Summary
Till skillnad från det som ses för eukaryoter finns det en brist på studier som detalj membrandepolarisering och jonkoncentration förändringar i bakterier, främst deras ringa storlek gör att konventionella metoder för mätning svår. Här, vi detalj protokoll för övervakning av sådana händelser i betydande grampositiva patogener Streptococcus pneumoniae utnyttjar fluorescensteknik.
Abstract
Membrandepolarisering och jonflöden är händelser som har studerats i stor utsträckning i biologiska system på grund av deras förmåga att djupt påverka cellulära funktioner, inklusive energetik och signal transduktioner. Medan både lysrör och elektrofysiologiska metoder, inklusive elektrod användning och patch-fastspänning, är väl utvecklad för att mäta dessa händelser i eukaryota celler, har metoder för att mäta liknande händelser i mikroorganismer visat sig vara mer utmanande att utveckla med tanke på deras ringa storlek i kombination med den mer komplexa yttre ytan av bakterier avskärmande membranet. Under våra studier av döds-initiering i Streptococcus pneumoniae (pneumokocker), ville vi belysa rollen av membran evenemang, bland annat förändringar i polaritet, integritet och intracellulära jonkoncentrationer. Söka litteraturen fann vi att mycket få studier finns. Andra forskare hade övervakade radioisotopupptag eller jämvikt för att mäta ion influensaxes och membranpotential och ett begränsat antal studier, främst i gramnegativa organismer, hade sett viss framgång med hjälp karbocyanin eller oxonol fluorescerande färger för att mäta membranpotential, eller fyller på bakterier med cell genomträngande acetoximetyl (AM) ester versioner av jonkänsligt fluorescerande indikatorfärgämnen. Vi har därför etablerat och optimerat protokoll för mätning av membranpotential, bristning, och jon-transport i grampositiva organismen S. pneumoniae. Vi utvecklade protokollen genom att använda bis-oxonol färgämne DiBAC 4 (3) och cell impermeant färgämnet propidiumjodid att mäta membrandepolarisering och bristningar, respektive, samt metoder för att på bästa sätt ladda pneumokocker med AM-estrar av ratiometrisk färgämnen Fura-2, PBFI och BCECF att detektera förändringar i intracellulära koncentrationer av Ca 2 +, K + och H +, respektive, med användning av en fluorescens-detektion plattläsare. Dessa protokoll är den första i sitt slag för pneumokockeroch de flesta av dessa färgämnen inte har använts i några andra bakteriearter. Även våra protokoll har optimerats för S. pneumoniae, tror vi dessa metoder bör utgöra en utmärkt utgångspunkt för liknande studier i andra bakteriearter.
Introduction
Vårt labb har identifierat ett protein-lipid-komplex från bröstmjölk vid namn HAMLET (för humant alfa-laktalbumin Made dödlig för tumörceller) som framkallar apoptos i tumörceller, men också möjlighet att döda en mängd olika bakteriearter 1,2. De arter som befanns vara särskilt känsliga var de som riktar luftvägarna, med Streptococcus pneumoniae (den pneumokocker) visar den största känslighet och en apoptos-liknande fenotyp döds 2,3. Membrandepolarisering och specifik jon transport händelser är väl beskrivna och viktiga händelser under apoptos i eukaryota celler, speciellt i mitokondrierna, där radioaktiva TPP +-joner och fluorescerande färger inklusive JC-1 och TMRE har använts för att demonstrera depolarisation av mitokondriemembranet 3 -5. Därför sökte vi att lära oss mer om effekten av HAMLET på dessa membranrelaterade funktioner i pneumokocker som vi fokuserat våra ansträngningar attutveckla en bättre förståelse av de mekanistiska komponenterna i apoptos-liknande fenotyp i bakterier, med stora möjligheter att identifiera nya antibakteriella behandlingar eller vaccinkandidater i processen.
I sin strävan att upprätta protokoll för våra mekanistiska studier, upptäckte vi att i motsats till den väl beskrivna metoden i eukaryota system, det finns mycket få publicerade studier som beskriver elektrofysiologi och jon transportmekanismer av bakteriemembranet 6,7. Detta är i första hand tillskrivas den mindre storleken av mikroorganismer och deras yta arkitektur, särskilt närvaron av cellväggen, begränsar att tillgängligheten av membranet för användning av konventionella eukaryota metoder som lapp fastspänning, även om vissa studier med användning av jätteprotoplaster har utförts med blandad framgång 8,9. Eftersom arbetet med dessa gigantiska protoplaster är inte ett ideal eller ens praktisk metod för de flesta bakteriearter eftersom det kräver mannenipulated bakterier i en onaturlig och abiotisk tillstånd, har de begränsade studier av bakteriemembranet polaritet som har utförts i huvudsak användes flödescytometri och användning av cyanin-och oxonol fluorescerande färgämnen 10-16.
