Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

פרדיגמה נזק קלה לשימוש ברומן רשתית מחקרי התחדשות בדג הזברה למבוגר

Published: October 24, 2013 doi: 10.3791/51017
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Anatomy and Cell Biology, Wayne State University School of Medicine, 2Department of Opthalmology, Wayne State University School of Medicine

Summary

פרוטוקולי נזק קלים מרובים כבר תאר לקולטני אור וכתוצאה מכך לנזק לגרום תגובת התחדשות רשתית בדג זברה מבוגר. פרוטוקול זה מתאר שיטה משופרת, שניתן להשתמש בבעלי החיים פיגמנט ושפוגע ברוב המכריע של מוט וקולטני אור חרוט על פני כל הרשתית.

Abstract

ניוון רשתית הנגרמת אור (LIRD) משמש בדרך כלל בשני מכרסמים ודג זברה לניזק מוט וקולטניים אור חרוט. בדג זברה מבוגר, ניוון photoreceptor מפעיל תאי גלייה מולר להזין מחדש את מחזור התא ולייצר אבות חולפים-הגברה. אבות אלה ממשיכים להתרבות כפי שהם נודדים לאזור הפגוע, שבו הם בסופו להצמיח קולטניים אור חדש. נכון לעכשיו, ישנן שתי פרדיגמות LIRD-בשימוש נרחב, כל אחד מהם התוצאות בדרגות שונות של אובדן photoreceptor והבדלים מקבילים בתגובת ההתחדשות. ככלים יותר גנטיים ותרופתיים זמינים כדי לבדוק את תפקידם של גנים בודדים של ריבית במהלך רגנרציה, יש צורך בפיתוח פרדיגמה LIRD חזקה. כאן אנו מתארים פרוטוקול LIRD שגורם לאובדן נרחב ועקבי של שני קולטניים אור מוט וחרוט שביש לנו שילוב השימוש בשתי טכניקות LIRD הוקמו בעבר. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות מורחב לשימוש בבעלי החיים פיגמנט, אשר מבטל את הצורך בשמירה על קווים מהונדסים של עניין על רקע בקן ללימודי LIRD.

Introduction

ניוון רשתית הנגרמת אור (LIRD) משמש בדרך כלל בשני מכרסמים ודג זברה לניזק מוט וקולטניים אור חרוט. בדג זברה מבוגר, ניוון photoreceptor מפעיל תאי גלייה מולר להזין מחדש את מחזור התא ולייצר אבות חולפים-הגברה. אבות אלה ממשיכים להתרבות כפי שהם נודדים לאזור הפגוע, שבו הם בסופו להצמיח קולטניים אור חדש. נכון לעכשיו, ישנן שתי פרדיגמות LIRD-בשימוש נרחב, כל אחד מהם התוצאות בדרגות שונות של אובדן photoreceptor והבדלים מקבילים בתגובת ההתחדשות. ככלים יותר גנטיים ותרופתיים זמינים כדי לבדוק את תפקידם של גנים בודדים של ריבית במהלך רגנרציה, יש צורך בפיתוח פרדיגמה LIRD חזקה. כאן אנו מתארים פרוטוקול LIRD שגורם לאובדן נרחב ועקבי של שני קולטניים אור מוט וחרוט שביש לנו שילוב השימוש בשתי טכניקות LIRD הוקמו בעבר. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות מורחב לשימוש בבעלי החיים פיגמנט, אשר מבטל את הצורך בשמירה על קווים מהונדסים של עניין על רקע בקן ללימודי LIRD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת השימוש בבעלי החיים בבית הספר לאוניברסיטה ויין סטייט לרפואה.

1. עיבוד אפל

  1. העברה ~ 10 דגים בוגרים בקן או פיגמנט ממערכת הדיור הרגיל למתחם חשוך. אם זמין, השתמש במתחם אפל שבנוי לתוך מודול דיור דג הזברה, אשר מאפשר זרימת מים רגילה באמצעות הטנק. (אם מערכת כזו אינה זמינה, למקם את האקווריום במתחם חשוך לגמרי, והקפד לאוורר את הדגים עם חמצן).
  2. שמור את הדגים בחושך במשך 10 ימים. כשמאכילים את החיות או הוספת דגים חדשים לתיבה הכהה, הקפד להעביר מהר ככל האפשר, כדי למנוע חשיפת הדג לתקופה ארוכה של אור.

