A) i nærvær av forskjellige buffere med kjent pH. En reduksjon i fluorescens-forhold av fargestoff svarer til en reduksjon i pH-verdi, som observert etter tilsetningen av protonophores CCCP eller nigericin, som kollapser proton gradient (figur 4B).
Figur 1. Overvåking membran forstyrrelsene. S. pneumoniae ble inkubert med (A) DiBAC og (B) PI samtidig i 40 min for å tillate for ekvilibrering av DiBAC over membrane. Ved slutten av denne inkubering (pil), PBS (ubehandlet) eller Hamlet (behandlet) ble tilsatt, og prøvene ble avlest i ytterligere en time. for å vise større bilde.
Figur 2. Oppdage endringer i intracellulære kalsiumnivåer. Pneumokokker ble lastet med Fura-2/AM og behandlet (pil) med PBS (ubehandlet) eller kalsium ionophore ionomycin (positiv kontroll). Forholdet mellom fluorescens verdier er presentert. Klikk her for å se større bilde.
Figur 3. Oppdager endringer i intracellulære kaliumnivå. Pneumokokker ble lastet med PBFI / AM og behandlet (pil) med PBS (ubehandlet) eller kalium ionophore Valinomycin (positiv kontroll). Forholdet mellom fluorescens verdier er presentert. Klikk her for å se større bilde.
Figur 4. Oppdage endringer i intracellulære proton nivåer. (A) Standard kurve for intracellulær pH kalibrering. (B) pneumokokker ble lastet med pH sensitive fargestoff BCECF-AM, og varvasket og resuspendert i PBS + glukose. Etter opptak av grunnlinjemålinger, ved den første pil, PBS (sort), den protonophore CCCP (100 uM), eller Hamlet (100 pg / ml eller 6 uM), ble tilsatt til bakteriene, og fluorescensen ble målt over tid. Ved den andre pil nigericin (20 pM) ble tilsatt til helt forsvinne den transmembrane proton gradient av alle prøvene. for å vise større bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Til tross for den begrensning at størrelsen presenterer for ved hjelp av klassiske metoder for elektrofysiologi å detektere endringer i polaritet og integriteten av membranen og endringer i ione-konsentrasjoner i bakterier, har vi beskrevet en måte å måle disse hendelser S. pneumoniae bruker fluorescerende fargestoffer. Våre protokoller er det første av deres slag er beskrevet for pneumococcus og ett av de få som beskrevet for bakterie-arter generelt. Ved hjelp av en fluorescens-deteksjonsplateleser, kan disse hendelsene måles i små, 200 ul volum prøver av bakterier, med fluorescens detektert fra den enkelte populasjon av bakterier over tid. Kinetikken og endringer i fluorescensintensitet kan brukes til å kvalitativt bestemme hva som skjer med membranens polaritet eller integritet, eller nivåer av Ca 2 +, K + eller H + i bakteriene. Kvantitativt sett kan fluorescensintensiteten verdier også benyttes til å beregne graden av depolarization, brudd, kalsiumopptak, kalium-utstrømning, eller pH-endring ble observert i en prøve i forhold til en annen, noe som gir viktig informasjon om en mekanisme av interesse. I tillegg bør vår protokoll være nyttig som et utgangspunkt for å legge andre AM fluorescerende fargestoffer, slik at for studiet av en rekke andre cellulære hendelser i en rekke bakteriearter. Vi har allerede vært vellykket i å bruke noen av disse protokollene i Staphylococcus aureus 21.
Ved bruk av AM fargestoffer, er rikelig inkubasjonstid viktig for fargestoff lasting og å oppnå den etterfølgende hydrolyse nødvendig for fargestoffet til å reagere på mål-ionene i bakterier, og gir de tilsvarende fluorescens endringer. Lastekinetikk kan variere mellom bakteriestammer på grunn av flere faktorer, inkludert forskjeller i bakterieoverflaten arkitektur (kapsel tilstedeværelse, membranfluiditet, tilstedeværelse av effluks-pumper, osv..) Og i den kjemiske strukturen of fargestoff. For å oppnå maksimal last for bakteriestammen og fargestoff av interesse, er det flere parametere av vår protokoll som krever modulering inkludert: inkubering varighet, inkubasjonstemperatur, næringsstoffer, PowerLoad konsentrasjon, og probenecid konsentrasjon. For å oppnå vellykket lasting, er fluorescens-signal intensitet mindre viktig enn å vise den positive kontroller, som for eksempel tilsetning av ionophores, gir et signal i den riktige retning, og / eller som viser linearitet i kalibreringskurve. For å optimalisere lasting av en økning i PowerLoad and Probenecid konsentrasjon fulgt av en senkning av temperaturen for å unngå ekstrudering av fargestoffet er å foretrekke å øke fargestoffkonsentrasjon som kan resultere i ekstracellulære flekker som vil forvirre signalet. Under utviklingen av våre protokoller, var vi i stand til å lykkes laste våre fargestoffer av interesse i både villtype innkapslet pneumokokk belastning D39 og ukapslet belastning R36A 25.Men vi fant ut at vi kunne oppnå optimal lasting som indikert av fluorescerende målinger fører til økte forholdstall som bruker R36A for Fura-2 og PBFI eksperimenter med 37 ° C inkubasjonstemperaturen, mens en lavere inkubasjonstemperaturen kombinert med høyere PowerLoad og probenecid konsentrasjoner fungerte bedre for lasting av BCECF i D39. Selv om spesielle signalintensiteten kan variere mellom eksperimenter, den ratiometrisk karakter av målingene gitt resultater med høy reproduserbarhet og liten spredning.