Istället för flödescytometri, som samlar enskilda fluorescens avläsningar från en bakterie till en enda tidpunkt, valde vi att använda en flourenscensprövning plattläsare för att upptäcka fluorescens intensitet bakteriesuspensioner i en 96-brunnar format över tiden. Detta gjorde det möjligt att behandla en population av bakterier vid olika tidpunkter med mycket större enkelhet och lätthet, och kontinuerligt övervaka fluorescens kinetik hela befolkningen för en längre tid, vilket är svårt att uppnå med hjälp av flödescytometri. Efter att ha testat många olika potentiella känslig fluorescerande färger (inklusive de som nämnts ovan för användning med mitokondrier), nådde vi den bästa tekniska och praktiska framgång med hjälp avbis-oxonol färgämne som heter DiBAC 4 (3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol) att övervaka förändringar i polaritet.
Vi fann också att det är värdefullt att samtidigt övervaka störningar i integriteten av membranet med hjälp av propidiumjodid (PI). Detta färgämne fluorescerar vid bindning till nukleinsyra, utan bara kan göra det när integriteten i bakteriemembran äventyras, vilket gör den populär komponent som används för att upptäcka döda celler i levande-död färgnings analyser. Förutom PI, Sytox grönt och TO-PRO-1 är fluorescerande färgämnen som har liknande verkan och har tidigare använts för bakterier i några studier med användning av flödescytometri detektionsmetoder 17. Vi valde att använda PI grund av dess excitationsvåglängden som tillät oss att övervaka fluorescens samtidigt med DiBAC i ett givet prov.
I våra studier har vi observerat att HAMLET, samt annan relaterad protein-lipid-komplex med bakteriedödande aktivitetkänd som Eloa, inducerad depolarisation och bristningar i bakteriemembranet såsom indikeras av en ökning av fluorescensen för båda färgämnena vid behandling av pneumokocker 3,18,26. För båda komplex, konstaterade vi att fluorescensintensiteten hos DiBAC 4 (3) ökad före den ökade intensiteten i PI, vilket indikerar att depolarisation inträffat före brista och är därför en specifik händelse som induceras av våra bakteriedödande protein-lipid komplex av intresse. Denna distinktion är viktig att göra, eftersom bristning av membranet kan i sig orsaka ospecifik depolarisation. Att mäta och analysera både DiBAC 4 (3) och PI fluorescens kinetik samtidigt tillät oss att undersöka detta förhållande mellan de två membranhändelser, vilket är en ytterligare fördel med att använda fluorometri istället för flödescytometri.
Om du vill övervaka bakterie ion flux har det funnits några tidigare framgångar med hjälp av radioisotoper, inklusive mät upptag av45 Ca 2 + i pneumokocker 19,20, vilket vi också har använt i våra nya studier 18, 21. Men att arbeta med dessa radioaktiva joner har flera nackdelar. De kan vara dyra, tidskrävande och kladdigt, och kan också utsätta individen utför experimentet för att skada, beroende på den isotop av intresse. Dessutom är det svårt att följa snabba förändringar över tiden. Därför vände vi mot en alternativ mätmetod som sysselsätter acetoximetyl (AM) ester versioner av jon känslig fluorescerande indikator färgämnen. I sig själv är indikatorfärgämnet laddat och inte passerar genom membranet lätt, men med tillägg av den lipofila estergrupp, kan det nu oladdad molekyl passerar genom membranet av bakterien. När ni kommer till inredningen, bakterie esteraser klyva estergruppen, lämnar färgämnet fritt inuti cellen och ut igen, betydligt saktar dess förmåga att gå ur cellen och låta färgen to samlas inuti med tiden. Däremot har användningen av dessa ester färgämnen endast beskrivits i ett fåtal bakteriearter för att upptäcka förändringar i intracellulär Ca2 + 22-24 och H + 16, med varierande metoder för lastning, upptäckt, och framgång.
Med en önskan att övervaka förändringar i intracellulär Ca2 + och även K + och H +-nivåer i S. pneumoniae vid behandling med HAMLET och andra föreningar, vi skapat protokoll för att effektivt ladda fluorescerande indikatorfärgämnen i bakterieceller. Effektiv lastning in i bakterier som krävs både probenecid som ökar färgämne behålla genom att blockera anjon-transportörer och kraftdrivladdning, en patentskyddad förening från Life Technologies som ökar lasteffektiviteten. FURA-2/AM (detektering av Ca2 +), PBFI / AM (detektion av K +), och BCECF / AM (upptäcka H +) framgångsrikt laddas i både icke-inkapslat och inkapslade pneumokocker stregn som möjliggör mätning av de resulterande fluorescensmönster efter tillsats av jonoforer, såsom jonomycin (Ca 2 + frikopplare), valinomycin (K + frikopplare) och CCCP (H + frikopplare) med användning av en fluorescensdetektion plattläsare 18, 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse Bakteriekulturer
- Växande kultur för användning i experiment
- I ett 37 ° C värmeblock, tina en frusen lager-injektionsflaska med S. pneumoniae och lägga till dess innehåll till 9 ml färsk, förvärmd Todd-Hewitt-buljong med 0,5% jästextrakt (THY) i en total volym av 10 ml i en glasodlingsröret.
- Inkubera statiskt vid 37 ° C tills kulturen når mitten av log-fasen (Abs 600 nm ≈ 0,5-0,6).