2. חשיפה לאור UV

  1. ודא את כוח למקור UV הוא כבוי. הסר את נימה אור UV מstereomicroscope ניאון.
    1. השתמש הפוך15 ס"מ קוטר זכוכית צלחת פטרי (או משהו בגובה 2 ס"מ דומה) כמעמד לנימת UV. קלטת צלחת פטרי לספסל המעבדה.
    2. קלטת חוט להט אור UV לחלק עליון של צלחת פטרי ההפוכה. מסדרים כך ש~ 2 מ"מ של סוף שנתי ה סככות נימה צלחת פטרי.
  2. השג כוס זכוכית 250 מ"ל. לכסות חצי מהחלק התחתון, צדדים, וחלק אחורי של הכוס עם נייר אלומיניום, כדי לוודא שצד "המבריק" של רדיד פרצופים הפנימי של הכוס. אם הכוס הוא סיים את לימודיו, לכסות את המחצית המנוסחת של הכוס בנייר כסף, והשאיר את המחצית ברורה של הכוס חשופה.
  3. מלא את כוס 250 מ"ל עם 100 מיליליטר מים ממערכת מתקן הדגים.
  4. מניחים את כוס 250 מ"ל בכוס ליטר 4. מלא את כוס L 4 עם מים עד למפלס המים הוא גם עם קו המים 100 מ"ל בכוס 250 מ"ל.
  5. הוסף מקסימום של 10 בעלי חיים שטופלו בחושך לכוס 250 מ"ל. לכסות את כוס 250 מ"ל עם חתיכה קטנה של אלומיניוםנייר כסף.
  6. הנח את המנגנון כולו כוס מייד בסמוך לחוט להט UV. החוט צריך להיות נוגע ללב מחוץ לכוס L 4 ומול החלק החשוף של כוס 250 מ"ל. ודא כי כוס 250 מ"ל מרוכזת בחלק התחתון של כוס L 4.
  7. מקם מסך גדול, אטום מאחורי כוס 4L, המאפשר לבעלי החיים שנחשפו, אך למנוע כל אנשי מעבדה מלראות את קצה חוט UV. אזהרה: ודא שהמחסום הזה הוא במקום לפני הפעלת כוח למקור קרינת UV.
  8. הפעל את מקור כוח UV. הגדרת טיימר למשך 30 דקות. הנח כל מה תוויות אזהרה הדרושות כדי להבטיח כי אנשי מעבדה תמימים לא לחשוף את עצמם בטעות לקרינת UV.
  9. לאחר 30 דקות, לכבות את מקור כוח UV. הסר את כוס 250 מ"ל עם הדגים. הערה: אם סבבים רבים של חשיפה לקרינת UV נדרשים, תנו את מקור כוח להתקרר (~ 20 דקות) לפני שחוזר על פרוטוקול החשיפה. הקפד להחליף tהוא 100 מיליליטר מים עם מים טריים למערכת כל חשיפה. המים בכוס L 4 לא צריכים להיות מוחלפים.

3. חשיפה לאור מנורת הלוגן

  1. מעבירים את הדג מכוס 250 מ"ל לתוך האקווריום אקריליק ברור 1.8 ליטר. מלא את המכל לסימן הצפה.
  2. להגדיר את אזור טיפול אור מנורת ההלוגן. השג ארבע 250 מנורות הלוגן W שירות מחנות לחומרי בניין מקומי. , מול שתי מנורות באותו הכיוון לארגן מלבד 29 ס"מ במרכז. מסדרים את שתי מנורות האחרות באופן דומה.
    1. הנח את הסט השני של מנורות, כך שהם עומדים בפני את הסט הראשון של מנורות, והשאירו ~ 73 ס"מ בין שני הסטים של מנורות. זה יוצר אזור טיפול אור בצורת מלבן של 29 ס"מ על 73.
  3. השג מאוורר קטן מחנות לחומרי בניין מקומי. הנח את המאוורר במרחק שווה בין שני הסטים של מנורות, ממש מחוץ לאזור טיפול אור.
  4. הנח שני טנקים 1.8 ליטר מלאים במים במרכזאזור טיפול אור, במרחק שווה בין שני הסטים של מנורות. המרחק בין המנורות והקיר החיצוני של הטנק צריך להיות ~ 29 ס"מ. הערה: גם אם טיפול 10 דגים רק בטנק אחד 1.8 ליטר, השתמש בהסדר זה. שני הטנקים יש צורך לשמור על טמפרטורת המים של כל טנק בטווח המתאים.
  5. הנח aerator חמצן בכל המכל.
  6. כיסוי כל טנק עם מכסי אקריליק ברורים, והשאיר את פער ~ 2 ס"מ בקצה הקרוב ביותר למאוורר. מסדרים את המאוורר כך שהוא יפוצץ את האוויר לתוך הפער הזה. הנח מדחום באחד או שני הטנקים.
  7. הפעל את כוח האורות, המאוורר, וaerators. לשמור על טיפול באור לתקופה של עד 4 ימים. הדגים לא צריכים להיות מוזנים במהלך טיפול האור, כמו זה ישפיע על איכות מים ותוצאה במתח יותר לבעלי החיים.
  8. מעקב אחר רמת טמפרטורה ומים על בסיס יומי. לשמור על הטמפרטורה ב30-33 ° C. במידת צורך, להתאים את המהירות ו / או מרחק בין הטנקים וli אוהדghts.
    1. למעלה את כל המכל עם מים מערכת כנדרש, בדרך כלל מדי יום.
    2. השתמש תמיד בדג זברה מבוגר בריא (בדרך כלל 6-9 חודשים של גיל) כדי לשמור על שיעור הישרדות של כמעט 100%. עם זאת, אם דגים נמצאו מתים במכל, להסיר אותו מייד ולהחליף את המים בכל רחבי הטנק.