For fluorescens målinger av prøver, bruk av programvaren som følger med mest avanserte plate lesere åpner for justeringer av en rekke parametere for deteksjon, inkludert deteksjon hastighet, følsomhet, og lese varighet, for å nevne noen. Dette gjør at forskeren til å finne den optimale sensitivitet for påvisning av den spesielle arrangement som blir overvåket. For optimal tolkning av resultater, er det avgjørende at stabile grunnlinjene av fluorescence og lineære standardkurver er etablert, som det kan være inter-assay variasjoner i mengden av fargestoff som er til stede, bragt til likevekt over membranen, eller lastet inn i bakterier, og hydrolyseres. Dette gir tid til fargestoff ekvilibrering over bakterielle membranen før behandling av en hvilken som helst type, er spesielt viktig når man bruker DiBAC 4 (3) for å tillate en stabilisert fluorescens-nivået før behandling. Dessuten, blant alle de riktige kontroller i hver individuell analyse er viktig for nøyaktig analyse av dataene, som de eksperimentelle additiver som er innført i den bakterielle suspensjonen som skal testes, kan selv autofluoresce ved de spesielle bølgelengder av deteksjon eller kan uspesifikt modifisere fluorescensen av indikator fargestoff gjennom direkte interaksjon.
Vi erkjenner noen potensielle områder av bekymring knyttet til de metodene som vi har beskrevet her. I motsetning til den carbocyanine fargestoff DiOC 2 (3), DiBAC 4 (3) er en bisoxonol fargestoff som ikke er proporsjonal, så mens carbocyanine fargestoff kan gjøre rede for endringer i cellevolum, DiBAC 4 (3) kan ikke. Således kan det forekomme forandringer i nivået av fluorescens som tilsvarer forandringer i cellevolum. Vi, derimot, la ikke merke til at dette skal være et betydelig problem, som pneumococcus har en stiv cellevegg som ikke tillater store endringer i volum uten sprekker bakteriene. For å undersøke bakterielle ion flukser, kan følsomheten av ione-sensitive fargestoffer variere avhengig av ion av interesse og graden av endring i konsentrasjonen. I tillegg er bruken av fluorescerende fargestoffer eksperimentelt ikke så direkte en fremgangsmåte som bruk av radioisotoper. Imidlertid, avhengig av ion av interesse, behandlingen fluorescens er en mye mer praktisk alternativ ved vurdering både av økonomiske og sikkerhetsrelaterte begrensninger som er involvert ved bruk av radioisotoper. Således er metoder som er beskrevet i dette manuskriptet gir ny og jevn tilnærminges til bedre studie membran polaritet, integritet, og transportarrangementer og i bakterielle systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser å fortolle.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Bill og Melinda Gates Foundation (Grant 53085), JR Oishei Foundation, og The American Lung Association (Grant RG-123721-N) til APH, og NIH (NIDCD) fellesskap F31DC011218 til EAC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd-Hewitt broth | Bacto, BD Diagnostics | 249240 | |
| Yeast Extract | Bacto, BD Diagnostics | 212750 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2) | Invitrogen (GIBCO) | ||
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | DMSO |
| DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol) | Molecular Probes | B-438 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Make up in deionized water |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| PowerLoad | Molecular Probes | P10020 | 100x concentrate |
| Probenecid | Molecular Probes | P36400 | Make 100x stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial |
| Fura-2/AM | Molecular Probes | F1221 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| PBFI/AM | Molecular Probes | P1267 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | |
| KH2PO4 | JT Baker | 3246-01 | monobasic |
| NaOH | JT Baker | 5565-01 | |
| K2HPO4 | JT Baker | 4012-01 | dibasic |
| BCECF/AM | Molecular Probes | B1170 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| CCCP | Sigma-Aldrich | Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm, dissipating the electrical potential and the H+ gradient. | |
| Culture tube | VWR | 53283-802 | Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | Spectronic 20D+ | |
| 15 ml Plastic conical tube | Corning | 430790 | |
| Clear 96-well polystyrene microtiter plate | Fisher Scientific | 12-565-501 | |
| Plate reader | BioTek | Synergy 2 Multi-Mode | |
| Gen5 software | BioTek | Gen5™ Software |
References
- Hakansson, A., Zhivotovsky, B., Orrenius, S., Sabharwal, H., Svanborg, C. Apoptosis induced by a human milk protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (17), 8064-8068 (1995).
- Hakansson, A., et al. A folding variant of alpha-lactalbumin with bactericidal activity against Streptococcus pneumoniae. Mol. Microbiol. 35 (3), 589-600 (2000).