2. Upptäcka membrandepolarisering och Rupture
- Förberedelse reagens
- Förbered en 50 mikroM lager av DiBAC 4 (3) i 100% DMSO, och en 2 mg / ml lager av PI i DDH 2 O. Den DiBAC 4 (3) lager är stabil vid -20 ° C i minst 6 månader. PI lagret är stabilt vid 4 ° C under åtminstone 6 månader.
- Wrap lager i folie för att skydda mot ljus.
- Loadingbakterier
- Pellebakteriecellerna från steg 1.2.2 genom centrifugering vid 2400 x g under 10 min vid rumstemperatur och tvättas två gånger genom avlägsnande av supernatanten, återsuspendera pelleten i 10 ml av 1 x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) och centrifugera igen vid 2400 x g under 10 min.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i PBS till den ursprungliga volymen. Detta kommer att ge ungefär 10 8 kolonibildande enheter av bakterier per ml. Ta 1 ml (räcker till 5 prover) av de tvättade cellerna och placera i en mikrocentrifugrör.
- För att dessa celler, tillsätt 25 | il av en 1 M filtersteriliserad stamlösning av glukos (framställd i DDH 2 O och filtrerades genom ett 0,45 ^ m filter) till en slutlig koncentration av 25 mM glukos, och inkubera i ett 37 ° C värmeblock för femton minuter. NOTERA: Detta ger energi för alla ATP-beroende membrankanalerna och cellulära komponenter. Behovet av detta steg kan variera, beroende på experimentet.
- Tillsätt 5 ìl av 50 mikroM DiBAC 4 (3) lager och 10 ul av 2 mg / ml PI lager. Detta ger slutkoncentrationer av 250 nM och 20 | ig / ml, respektive. Blanda noggrant genom att pipettera upp och ned flera gånger. Addera 200 pl av denna cellsuspension till varje provbrunn i en klar 96-brunnar.
- Detektion av fluorescens
- Placera plattan i en förvärmd (37 ° C), fluorescensdetektion plattläsare.
- Se till att lämpliga filter är på plats för DiBAC 4 (3) (490 nm excitation, 516 nm emission) och PI (535 nm excitation, 617 nm emission) upptäckt.
- För att möjliggöra (och samtidigt övervaka) jämvikt av DiBAC 4 (3) över membranet, ställa läsaren att ta fluorescensmätningar varje minut i ca 30-40 minuter, eller tills läsning stabiliseras, vilket fungerar som en "förbehandling" läsning.
- Mata ut plattan och tillsätt det experimentella medlet enligt val och Immediately placera plattan tillbaka i läsaren att fortsätta att övervaka DiBAC 4 (3) och PI fluorescens för önskad tid. Om behandling av flera prover på en gång, med hjälp av en flerkanalspipett kan vara bra att lägga till agenten samtidigt till alla brunnar.
- Exportera mätvärdena till en dataanalys program som Microsoft Excel. Plot fluorescens över tiden för att utvärdera membrandepolarisering och bristningar. Ökad fluorescens av DiBAC och PI visar att depolarisation och brott förekommer.
3. Detektera förändringar i intracellulär Ca 2 + eller K +-koncentrationer
- Förberedelse reagens och laddningsbuffert
- Förbered följande reagenser: 5 mM lager av jon känsliga fluorescerande färgämne (FURA-2/AM eller PBFI / AM, tillsätt lämplig mängd DMSO till ett rör innehållande 50 mikrogram i färg), "100x" probenecid (tillsätt 1 ml PBS till en 77 mg injektionsflaska). Den solubiliseradefärgämnen kan frysas vid -20 ° C en gång och är stabila i lösning under tre månader, medan probenecid är stabil i lösning vid -20 ° C under 6 månader.
- Förbered 1 ml 2x Laddar buffert enligt följande: I botten av en 15 ml koniskt plaströr, dosera 20 pl 100x kraftdrivladdning koncentrat (stabil vid 2-8 ° C i 6 månader), följt av 2 pl av 5 mM jon känsligt färgämne direkt i kraftdrivladdning. Kort Vortex att blanda. Addera 960 pl av PBS följt av 20 | il av 100x probenecid. Vortexa blandningen en sista gång. Wrap i folie för att skydda mot ljus.
- Laddar bakterierna med färgämne
- Pellets och tvätta mitten log fas bakteriekultur som beskrivs i 2.2.1. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 5 ml PBS för att göra en "2x" cellsuspension.
- Tillsätt 1 ml av 2x cellsuspensionen till 2x laddningsbuffert. Detta kommer att ge en slutlig volym av 2 ml och slutliga concentrsamhet i 1x kraftdrivladdning, 5 ^ M fluorescerande färg, och 1x probenecid. OBS: Denna suspension ger tillräckligt med volym för 10 prover eftersom varje prov väl för mätning kommer att innehålla 200 ^.
- Inkubera i 37 ° C vattenbad i 75 min, skyddat från ljus. OBS: Färgämnet laddas i bakteriecellerna i frånvaro av några glykolytiska substrat och i närvaro av probenecid för att minimera utflöde av färgämnet.