4. אוסף רקמות

  1. 48 שעות לאחר תחילת טיפול אור ההלוגן להסיר את הדגים מאזור הטיפול.
    1. הכן מקבע פורמלדהיד האתנולית טרי (1 פורמלדהיד 37% חלק, 9 חלקים 100% אתנול).
    2. להרדים דג הזברה עם מנת יתר של חומר הרדמה של 2-phenoxyethanol (0.4 מ"ג / ליטר).
    3. מעבירים את דג הזברה מורדמים למגבת נייר. Enucleate העין באמצעות מלקחיים מעוקלים.
    4. הנח את עיני enucleated במקבע וחנות O / N ב 4 ° C.
  2. Cryoprotect העיניים.
    1. לשטוף את העיניים ב5% סוכרוז 1x PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר, ואז להחליף עם1x 5% סוכרוז PBS טרי במשך שעה 2. בשלב הבא, לשטוף את העיניים ב30% סוכרוז 1x PBS O / N ב 4 ° C. לשטוף את העיניים ב1:1 (חלקים שווים) של מדיום הקפאת רקמות ו30% סוכרוז 1x PBS O / N ב 4 ° C.
  3. הטמע את העיניים ב% מדיום הקפאת רקמה 100 ולאחסן ב -80 ° C. אוריינט את העיניים כדי שcryosectioning של הרקמה מתבצע על ציר הגב / הגחון.
  4. Cryosection רקמות ומניחים על שקופיות זכוכית. שקופיות חמות לשעה 2 ב 55 ° C. שקופיות חנות ב -80 ° C או לבצע אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית באופן מיידי.
  5. בצע אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית על רקמה מחולק ותמונה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי 40,51.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול טיפול האור עד כה תאר היה בהשוואה לכל שיטה פרטנית של LIRD. בבעלי חיים לבקנים מבוגרים חשוכים שטופלו (איורים 3-5), בטיפולים באור הבודדים שהסתיימה באובדן משמעותי של מוט (איור 3) וקונוס (איור 4) קולטני אור. עם זאת, שני הטיפולים בודדים נפגעו בעיקר קולטניים אור במחצית הגב של הרשתית, ומשאיר את רשתית הגחון מוגנת יחסית מהטיפולים באור (איורים 3 ו -4). בנוסף, בהשוואה לטיפול באור ההלוגן, אור UV הטיפול פגום יותר קולטני אור חרוט במחצית הגב של הרשתית (השווה דמויות 4B עם C, בהתאמה). שילוב של הטיפולים באור UV והלוגן הביא להפסד גדול יותר באופן משמעותי לשניהם מוט וקולטניים אור חרוט לאורך הרשתית, במידה רבה, ומבטל את neuroprotection של מחצית הגחון של הרשתית (איורים 3 ו -4). בהשוואה לשיטות LIRD הבודדות, גידול מקביל בריבוי נצפה גם ברשתית הגחון כאשר שימש פרוטוקול הטיפול המשולב האור (איור 5).

בעלי החיים פיגמנט הם עמידים יותר בפני LIRD בשל אפיתל הפיגמנט ברשתית, אשר סופג אור ומגן על קולטני האור מphototoxicity. בעלי החיים פיגמנט כצפוי, מותאמים הכהה היו כמעט עמידים לחלוטין לטיפול באור ההלוגן לבד (האיורים 6B, J, ו-N). מצאנו כי 48 שעות לאחר הופעת אור, קולטניות אור מוט הופחתו ברשתית הגבי, אבל לא רשתית הגחון (איורים 6E, F, ו-Q). גרעיני photoreceptor קון היו נוכחים במספרים רגילים (איור 6R). לעומת רשתיות שלא טופלו, אור הלוגןטיפול לבד גם לא להגדיל את התפשטות תאי גליה מולר 48 שעות לאחר הופעת אור (7 ב F ואיורים). בבעלי חיים לבקנים, טיפול באור UV לבד גרם לנזק גדול יותר למעט שני מוט וקונוס קולטני אור ברשתית הגבי (איורים 3I ו4I). עם זאת, בבעלי החיים פיגמנט, הטיפול באור UV לבד לא הפחית מוט או מספר תאי חרוט (איורים 6C, G, K, O, Q, R ו) באופן משמעותי. בנוסף, טיפול בקרינה UV לבד עוררה תגובת משובי חלשה במחצית הגב של הרשתית בחיות פיגמנט (איור 7 ג) בלבד. בניגוד לתוצאות LIRD הבודדות, שילוב של הטיפולים באור UV והלוגן גרם לנזק גדול יותר באופן משמעותי וphotoreceptor תגובת רגנרציה בבעלי החיים פיגמנט. חשוב מכך, אובדן משמעותי של שתי מוטות קונוסים נצפה בשניהם dorsa ליטר וגחון רשתיות (איורים 6D, H, L, P, Q, R ו). בהשוואה לשיטות LIRD לא טופלו ופרט, גידול מקביל בריבוי נצפה גם בחצי גם גב וגחון של הרשתית כאשר שימש פרוטוקול הטיפול המשולב האור (איור 5).