- Hakansson, A. P., Roche-Hakansson, H., Mossberg, A. K., Svanborg, C. Apoptosis-Like Death in Bacteria Induced by HAMLET, a Human Milk Lipid-Protein Complex. PLoS One. 6 (3), (2011).
- Kohler, C., Gogvadze, V., Hakansson, A., Svanborg, C., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. A folding variant of human alpha-lactalbumin induces mitochondrial permeability transition in isolated mitochondria. Eur. J. Biochem. 268 (1), 186-191 (2001).
- Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (Δψ m) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8 (2), 115-128 (2003).
- Dominguez, D. C. Calcium signalling in bacteria. Mol. Microbiol. 54 (2), 291-297 (2004).
- Corratge-Faillie, C., Jabnoune, M., Zimmermann, S., Very, A. A., Fizames, C., Sentenac, H. Potassium and sodium transport in non-animal cells: the Trk/Ktr/HKT transporter family. Cell Mol. Life Sci. 67 (15), 2511-2532 (2010).
- Szabo, I., Petronilli, V., Zoratti, M. A patch-clamp study of Bacillus subtilis. Biochim. Biophys. Acta. 1112 (1), 29-38 (1992).
- Zoratti, M., Petronilli, V., Szabo, I. Stretch-activated composite ion channels in Bacillus subtilis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 168 (2), 443-450 (1990).
- Novo, D., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. Accurate flow cytometric membrane potential measurement in bacteria using diethyloxacarbocyanine and a ratiometric technique. Cytometry. 35 (1), 55-63 (1999).
- Novo, D. J., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. Multiparameter flow cytometric analysis of antibiotic effects on membrane potential, membrane permeability, and bacterial counts of Staphylococcus aureus and Micrococcus luteus. Antimicrob. Agents Chemother. 44 (4), 827-834 (2000).
- Shapiro, H. M. Membrane potential estimation by flow cytometry. Methods. 21 (3), 271-279 (2000).
- Shapiro, H. M. Microbial analysis at the single-cell level: tasks and techniques. J. Microbiol. Methods. 42 (1), 3-16 (2000).
- Bashford, C. L., Chance, B., Smith, J. C., Yoshida, T. The behavior of oxonol dyes in phospholipid dispersions. Biophys. J. 25 (1), 63-85 (1979).
- Suzuki, H., Wang, Z. -Y., Yamakoshi, M., Kobayashi, M., Nozawa, T. Probing the transmembrane potential of bacterial cells by voltage-sensitive dyes. Anal. Sci. 19 (9), 1239-1242 (2003).
- Breeuwer, P., Abee, T. Assessment of the membrane potential, intracellular pH and respiration of bacteria employing fluorescence techniques. Mol. Microb. Ecol. Manual. 8, 1563-1580 (2004).
- Mortimer, F. C., Mason, D. J., Gant, V. A. Flow cytometric monitoring of antibiotic-induced injury in Escherichia coli using cell-impermeant fluorescent probes. Antimicrob. Agents Chemother. 44 (3), 676-681 (2000).
- Clementi, E. A., Marks, L. R., Duffey, M. E., Hakansson, A. P. A Novel Initiation Mechanism of Death in Streptococcus pneumoniae Induced by the Human Milk Protein-Lipid Complex HAMLET and Activated during Physiological Death. J. Biol. Chem. 287 (32), 27168-27182 (2012).
- Trombe, M. C., Laneelle, G., Sicard, A. M. Characterization of a Streptococcus pneumoniae mutant with altered electric transmembrane potential. J. Bacteriol. 158 (3), 1109-1114 (1984).
- Trombe, M. C. Characterization of a calcium porter of Streptococcus pneumoniae involved in calcium regulation of growth and competence. J. Gen. Microbiol. 139 (3), 433-439 (1993).
- Marks, L. R., Clementi, E. A., Hakansson, A. P. Sensitization of Staphylococcus aureus to Methicillin and Other Antibiotics In Vitro and In Vivo in the Presence of HAMLET. PLoS ONE. 8 (5), (2013).
- Futsaether, C. M., Johnsson, A. Using fura-2 to measure intracellular free calcium in Propionibacterium acnes. Can. J. Microbiol. 40 (6), 439-445 (1994).
- Tisa, L. S., Adler, J. Chemotactic properties of Escherichia coli mutants having abnormal Ca2+ content. J. Bacteriol. 177 (24), 7112-7118 (1995).
- Werthen, M., Lundgren, T. Intracellular Ca2+ mobilization and kinase activity during acylated homoserine lactone-dependent quorum sensing in Serratia liquefaciens. J. Biol. Chem. 276 (9), 6468-6472 (2001).
- Avery, O. T., MacLeod, C. M., McCarty, M. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Induction of transformation by a dexoxyribonuceic acid fraction isolated from pneumococcus type III. J. Exp. Med. 79, 137-158 (1944).
- Clementi, E. A., Wilhelm, K. R., Schleucher, J., Morozova-Roche, L. A., Hakansson, A. P. A Complex of Equine Lysozyme and Oleic Acid with Bactericidal Activity against. PLoS One. . 8, (2013).