- WASH 1: Pelletera cellerna genom centrifugering vid 2400 x g under 10 min, avlägsna supernatanten och återsuspendera i 2 ml PBS innehållande 1x probenecid. WASH 2, 3: Upprepa steg 3.2.4 2x. Inkubera vid 37 ° C under ytterligare 30 min. Detta kommer att ge tid för bakterie esteraser för hydrolys av AM estergruppen från de internaliserade fluorescerande färger.
- WASH 4: Pelletera cellerna genom centrifugering vid 2400 x g under 10 min, avlägsna supernatanten och återsuspendera i 2 ml PBS innehållande 1x probenecid. OBS: Beroende på experiment, kan glukos läggas tillbaka hit för att ny energi bakterierna.
- Detektion av fluorescens
- Prewarm fluorescensdetektering plattläsare plattläsare till 37 ° C.
- För varje önskad prov, tillsätt 200 | il av de laddade celler (från steg 3.2.8) till brunnarna i en 96-brunnsplatta. (Utför följande steg för att färdig för en bra / prov i taget).
- Att etablera en baslinje läsning för en bra, plats platta i flourenscensprövning platt-läsare för att mäta fluorescens (340 nm excitation / 510 nm emission för "Värde 1" och 380 nm excitation / 510 nm emission för "Value 2") vid varje sekund under en minut.
- Mata platta, till behandling av valet till så bra (i en liten volym av ca 5 l), snabbt pipettera upp och ner några gånger för att blanda, och omedelbart placera tillbaka i flourenscensprövning platt-läsare för att läsa varje sekund för önskad tidslängd. (Om det iinsprutare som är förknippade med plattläsare finns tillgängliga, dessa kan också användas för att smidigt lägga den önskade behandlingen, vilket eliminerar behovet att stoppa läsning och mata ut plåt).
- Exportera mätvärdena till en dataanalys program som Microsoft Excel. Beräkna förhållandet mellan fluorescensvärden för varje tidpunkt genom att dividera Standard 1 av Standard 2, och plotta förhållandevärden på en graf.
4. Upptäcka förändringar i intracellulär pH
- Förberedelse reagens och kalibreringsbuffertar
- Förbered följande reagenser: 5 mM lager av BCECF / AM (. Tillsätt lämplig mängd DMSO till ett rör som innehåller 50 mikrogram av färgämnet Detta bestånd är stabilt vid -20 ° C i 3 månader), 100x probenecid (tillsätt 1 ml PBS till en 77 mg flaska),. 1 mM stam framställning av nigericin i etanol (krävs för att jämvikta intracellulära pH (pH-i) av de celler till pH för den omgivande bufferten Detta lager är stabell vid -20 ° C under 6 månader),. 0,5 mM stam karbonylgrupper cyanid 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) i DMSO (protonophore att frikoppla protonen drivkraft Detta lager är stabil vid -20 ° C under 6 månader)
- Förbered 10 ml av följande höga kalium buffertar: 135 mM KH 2 PO 4/20 mM NaOH (enbasiskt) och 110 mm K 2 HPO 4/20 mM NaOH (dibasiskt). Filtersterilisera med användning av ett 0,45 ^ m filter. (Dessa buffertar kan lagras vid 4 ° C fram till användning).
- Blanda de höga kaliumbuffertarna på de nödvändiga proportioner för att skapa höga kalium buffertar med minst 5-6 pH-värden mellan 6,5-8,0.
- Bered en ml av 2x laddningsbuffert på följande sätt: I botten av ett 15 ml koniskt plaströr och dispensera 40 | il av 100x kraftdrivladdning, följt av 20 | il av 5 mM jonkänsligt färgämne direkt i kraftdrivladdning. Kort Vortex att blanda. Addera 900 pl av PBS följt av 40 | il av 100x probenecid. Vortex blandningen en sista gång. Wrap i folie för att skydda mot ljus.
- Laddar bakterierna med färgämne
- Pellets och tvätta 8 ml mitten log fas bakteriekultur som beskrivs i 2.2.1. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 2 ml PBS för att göra en "4x" cellsuspension.
- Tillsätt 1 ml av den 4x cellsuspensionen till 2x laddningsbuffert. Detta kommer att ge en slutlig volym på 2 ml, och slutliga koncentrationer av 2x celler, 2x kraftdrivladdning, 50 ^ M fluorescerande färg, och 2x probenecid.
- Inkubera i 30 ° C vattenbad i 40 min, skyddat från ljus. OBSERVERA: Färgämnet laddas in i bakterieceller vid den lägre temperaturen av 30 ° C och i frånvaro av några glykolytiska substrat för att minimera utflöde av färgämnet.
- WASH 1: Pellet cellerna genom centrifugering vid 2400 xg under 10 minuter, ta bort supernatanten för att bli av med överskottsfärg, och resuspendera i 4 ml PBS innehållande 2x probenecid and 1 mM glukos (för att återställa skyddet bakterierna). WASH 2, 3: Upprepa steg 4.2.7 två gånger, med slutlig resuspension i 4 ml PBS (till en slutkoncentration på 1x celler) innehållande 2x probenecid och 10 mM glukos.