איור 1
איור 1. תמונה המתארת ​​את הגדרת טיפול אור ההלוגן. שני סטים של ארבע מנורות הלוגן 250 W היו במרווחי 29 ס"מ בכל צד של שני טנקי אקריליק 1.8 L ברורים. Aerator והצינורות הונחו כדי לא לחסום את האור. את המכסים של מיכלי היו סדוקים 2 ס"מ, כדי לאפשר זרימת אוויר מהמאוורר. מדחום הונח באחד הטנקים לטמפרטורה כדי להיות במעקב. arget = "_blank"> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2
איור 2. תמונה המתארת ​​את הגדרת טיפול אור UV. מקור אור UV מstereomicroscope ניאון היה מאובטח קבוע לצלחת פטרי זכוכית ~ 2 ס"מ מעל גבי הספסל. כוס 250 מיליליטר זכוכית, עטופה בנייר הכסף באופן חלקי, הייתה מלאה יהיה 100 מ"ל של מים במערכת. הדג היה ממוקם בתוך כוס 250 מ"ל. כוס 250 מ"ל הייתה מרוכזת בתוך כוס L 4, שהיה מלא במי מערכת לרמה של המים בכוס 250 מ"ל. כוס L 4 הוצבה בסמוך לחוט להט האור מרוכז בכוס 250 מ"ל. מגן אטום גדול הוצב מסביב לכל ההתקנה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

עבור: לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> איור 3
איור 3. אובדן רוד photoreceptor בדג זברת בקן בעקבות נזק קל פרדיגמות שונות חלקים מרשתית המבוגר Tg (nrd: EGFP). / ALB immunolabeled עם GFP להראות צפיפות מוט photoreceptor (ירוק) בגב (לספירה) וגחון (EH) חצאים של הרשתית ., E) לפני תחילת אור (0 שעות), גרעיני photoreceptor מוט EGFP-חיוביים (ONL) ומגזרים חיצוניים (ROS) ניתן דמיינו. ב ', ו) בתחילת 48 שעות הבאות הלוגן אור (HLT), ROS הקטום וגרעיני מוט פחות באופן משמעותי (אני) היו נוכחים בגב, אבל לא רשתית הגחון. CG) ב48 שעות לאחר 30 דקות של חשיפה לקרינת UV (hpUV), גרעיני מוט פחות באופן משמעותי נכחו ברשתית הגב וגחון לעומת 0 שעות (C, G < /> חזק), אבל לא 48 טיפולי hlt (G, I). ד"ה) תחילת 48 שעות הבאות של טיפול משולב אור (30 דקות חשיפת UV ואחריו טיפול הלוגן; UV 48 HLT), כמעט ולא היו נוכח בROS רשתיות הגבי או הגחון, בנוסף לאובדן משמעותי של גרעיני photoreceptor מוט (אני) . אני) כימות גרעיני photoreceptor מוט על פני 300 מיקרומטר של הגב המרכזי או רשתית הגחון. הבדלים מובהקים (p ≤ 0.05) בין קבוצות מוצגים כ: "" לשונה מ0 שעות, "ב" לשונה מ48 hlt ו" ג "לשונה מ48 hpUV. בר סולם בפנל מייצג 50 מיקרומטר וחל על לוחות AH. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