- Inkubera vid 37 ° C under 5 min. Detta kommer att möjliggöra för cellerna att helt sätta på och ge tid för bakteriella esteraser för att klyva AM estergruppen bort från interna BCECF.
- Etablering bakgrundsfluorescens och in vivo-kalibreringskurva
- Prewarm fluorescensdetektering plattläsare plattläsare till 37 ° C.
- För att bestämma bakgrundsfluorescens, filter-sterilisera ca 500 | il av den laddade och strömförande bakteriesuspension (från steg 4.2.7) för att avlägsna bakterierna, och tillsätt 200 | il av filtratet till den brunn i 96-brunnars platta.
- Placera plattan i flourenscensprövning platt-läsare för att mäta fluorescens (490 nm excitation / 530 nm emission för"Värde 1" och 440 nm excitation / 530 nm emission för "Value 2") under 1 minut. Denna bakgrund fluorescens bör subtraheras före beräkningen av nyckeltal för både kalibreringskurvan och experimentella prover.
- För att få en in vivo-kalibreringskurvan, tvätta 500 l alikvoter av de laddade och strömförande celler från steg 4.2.7 gång och återsuspendera i höga kalium buffertar vid olika pH-värden (som sträcker sig från 6,5 till 8,0).
- Lägg 20 pM nigericin till proverna jämvikta intracellulära pH-värdet för cellerna att pH för den omgivande bufferten och inkubera vid 37 ° C under 5 min. Addera 200 pl av buffertkombinationer bakterier / pH till brunnarna i en 96-brunnsplatta.
- Placera plattan i fluorescensdetektion plattläsare för att mäta fluorescens i ett par minuter för att etablera en stadig avläsning för varje brunn. Exportera mätvärdena till en dataanalys program som Microsoft Excel.
- Efter avdrag för baBAKGRUND fluorescensvärdena, beräkna förhållandet mellan fluorescensvärden genom att dividera Standard 1 av Standard 2. Plotta förhållandevärden för varje pH-buffert för att skapa kalibreringskurvan. (En kalibreringskurva bör genereras för varje ny sats av laddade celler, eftersom mängden av fluorescerande färgämne som laddas in i de bakterier kan variera varje gång).
- Mätning av förändringar i intracellulärt pH
- För varje önskad prov, tillsätt 200 l av de laddade och strömförande celler (från steg 4.2.7) till brunnarna i en 96-brunnar.
- Placera plattan i fluorescensdetektion plattläsare och mäta fluorescensen för proven var 5 sek i 5 min.
- Ta ut plattan och tillsätt 10 mikroM CCCP till en brunn (fungerar som positiv kontroll för att minska intracellulära pH) och den experimentella agenten (s) av intresse för de andra brunnarna. För att kunna jämföra deras effekter över tiden, tillsätt CCCP och agenter för val samtidigt med hjälp av amultichannel pipett.
- Omedelbart tillbaka plattan i plattläsare och fortsätta att mäta fluorescens var 5 sek i 10 min. Som en ytterligare kontroll, mata ut plattan och tillsätt 20 | iM nigericin till alla prover för att jämna ut pH-i hos bakterierna att pH för den omgivande bufferten och läs under 5 min.
- Efter subtraktion av bakgrundsfluorescensvärdena, beräkna förhållandet mellan fluorescens för varje prov. Interpolera pH i för varje läsning från kalibreringskurvan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För alla experiment, det finns en samplings-och uppsättning villkor som föreligger i varje brunn. Således representerar varje spårning fluorescensintensiteten för en hel population av bakterier med tiden. Resultaten bör vara lätt tolkningsbar, med en tydlig distinktion mellan fluorescens av de behandlade proverna och att de obehandlade kontrollerna. Kinetiken och graden av en observerad förändring i fluorescens kan ge information om den möjliga mekanismen och omfattningen av den händelse som skall övervakas.
När utforska membran polaritet, bakterierna behöver för att inkuberas med DiBAC under ca 40 min för att möjliggöra ekvilibrering av färgämnet över membranet, vilket indikeras av den stadiga minskningen och efterföljande utjämning av fluorescens i Figur 1A före behandling. Som visas i figur 1B, inte PI inte kräver jämvikt, eftersom dess fluorescerande signal är stabil under hela första 40 min inkubation, but sin närvaro tillsammans med DiBAC är till hjälp för att övervaka membranbrott samtidigt med polaritet. Depolarisation och bristning av bakterierna indikeras av en ökning av fluorescensintensiteten av både färgämnen. Andra medel som kan depolarisation och bristning, såsom detergenter (natriumdeoxikolat 18), uncouplers eller jonoforer (CCCP), kan också tillsättas för att demonstrera dessa händelser genom att använda denna metod.
För FURA-2/AM, PBFI / AM och BCECF / AM, är kvoten mellan två fluorescerande signaler beräknas, och en ökning eller minskning av detta förhållande motsvarar den intracellulära Ca2 +-(figur 2), K ^ (fig 3 ) och H ^ (Figur 4) koncentrationer, respektive. Vid tillsats av kalciumjonofor jonomycin, Ca 2 + strömmar in i cellen orsakar en ökning i fluorescensförhållande (Figur 2). Tillsats av valinomycin har motsatt effekt, vilket K+ För att strömma ut ur cellen och minska den intracellulära koncentrationen, vilket indikeras av en minskning i fluorescensförhållande (Figur 3). BCECF möjliggör mätningen av intracellulärt pH genom att först skapa en kalibreringskurva (figur 4A) i närvaro av olika buffertar med känt pH. En minskning av fluorescensförhållandet av färgämnet motsvarar en sänkning av pH, vilket kan ses efter tillsats av protonophores CCCP eller nigericin, som kollapsar protongradient (Figur 4B).
Figur 1. Övervakning membranstörningar. S. pneumoniae odlades med (A) DiBAC och (B) PI samtidigt under 40 min för att möjliggöra ekvilibrering av DiBAC över membrane. Vid slutet av denna inkubation (pil), PBS (obehandlade) eller HAMLET (behandlad) tillsattes och proverna läst under ytterligare en timme. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Detektera förändringar i intracellulära kalciumnivåer. Pneumokocker laddades med FURA-2/AM och behandlades (pil) med PBS (obehandlade) eller kalciumjonofor jonomycin (positiv kontroll). Förhållandet mellan fluorescensvärden presenteras. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 3. Detektera förändringar i intracellulära kaliumnivåerna. Pneumokocker laddades med PBFI / AM och behandlades (pil) med PBS (obehandlade) eller kalium-jonofor valinomycin (positiv kontroll). Förhållandet mellan fluorescensvärden presenteras. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 4. Upptäcka förändringar i intracellulära protonnivåer. (A) Standardkurva för intracellulära pH-kalibrering. (B) Pneumokocker laddades med pH-känsligt färgämne BCECF-AM, och vartvättades och återsuspenderades i PBS + glukos. Efter inspelning baslinjevärdena, vid den första pilen, PBS (svart), den protonophore CCCP (100 pM) eller HAMLET (100 | ig / ml eller 6 M), sattes till bakterierna och fluorescensen mättes över tid. Vid den andra pilen nigericin (20 ^ M) tillsattes för att helt skingra trans proton gradient av alla prover. Klicka här för att visa en större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trots begränsningen att storleken presenterar för att använda klassiska elektrofysiologiska metoder för att upptäcka förändringar i polaritet och integritet av membranet och förändringar av jon koncentrationer inom bakterier, har vi beskrivit ett sätt att mäta dessa händelser i S. pneumoniae med användning av fluorescerande färgämnen. Våra protokoll är den första i sitt slag som beskrivs för pneumokocker och en av de få som beskrivs för bakteriearter i allmänhet. Genom att använda en fluorescensdetektering plattläsare, kan dessa händelser mätas i små, 200 l volym prover av bakterier, med fluorescens detekteras från den enskilda populationen av bakterier med tiden. Kinetiken och förändringar i fluorescensintensitet kan användas för att kvalitativt bestämma vad som händer till membran polaritet eller integritet, eller nivåer av Ca 2 +, K + eller H + inuti bakterierna. Kvantitativt sett kan fluorescensintensitetsvärdena också användas för att beräkna graden av depolarization, bristning, kalciumupptag, kaliumutflöde, eller pH-förändring observerats i ett prov jämfört med en annan, som ger viktig information om en mekanism av intresse. Dessutom bör våra protokoll vara användbar som en utgångspunkt för att ladda andra AM fluorescerande färger, vilket möjliggör studier av en rad andra cellulära händelser i en rad olika bakteriearter. Vi har redan varit framgångsrika i att tillämpa några av dessa protokoll i Staphylococcus aureus 21.
Vid användning av AM-färgämnen, är viktigt för färgämne lastning och för att uppnå den efterföljande hydrolys nödvändiga för färgämnet att svara på de mål-joner inom bakterierna och ge den motsvarande fluorescensförändringar riklig inkubationstiden. Last kinetik kan variera mellan bakteriestammar på grund av flera faktorer, inklusive skillnader i bakterieytan arkitektur (kapsel närvaro, membran fluiditet, närvaro av effluxpumpar etc.) Samt i den kemiska strukturen of färgämnet. För att uppnå maximal laddning för bakteriestammen och färgämne av intresse, finns det flera parametrar i våra protokoll som kan kräva modulering innefattande: inkubering varaktighet, inkubationstemperatur, näringstillgång, kraftdrivladdning koncentration och probenecid koncentration. För att få framgång lastning, är mindre viktigt än att visa att positiva kontroller, till exempel tillägg av jonoforer, ger en signal i rätt riktning och / eller visar linjäritet i kalibreringskurvan fluorescenssignalen intensitet. För att optimera inläsning av en ökning av kraftdrivladdning och Probenicide koncentration följt av en sänkning av temperaturen för att undvika extrusion av färgämnet är föredraget att ökande färgämneskoncentration som kan resultera i extracellulär färgning som kommer att förblanda signalen. Under utvecklingen av våra protokoll, var vi kan ladda våra färgämnen av intresse i både vildtyp inkapslade pneumokocker stam D39 och oinkapslad stammen R36A 25.Dock fann vi att vi kunde uppnå optimal laddning vilket indikeras av fluorescerande avläsningar som leder till ökade kvoter som använder R36A för Fura-2 och PBFI experiment med 37 ° C inkubationstemperatur, medan en lägre inkuberingstemperatur i kombination med högre kraftdrivladdning och probenecidtabletter koncentrationer fungerade bättre för lastning av BCECF i D39. Även specifik signal intensitet kan variera mellan experiment, den kvotmetriska karaktär av mätningarna gav resultat med hög reproducerbarhet och liten spridning.