iles/ftp_upload/51017/51017fig4.jpg "width =" 500px "/>
איור 4. הפסד כפול חרוט בדג זברת בקן בעקבות נזק קל פרדיגמות שונות. חלקים מרשתית דג הזברה בקן מבוגר immunolabeled עם Zpr-1 כדי להראות קונוסים כפולים (זהב) בגב (AD) ו (EH) חצי הגחון של הרשתית בעקבות כל אחד מהאור פרדיגמות נזק (48 hlt, 48 hpUV, וUV 48 HLT)., E) ב 0, גרעיני חרוט כפולים שעה נכחו ברשתיות גב וגחון. ב ', ו) בשעת 48 hlt, קונוסים כפולים באופן משמעותי פחות נכחו ב רשתית הגחון בלבד (F, אני). CG) ב48 hpUV, קונוסים כפולים באופן משמעותי פחות (אני) וכמות גדולה של פסולת היה נוכח ברשתית הגבי בלבד (C), בעוד שלא חל שינויים נצפו ברשתית הגחון (G). ד"ה) בUV 48 hlt, קונוס הכפול פחות באופן משמעותיs (אני) ופסולת מעט מאוד הייתה נוכחת ברשתיות גב וגחון. אני) כימות קונוסים כפולים על פני 300 מיקרומטר של הגב המרכזי או רשתית הגחון. הבדלים מובהקים (p ≤ 0.05) בין קבוצות מוצגים כ", "לשונה מ0 שעות," ב "לשונה מ48 hlt ו" ג" לשונה מ48 hpUV. בר סולם בפנל מייצג 100 מיקרומטר וחל על לוחות AH. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 5
איור 5. שינויים הוא תגובה בעקבות התפשטות נזק קל פרדיגמות שונות. חלקים מרשתית דג הזברה בקן מבוגר immunolabeled עם PCNA להראות התפשטות תאים (אדום) ב הגבי (לספירה) והגחון (EH) חצאים של הרשתית בעקבות כל אחת מהפרדיגמות נזק הקלה (48 hlt, 48 hpUV, וUV 48 HLT). ע"א) בשעה 0, ההתפשטות נעדרה מהשכבה הגרעין הפנימית ( INL). ב ', ו) בשעת 48 hlt, תאים בודדים נכחו בINL על פני הרשתית והגב בחלק קטן של רשתית הגחון. CG) ב48 hpUV, עמודות של תאי אב נכחו ברשתית הגב, בעוד שרק תאים בודדים נכחו בחלק קטן של רשתית הגחון. D, H) בhlt UV 48, עמודים גדולים של תאי אב היו נוכחים פני רשתית הגב וגחון. בר סולם בפנל מייצג 100 מיקרומטר וחל על לוחות AH. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

עבור: לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> איור 6
איור 6. רוד ואובדן קונוס photoreceptor בדג זברת פיגמנט לאחר פרדיגמות נזק קלות שונות חלקים מרשתית דג הזברה (א.ב.) פראי סוג מבוגר מוכתם בTO-PRO-3 כדי להציג את כל הגרעינים (AP; כחול). וimmunolabeled עם Zpr-3 כדי להראות מוט מגזרים חיצוניים (AH; מג'נטה) או Zpr-1 לקונוסים כפולים (IP; זהב) ב( MP EH,) הגבי (הספירה, IJ) וגחון חצאים של הרשתית בעקבות כל אחת מהפרדיגמות נזק הקלה (48 hlt, 48 hlt hpUV, וUV +48). AH) ירידה משמעותית בגרעיני photoreceptor מוט נכחו ברשתית הגבי ב48 hlt (B, Q) וברשתית הגב וגחון בUV 48 hlt (D, H, Q) . ה-IP) למרות שהגרעינים היו חרוטים יתר עליי n הרשתית הגבי ב48 hpUV (K), ללא ירידה משמעותית בגרעיני חרוט כפולים נכחו ב48 או 48 hlt hpUV (JK, לא, R). ירידה משמעותית בגרעיני קונוס נכחו ברשתית הגב וגחון בUV 48 hlt (L, P, R). QR) כימות המוט photoreceptor וגרעיני חרוט כפולים על פני 300 מיקרומטר של הגב המרכזי או רשתית הגחון. הבדלים מובהקים (p ≤ 0.05) בין קבוצות מוצגים כ", "לשונה מ0 שעות," ב "לשונה מ48 hlt ו" ג" לשונה מ48 hpUV. בר סולם בפנל מייצג 200 מיקרומטר וחל על לוחות AH. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