För fluorescensmätningar av prover, användning av programvaran som medföljer mest avancerade plattläsare möjliggör justeringar av olika detektionsparametrar, inklusive detektionshastighet, detektionskänslighet, och läsa varaktighet, för att nämna några. Detta tillåter forskare att hitta den optimala känsligheten för detektion av den speciella händelse som övervakas. För optimal tolkning av resultat, är det viktigt att stabila baslinjer fluorescence och linjära standardkurvor upprättas, eftersom det kan finnas interanalysvariationer i mängden av färgämne som är närvarande, ekvilibrerad över membranet, eller laddas in i bakterier, och hydrolyseras. Ger tid för färgämnet ekvilibrering över bakteriemembranet före behandling av något slag är särskilt viktigt när man använder DiBAC 4 (3) för att medge en stabiliserad fluorescensnivån före behandling. Dessutom, inklusive alla rätt kontroller i varje enskild analys är avgörande för exakt dataanalys, eftersom de experimentella tillsatser som förs in bakteriesuspensionen som ska testas kan själva autofluoresce på de speciella våglängder av upptäckt eller kan ospecifikt modifiera fluorescens indikatorfärgämne genom direkta interaktioner.
Vi känner igen några potentiella problemområden i samband med de metoder som vi har beskrivit här. Till skillnad från den karbocyaninfärgämnet DiOC 2 (3), DiBAC 4 (3) är en bisoxonol färgämne som inte är proportionerlig, så medan den karbocyaninfärgämnet kan svara för förändringar i cellvolym, DiBAC 4 (3) inte kan. Därmed kan det bli förändringar i nivån av fluorescens som motsvarar förändringar i cellvolymen. Vi är dock inte märker att detta är ett stort problem, eftersom pneumokocker har en styv cellvägg som inte tillåter betydande förändringar i volym utan att sprängas sönder bakterierna. För att undersöka bakterie jonflöden, kan känsligheten hos jon känsliga färgämnen variera beroende på jon av intresse och graden av förändring i sin koncentration. Dessutom är användningen av fluorescerande färgämnen experimentellt inte så direkt metod, eftersom användningen av radioisotoper. Men beroende på jon av intresse, undersöka fluorescens är ett mycket mer praktiskt alternativ när man överväger både ekonomiska och säkerhetsmässiga begränsningar som arbetar med användning av radioisotoper. Således, de metoder som beskrivs i detta manuskript ger nya och konsekvent strategies till bättre studie membran polaritet, integritet, och transporthändelser och i bakteriella system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen för att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Bill och Melinda Gates Foundation (Grant 53085), JR Oishei Foundation och The American Lung Association (Grant RG-123721-N) till APH, och NIH (NIDCD) gemenskap F31DC011218 till EAC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd-Hewitt broth | Bacto, BD Diagnostics | 249240 | |
| Yeast Extract | Bacto, BD Diagnostics | 212750 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2) | Invitrogen (GIBCO) | ||
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | DMSO |
| DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol) | Molecular Probes | B-438 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Make up in deionized water |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| PowerLoad | Molecular Probes | P10020 | 100x concentrate |
| Probenecid | Molecular Probes | P36400 | Make 100x stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial |
| Fura-2/AM | Molecular Probes | F1221 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| PBFI/AM | Molecular Probes | P1267 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | |
| KH2PO4 | JT Baker | 3246-01 | monobasic |
| NaOH | JT Baker | 5565-01 | |
| K2HPO4 | JT Baker | 4012-01 | dibasic |
| BCECF/AM | Molecular Probes | B1170 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| CCCP | Sigma-Aldrich | Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm, dissipating the electrical potential and the H+ gradient. | |
| Culture tube | VWR | 53283-802 | Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | Spectronic 20D+ | |
| 15 ml Plastic conical tube | Corning | 430790 | |
| Clear 96-well polystyrene microtiter plate | Fisher Scientific | 12-565-501 | |
| Plate reader | BioTek | Synergy 2 Multi-Mode | |
| Gen5 software | BioTek | Gen5™ Software |
References
- Hakansson, A., Zhivotovsky, B., Orrenius, S., Sabharwal, H., Svanborg, C. Apoptosis induced by a human milk protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (17), 8064-8068 (1995).
- Hakansson, A., et al. A folding variant of alpha-lactalbumin with bactericidal activity against Streptococcus pneumoniae. Mol. Microbiol. 35 (3), 589-600 (2000).
- Hakansson, A. P., Roche-Hakansson, H., Mossberg, A. K., Svanborg, C. Apoptosis-Like Death in Bacteria Induced by HAMLET, a Human Milk Lipid-Protein Complex. PLoS One. 6 (3), (2011).
- Kohler, C., Gogvadze, V., Hakansson, A., Svanborg, C., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. A folding variant of human alpha-lactalbumin induces mitochondrial permeability transition in isolated mitochondria. Eur. J. Biochem. 268 (1), 186-191 (2001).
- Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (Δψ m) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8 (2), 115-128 (2003).
- Dominguez, D. C. Calcium signalling in bacteria. Mol. Microbiol. 54 (2), 291-297 (2004).
- Corratge-Faillie, C., Jabnoune, M., Zimmermann, S., Very, A. A., Fizames, C., Sentenac, H. Potassium and sodium transport in non-animal cells: the Trk/Ktr/HKT transporter family. Cell Mol. Life Sci. 67 (15), 2511-2532 (2010).
- Szabo, I., Petronilli, V., Zoratti, M. A patch-clamp study of Bacillus subtilis. Biochim. Biophys. Acta. 1112 (1), 29-38 (1992).
- Zoratti, M., Petronilli, V., Szabo, I. Stretch-activated composite ion channels in Bacillus subtilis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 168 (2), 443-450 (1990).
- Novo, D., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. Accurate flow cytometric membrane potential measurement in bacteria using diethyloxacarbocyanine and a ratiometric technique. Cytometry. 35 (1), 55-63 (1999).
- Novo, D. J., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. Multiparameter flow cytometric analysis of antibiotic effects on membrane potential, membrane permeability, and bacterial counts of Staphylococcus aureus and Micrococcus luteus. Antimicrob. Agents Chemother. 44 (4), 827-834 (2000).
- Shapiro, H. M. Membrane potential estimation by flow cytometry. Methods. 21 (3), 271-279 (2000).
- Shapiro, H. M. Microbial analysis at the single-cell level: tasks and techniques. J. Microbiol. Methods. 42 (1), 3-16 (2000).
- Bashford, C. L., Chance, B., Smith, J. C., Yoshida, T. The behavior of oxonol dyes in phospholipid dispersions. Biophys. J. 25 (1), 63-85 (1979).
- Suzuki, H., Wang, Z. -Y., Yamakoshi, M., Kobayashi, M., Nozawa, T. Probing the transmembrane potential of bacterial cells by voltage-sensitive dyes. Anal. Sci. 19 (9), 1239-1242 (2003).
- Breeuwer, P., Abee, T. Assessment of the membrane potential, intracellular pH and respiration of bacteria employing fluorescence techniques. Mol. Microb. Ecol. Manual. 8, 1563-1580 (2004).
- Mortimer, F. C., Mason, D. J., Gant, V. A. Flow cytometric monitoring of antibiotic-induced injury in Escherichia coli using cell-impermeant fluorescent probes. Antimicrob. Agents Chemother. 44 (3), 676-681 (2000).
- Clementi, E. A., Marks, L. R., Duffey, M. E., Hakansson, A. P. A Novel Initiation Mechanism of Death in Streptococcus pneumoniae Induced by the Human Milk Protein-Lipid Complex HAMLET and Activated during Physiological Death. J. Biol. Chem. 287 (32), 27168-27182 (2012).
- Trombe, M. C., Laneelle, G., Sicard, A. M. Characterization of a Streptococcus pneumoniae mutant with altered electric transmembrane potential. J. Bacteriol. 158 (3), 1109-1114 (1984).
- Trombe, M. C. Characterization of a calcium porter of Streptococcus pneumoniae involved in calcium regulation of growth and competence. J. Gen. Microbiol. 139 (3), 433-439 (1993).
- Marks, L. R., Clementi, E. A., Hakansson, A. P. Sensitization of Staphylococcus aureus to Methicillin and Other Antibiotics In Vitro and In Vivo in the Presence of HAMLET. PLoS ONE. 8 (5), (2013).
- Futsaether, C. M., Johnsson, A. Using fura-2 to measure intracellular free calcium in Propionibacterium acnes. Can. J. Microbiol. 40 (6), 439-445 (1994).
- Tisa, L. S., Adler, J. Chemotactic properties of Escherichia coli mutants having abnormal Ca2+ content. J. Bacteriol. 177 (24), 7112-7118 (1995).
- Werthen, M., Lundgren, T. Intracellular Ca2+ mobilization and kinase activity during acylated homoserine lactone-dependent quorum sensing in Serratia liquefaciens. J. Biol. Chem. 276 (9), 6468-6472 (2001).
- Avery, O. T., MacLeod, C. M., McCarty, M. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Induction of transformation by a dexoxyribonuceic acid fraction isolated from pneumococcus type III. J. Exp. Med. 79, 137-158 (1944).
- Clementi, E. A., Wilhelm, K. R., Schleucher, J., Morozova-Roche, L. A., Hakansson, A. P. A Complex of Equine Lysozyme and Oleic Acid with Bactericidal Activity against. PLoS One. . 8, (2013).