g7.jpg "width =" 500px "/>
איור 7. תגובת ריבוי בדג זברת פיגמנט לאחר פרדיגמות נזק קלות חתכים שונים רשתית. מדג הזברה (א.ב.) פראי סוג מבוגר immunolabeled עם PCNA להראות התפשטות תאים (אדום) בגב (לספירה) והגחון (EH) חצאים של הרשתית לאחר שכל אחד מן הפרדיגמות אור נזק (48 hlt, 48 hpUV, ו48 hlt UV). לספירה) ברשתית הגבי, רק כמה תאים בודדים נכחו בINL ב48 hlt ו48 hpUV (B, C), ואילו עמודות של תאי אב נכחו בUV 48 hlt (ד '). EH) ברשתית הגחון, לא חל שינויים בהתפשטות נצפו פרט בUV 48 hlt (H), שבה עמודות זמן של תאי אב היו נוכחים. בר סולם בפנל מייצג 100 מיקרומטר וחל על לוחות AH.7/51017fig7highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן אנו מראים כי שילוב של חשיפה לקרינת UV קצרה עם תוצאות חשיפה לאור בהירות מתמשכות באובדן photoreceptor נרחב ותגובת התחדשות חזקה. בהשוואה לשיטות LIRD הבודדות, בשילוב שיטה זו גם בפרוטוקול היעיל ביותר לפגוע בשתי מוטות קונוסים בשני החצאים של הרשתית. חשוב מכך, טיפול זה הוא יעיל בבעלי החיים פיגמנט כמו גם בעלי חיים לבקנים.

למרות שאנו מספקים ראיות לכך שאת תוצאות הפרוטוקול בשילוב בניזק נרחב יותר ועקבי בהשוואה לשיטות LIRD הבודדות, יש לדון בשיקולים מדעיים לפני בחירה בפרדיגמה LIRD. הנתונים שלנו מראים שהשיטה המשולבת צריכה להיות מנוצל כאשר רקמת הרשתית כולה נאסף לניתוח (פרוטאומיקה כלומר, בזמן אמת PCR). מצאנו כי השיטה המשולבת הייתה בגודל הגדול ביותר הנגע, ואחרי חשיפת ההלוגן, ולבסוף החשיפה לקרינת UV. אנו ממליציםכי שיטה המשולבת לשמש גם כאשר חוקרים גן או מסלול שיכול להשפיע באופן דיפרנציאלי מוט והתחדשות חרוט. אם זה לא אפשרי מסיבות מעשיות, הנתונים שלנו מצביעים על כך שהחשיפה לקרינת UV היא השיטה הטובה ביותר הבאה למחקרים אלה, אם הניתוח מוגבל לרשתית הגבי המרכזית.

שיקולים מעשיים גם מוצדקים בעת בחירת שיטת LIRD המתאימה. הדאגה הראשונה היא העלות של הציוד הדרוש. כל הפרוטוקולים דורשים תקופה ממושכת של הסתגלות כהה (מידע לא מוצג). מתחם כהה עצמאי שבנוי לתוך מודול דיור דג הזברה הוא מאוד נוח, אבל לא הכרחי. יכולה לשמש גם קופסא קרטון, אם טיפול נלקח לקלטת או לאטום את התפרים, ואת הפרמטרים המים נמצאים תחת פיקוח. שיטת LIRD מבוססת הלוגן היא חסכונית ונוחה מאוד. ניתן לרכוש את כל הפריטים מתחת ל -100 דולרים בחנות לחומרי בניין מקומי ולהגדיר את לוקח רק כמה דקות. Tהוא חסרון מעשי היחיד של שיטה זו הוא אי הנוחות של עבודה באותו החדר כמו טיפול באור. האורות לייצר כמות טובה של חום בזמן ההרצה ברציפות במשך 4 ימים ועוצמת האור היא גם מסיחה את הדעת ועלולה להזיק לראייה אנושית. שיטות UV ומשולבות דורשות מקור קרינת UV, שאינו זמין לכל מעבדה. בנוסף, יש לנקוט בזהירות רבה על מנת להבטיח את שלומם של חברי המעבדה בעת ביצוע טיפול אור UV. וכך, בעוד שזה יותר נוח שיש את מנגנון אור ההלוגן בשטח מבודד, חששות הבטיחות של טיפול UV מחייבים מרחב כזה. זה הופך להיות מטרד נוסף אם מקור UV משמש לטיפול האור גם משמש בדרך כלל למיקרוסקופ פלואורסצנטי שוכנו ב" חדר מיקרוסקופ "או ליבת הדמיה. ביצוע סבבים רבים של טיפולים לבקרה UV וקבוצות ניסוי של בעלי חיים יחייב כיבוי חדר מיקרוסקופ לשלוחהאורך ensive של זמן.

אולי היתרון הגדול ביותר לשימוש בשיטה המשולבת הוא היכולת לבצע מחקרים על בעלי החיים התחדשות רשתית פיגמנט. אנחנו מראים שגם תוצאות שיטה בודדות באובדן משמעותי של מוטות קונוסים ברשתית הגב וגחון. בניגוד לכך, תוצאות פרדיגמה LIRD המשולבות ברמות דומות של מוט נרחב ואובדן חרוט בשתי חיות פיגמנט ולבקן. היכולת ליישם את שיטת LIRD זה לבעלי החיים פיגמנט חוסכת שטח החוקר המשמעותי, זמן ועלויות לטיפול בבעלי החיים דיאם (אם בכלל), כפי שהוא מבטל את הצורך ליצור ולשמור על קווים מהונדסים של עניין על רקע בקן ללימודי התחדשות רשתית . יחד, אנו חשים כי היתרונות המדעיים ומעשיים להכריע את הטרדות הפוטנציאליות של שיטת LIRD המשופרת הזה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לXixia ואו לגידול דגים מעולים ותמיכה טכנית. עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומי לבריאות מענקי R21EY019401 (RT) וP30EY04068 (RT), והזנק כספים לRT, כולל מענק בלתי מוגבל של מחקר כדי למנוע עיוורון לאוניברסיטה ויין סטייט, מחלקת העיניים. JT נתמכה על ידי תומס ג ראמבל מסופקת על ידי בית הספר למוסמכים ויין סטייט מלגה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UV light source Leica EL600
Glass Petri dish (150 x 20 mm) Sigma-Aldrich/Pyrex CLS3160152BO
250 ml glass beaker Sigma-Aldrich/Pyrex CLS1000250
4 L glass beaker Sigma-Aldrich/Pyrex CLS10004L
Aluminum foil Fisher 01-213-105
250 W halogen lamps Workforce 265-669
1.8 L clear acrylic tanks Aquaneering ZT180T
1.8 L clear acrylic tank lids Aquaneering ZT180LCL
Fan Honeywell HT-900
Aerator Tetra 77853-900
Thermometer Cole-Parmer YO-08008-58
Bent forceps (5/45) World Precision Instruments 504155

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J. Neurosci. 27, 7028-7040 (2007).
  2. Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J. Neurosci. 26, 6303-6313 (2006).
  3. Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. Regeneration of inner retinal neurons after intravitreal injection of ouabain in zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).
  4. Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
  5. Thummel, R., et al. Pax6a and Pax6b are required at different points in neuronal progenitor cell proliferation during zebrafish photoreceptor regeneration. Exp. Eye Res. 90, 572-582 (2010).
  6. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J. Neurobiol. 44, 289-307 (2000).
  7. Vihtelic, T. S., Soverly, J. E., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Retinal regional differences in photoreceptor cell death and regeneration in light-lesioned albino zebrafish. Exp. Eye Res. 82, 558-575 (2006).
  8. Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Muller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
  9. Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev. Neurobiol. 67, 1009-1031 (2007).
  10. Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Dev. Biol. 6, 36 (2006).
  11. Thummel, R., et al. Characterization of Muller glia and neuronal progenitors during adult zebrafish retinal regeneration. Exp. Eye Res. 87, 433-444 (2008).
  12. Thummel, R., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Enright, J. M., Hyde, D. R. Inhibition of Muller glial cell division blocks regeneration of the light-damaged zebrafish retina. Dev. Neurobiol. 68, 392-408 (2008).
  13. Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. J. Comp. Neurol. 518, 800-814 (2010).
  14. Morris, A. C., Scholz, T. L., Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. Genetic dissection reveals two separate pathways for rod and cone regeneration in the teleost retina. Dev. Neurobiol. 68, 605-619 (2008).
  15. Bignami, A., Dahl, D. The radial glia of Muller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp. Eye Res. 28, 63-69 (1979).
  16. Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog. Retin. Eye Res. 25, 397-424 (2006).
  17. Bringmann, A., Wiedemann, P. Muller glial cells in retinal disease. Ophthalmologica. 227, 1-19 (2012).
  18. Eisenfeld, A. J., Bunt-Milam, A. H., Sarthy, P. V. Muller cell expression of glial fibrillary acidic protein after genetic and experimental photoreceptor degeneration in the rat retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 25, 1321-1328 (1984).
  19. Anderson, D. H., Guerin, C. J., Erickson, P. A., Stern, W. H., Fisher, S. K. Morphological recovery in the reattached retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 168-183 (1986).
  20. Bruce, A. E., Oates, A. C., Prince, V. E., Ho, R. K. Additional hox clusters in the zebrafish: divergent expression patterns belie equivalent activities of duplicate hoxB5 genes. Evol. Dev. 3, 127-144 (2001).
  21. Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Res. Bull. 49, 377-391 (1999).
  22. Lewis, G. P., Fisher, S. K. Muller cell outgrowth after retinal detachment: association with cone photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 1542-1545 (2000).
  23. Fischer, A. J., Bongini, R. Turning Muller glia into neural progenitors in the retina. Mol. Neurobiol. 42, 199-209 (2010).
  24. Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends Mol. Med. 16, 193-202 (2010).
  25. Close, J. L., Liu, J., Gumuscu, B., Reh, T. A. Epidermal growth factor receptor expression regulates proliferation in the postnatal rat retina. Glia. 54, 94-104 (2006).
  26. Das, A. V., et al. Neural stem cell properties of Muller glia in the mammalian retina: regulation by Notch and Wnt signaling. Dev. Biol. 299, 283-302 (2006).
  27. Ikeda, T., Puro, D. G. Regulation of retinal glial cell proliferation by antiproliferative molecules. Exp. Eye Res. 60, 435-443 (1995).
  28. Liu, B., et al. Wnt signaling promotes muller cell proliferation and survival after injury. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54, 444-453 (2013).
  29. Osakada, F., et al. Wnt signaling promotes regeneration in the retina of adult mammals. J. Neurosci. 27, 4210-4219 (2007).
  30. Wan, J., et al. Preferential regeneration of photoreceptor from Muller glia after retinal degeneration in adult rat. Vision Res. 48, 223-234 (2008).
  31. Wan, J., Zheng, H., Xiao, H. L., She, Z. J., Zhou, G. M. Sonic hedgehog promotes stem-cell potential of Muller glia in the mammalian retina. Biochem. Biophys. Res. Commun. 363, 347-354 (2007).
  32. Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Muller glial cells. J. Comp. Neurol. 509, 225-238 (1002).
  33. Chang, G. Q., Hao, Y., Wong, F. Apoptosis: final common pathway of photoreceptor death in rd, rds, and rhodopsin mutant mice. Neuron. 11, 595-605 (1993).
  34. Marc, R. E., et al. Extreme retinal remodeling triggered by light damage: implications for age related macular degeneration. Mol. Vis. 14, 782-806 (2008).
  35. Portera-Cailliau, C., Sung, C. H., Nathans, J., Adler, R. Apoptotic photoreceptor cell death in mouse models of retinitis pigmentosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 974-978 (1994).
  36. Noell, W. K., Walker, V. S., Kang, B. S., Berman, S. Retinal damage by light in rats. Invest. Ophthalmol. 5, 450-473 (1966).
  37. Wenzel, A., Grimm, C., Samardzija, M., Reme, C. E. Molecular mechanisms of light-induced photoreceptor apoptosis and neuroprotection for retinal degeneration. Prog. Retin. Eye Res. 24, 275-306 (2005).
  38. Cicerone, C. M. Cones survive rods in the light-damaged eye of the albino rat. Science. 194, 1183-1185 (1976).
  39. La Vail, M. M. Survival of some photoreceptor cells in albino rats following long-term exposure to continuous light. Invest. Ophthalmol. 15, 64-70 (1976).
  40. Thomas, J. L., Nelson, C. M., Luo, X., Hyde, D. R., Thummel, R. Characterization of multiple light damage paradigms reveals regional differences in photoreceptor loss. Exp. Eye Res. 97, 105-116 (2012).
  41. Qin, Z., et al. FGF signaling regulates rod photoreceptor cell maintenance and regeneration in zebrafish. Exp. Eye Res. 93, 726-734 (2011).
  42. Craig, S. E., et al. The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 3244-3252 (2010).
  43. Morris, A. C., Schroeter, E. H., Bilotta, J., Wong, R. O., Fadool, J. M. Cone survival despite rod degeneration in XOPS-mCFP transgenic zebrafish. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 4762-4771 (2005).
  44. Nelson, C. M., Hyde, D. R. Muller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina. Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).
  45. Powell, C., Elsaeidi, F., Goldman, D. Injury-dependent Muller glia and ganglion cell reprogramming during tissue regeneration requires Apobec2a and Apobec2b. J. Neurosci. 32, 1096-1109 (2012).
  46. Ramachandran, R., Reifler, A., Wan, J., Goldman, D. Application of Cre-loxP recombination for lineage tracing of adult zebrafish retinal stem cells. Methods Mol. Biol. 884, 129-140 (2012).
  47. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/Dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15858-15863 (2011).
  48. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Insm1a-mediated gene repression is essential for the formation and differentiation of Muller glia-derived progenitors in the injured retina. Nat. Cell Biol. 14, 1013-1023 (2012).
  49. Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev. Cell. 22, 334-347 (2012).
  50. Morris, A. C., Forbes-Osborne, M. A., Pillai, L. S., Fadool, J. M. Microarray analysis of XOPS-mCFP zebrafish retina identifies genes associated with rod photoreceptor degeneration and regeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 2255-2266 (2011).
  51. Thummel, R., Bailey, T. J., Hyde, D. R. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J. Vis. Exp. (58), e3603 (2011).

Tags

Neuroscience גיליון 80 דג הזברה ניוון רשתית רשתית קולטי אור גליה מולר נזק קל
פרדיגמה נזק קלה לשימוש ברומן רשתית מחקרי התחדשות בדג הזברה למבוגר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thomas, J. L., Thummel, R. A Novel… More

Thomas, J. L., Thummel, R. A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (80), e51017, doi:10.3791/51017 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter