Neuroscience

成年斑马鱼视网膜再生研究中使用的一种新型的光损伤范式

Published: October 24, 2013 doi: 10.3791/51017

¹Department of Anatomy and Cell Biology, Wayne State University School of Medicine, ²Department of Opthalmology, Wayne State University School of Medicine

Summary

多个光损伤协议已损坏感光细胞，从而诱发成年斑马鱼视网膜的再生反应。此协议描述了一种改进的方法，可以用在着色的动物，并在整个视网膜杆和视锥细胞，损害绝大多数。

Abstract

光诱导的视网膜变性（LIRD）是常用的啮齿动物损伤杆和视锥细胞和斑马鱼。在成年斑马鱼，光感受器变性触发穆勒胶质细胞重新进入细胞周期和产生瞬态放大祖。这些前体细胞继续增殖，他们迁移到受损区域，他们最终产生新感光。目前，有两个广泛使用LIRD的范例，其中每个感光损失和相应的差异在再生反应在不同程度的结果。随着遗传学和药理学工具可用于测试单个基因在再生过程中的利益的作用，有必要制定一个强大的LIRD范式。这里我们描述一个LIRD协议，导致在杆和锥感光体，其中结合使用的两个以前建立LIRD技术的广泛和一致的损失。此外这个协议可以延长使用色素的动物，从而消除了需要保持白化背景LIRD研究的转基因株系的利息。

Introduction

光诱导的视网膜变性（LIRD）是常用的啮齿动物损伤杆和视锥细胞和斑马鱼。在成年斑马鱼，光感受器变性触发穆勒胶质细胞重新进入细胞周期和产生瞬态放大祖。这些祖细胞继续增殖，因为他们迁移到受损区域，在那里他们最终产生新的光感受器。目前，有两个广泛使用LIRD的范例，其中每个感光损失和相应的差异在再生反应在不同程度的结果。随着遗传学和药理学工具可用于测试单个基因在再生过程中的利益的作用，有必要制定一个强大的LIRD范式。这里我们描述一个LIRD协议，导致在杆和锥感光体，其中结合使用的两个以前建立LIRD技术的广泛和一致的损失。此外这个协议可以延长使用色素的动物，从而消除了需要保持白化背景LIRD研究的转基因株系的利息。

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Protocol

在韦恩州立大学医学院动物使用委员会批准，在本协议中所述的所有程序。

1。暗适应

转让〜10成年白化或色素的鱼，从正常的住房制度进入一个黑暗的外壳。如果可用，建成斑马鱼的正常水流通过水箱外壳模块，它允许使用一个黑暗的外壳。（如果这样的系统不可用，放置鱼缸在一个完全黑暗的外壳，确保通气鱼与氧气）。
保持10天的鱼在黑暗中。当喂养动物或加入新鱼暗箱，确保尽可能快地移动，以避免将鱼暴露在相当长的一段光。

2。紫外线照射

确保紫外光源电源关闭。卸下UV光灯丝从荧光体视显微镜。
1. 使用倒置直径15厘米的玻璃培养皿（或一些类似的2厘米的高度）作为一个独立的UV长丝。用胶带将培养皿中的实验室工作台上。
2. 带UV光长丝顶部倒培养皿。这样排列〜2毫米的灯丝的端部悬伸的陪替氏培养皿。
获得的250毫升的玻璃烧杯中。量½底部，侧面，和背面的烧杯中，用铝箔，确保“闪亮”的箔面一侧的内部烧杯。如果毕业烧杯，烧杯带箔覆盖措辞一半，留下清晰的烧杯中露出的一半。
填充在250毫升烧杯中，用100毫升的水从鱼的设施系统。
将250毫升烧杯中4升烧杯中。填充的4升烧杯中的水，直到水位甚至与100毫升水的250毫升烧杯中的线。
添加最多10暗处理动物250毫升烧杯中。量的250毫升烧杯中，用一小片铝陪衬。
将整个烧杯装置，紧邻的UV灯丝。，灯丝应接触的外侧的4升烧杯中，并面临着的250毫升烧杯中的暴露部分。确保集中在底部的4升烧杯中的250毫升烧杯中。
后面的4L烧杯中的一个大的，不透明的屏幕的位置，允许暴露的动物，但是，为了防止任何从看到紫外线灯丝的前端的实验室工作人员。警告：确保这个障碍在接通电源前紫外光源。
打开UV电源。将定时器设置为30分钟。放置以确保任何必要的警示标签，不知情的实验室的工作人员不小心把自己暴露于紫外线辐射。
30分钟后，切断紫外线的动力源。取出250毫升烧杯中的鱼。注：如果有多个回合的紫外线的照射是必需的，让电源降温（约20分钟），然后重复曝光的协议。确保替代T他每次曝光系统用新鲜水100毫升水。在4升烧杯中的水并不需要更换。

3。卤素灯光曝光

从250毫升烧杯中的鱼转移到一个1.8升的透明亚克力鱼缸。油箱加满到溢出标记。
卤素灯的光处理区域。获得四个250瓦的卤素灯实用灯，从当地的五金商店。面对两个灯在同一个方向，在中央分开安排29厘米。以类似的方式排列的两个灯。
1. 将第二组灯，使它们面对所述第一组灯，留下约73厘米之间的两组灯。这将创建一个29×73厘米的矩形光治疗区域。
获得一个小风扇，从当地的五金商店。将风扇两组灯之间的距离相等，外面的光的治疗区域。
将两个装满水的1.8升罐的中心光治疗区域，两组灯之间的距离相等。灯和水箱的外壁上之间的距离应为〜29厘米。注意：即使只处理10鱼在一个1.8升的油箱，使用这样的安排。需要这两个罐，每个罐的水的温度保持在适当的范围之内。
每罐放置增氧机增氧。
每个水箱盖透明压克力盖，留1〜2厘米的缝隙年底最接近风扇。安排，使风扇将空气吹入这个差距。一个温度计放置在罐中的一者或两者。
打开电源灯，风扇和通风装置。保持光治疗4天。鱼不应该被送入光治疗期间，因为这会影响水质和造成更多的压力的动物。
每天监控温度和水位。的温度保持在30-33℃。如果有必要，调整风扇转速和/或坦克和李之间的距离亮灯。
1. 每罐顶过水系统，通常需要每天。
2. 始终使用健康的成年斑马鱼（一般为6-9个月的年龄）保持近100％的成活率。然而，如果鱼被发现死在坦克，取出立即更换整个水箱中的水。

4。组织收集

的卤光治疗在发病后48小时去除鱼从治疗区域。
1. 准备新鲜乙醇甲醛固定液（1份37％的甲醛，9份100％的乙醇）。
2. 安乐死斑马鱼与麻醉剂过量的2 - 苯氧基乙醇（0.4毫克/升）。
3. 将安乐死斑马鱼的纸巾。用弯钳Enucleate眼睛。
4. 将去核的眼睛在固定液和存储O / N在4°C
Cryoprotect眼睛。
1. 在5％蔗糖的1倍PBS洗眼睛，在室温下30分钟，然后更换新鲜的5％蔗糖的1倍PBS 2小时。接下来，洗眼睛，30％的蔗糖1X PBSØ/ N在4°C。在4℃下以1:1的（相等的部分）的组织的冷冻保存液和30％蔗糖的1倍PBSö/ N洗眼睛
嵌入眼睛在100％组织冷冻介质和存储于-80°C东方的眼睛，使的组织cryosectioning的背/腹轴。
组织冰冻切片，在载玻片上。 2小时，在55℃的暖幻灯片商店幻灯片在-80°C或立即执行标准免疫组化。
执行标准切片组织的免疫组化和荧光显微镜图像^40,51。

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Representative Results

此前所述的光治疗方案相比，每一个人的LIRD方法。在暗处理成年的白化动物（ 图3-5），个人光疗法造成重大损失棒（ 图3）和锥感光器（ 图4）。然而，无论是单独的治疗方法主要损坏感光体在背侧视网膜一半，留下相对保护的光的治疗方法（图3和4）的腹侧视网膜。此外，相比与卤素灯处理，UV光处理损坏的视锥细胞在背视网膜一半（比较图4B与C，分别）。结合紫外线和卤素的光疗法导致显着更大的损失，整个视网膜杆和视锥细胞，在很大程度上消除的neuroprotection的腹侧视网膜一半（图3和4）。与个别LIRD方法相比，也观察到一个相应的增加的增殖的组合光治疗方法使用时，在腹侧视网膜（ 图5）。

色素的动物更耐，LIRD由于视网膜色素上皮细胞，吸收光线和保护光感受器光毒性。正如预期的那样，暗适应色素的动物几乎完全耐卤素光治疗（ 图6B，J，和N）。我们发现，光发病后48小时，在背侧视网膜，视杆细胞减少，但腹侧视网膜（ 图6E，F和Q）。锥感光细胞核中存在正常的数字（ 图6R）。与未经处理的视网膜相比，卤素灯单独治疗也没有增加穆勒胶质细胞增生后48小时发病轻（ 图7B和F）。在白化动物，紫外线治疗稍大在背的视网膜（ 图3I和4I）杆和视锥细胞的损害导致。然而，在动物色素，紫外线治疗没有显着减少杆或视锥细胞数（ 图6C，G，K，O，Q，和R）。此外，UV处理唯独引起的视网膜色素动物（ 图7C）背半弱再生反应。在对比个别LIRD结果，结合UV和卤光处理导致显着更大的光感受器损伤和再生反应的色素沉着动物。重要的是，两个杆状和锥状细胞中观察到显着的损失同时背部升和腹侧视网膜（ 图6D所示，H，L，P，Q和R）。与未处理的和个别的LIRD方法相比，也观察到一个相应的增加的增殖在背侧和腹侧半的视网膜的组合光治疗方法时，使用了（ 图5）。

图1。照片描绘了卤素光治疗设置两套四个250瓦卤素灯间隔29厘米，两侧的两个清晰的1.8升丙烯酸坦克。曝气器和油管分别放置，以免阻碍光线。坦克的盖子被破获2厘米，让气流从风扇。温度计，放置在坦克的温度进行监测。ARGET =“_blank”>点击此处查看大图。

图2。照片描绘的UV光处理的设置，从荧光体视显微镜，UV光源，牢固地固定到工作台的顶部折〜2厘米的玻璃培养皿中。 250毫升玻璃烧杯中，部分铝箔包裹，充满将系统水100毫升。鱼被放置在250毫升烧杯中。为中心的250毫升烧杯中，在一个4升烧杯中，填充系统水的250毫升烧杯中的水的水平。的4升烧杯中，放在相邻的中心在250毫升烧杯中的光灯丝。一个大的不透明屏蔽周围放置整个安装。点击此处查看大图。

图3。感光杆损失白化斑马鱼中各种光损伤的范例。成人TG（NRD：EGFP）/ ALB视网膜部分免疫标记与GFP显示在背感光杆密度（绿色）（AD）和腹侧（EH）减半的视网膜A，E）发病轻（0小时），EGFP阳性杆的的感光细胞核（ONL），外段（ROS）之前可以可视化，B，F）在48小时以下的卤素灯发病（HLT），截断ROS显着较少的棒核（I），目前在背，但不腹侧视网膜CG）在48小时后30分钟的UV曝光（hpUV），存在显着较少的棒核背侧和腹侧视网膜比0小时（C，G < / STRONG>），而不是48的HLT治疗（G，I）。 DH）48小时后发病的组合光治疗（30分钟的紫外线照射，然后由卤素处理; UV +48 HLT），几乎没有ROS背侧或腹侧视网膜，除了一个重大损失杆感光细胞核（I） I）定量跨越300微米中央背侧或腹侧视网膜杆状感光细胞核。被描述为：“”不同，“B”从0小时为从48 HLT和“C”不同于48 hpUV的不同群体之间的显着差异（P≤0.05）。面板比例尺A代表50微米，适用于板啊。点击此处查看大图。

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图4。双锥损失白化斑马鱼后各种光损伤范式。成年白化斑马鱼视网膜部分ZPR-1免疫标记显示双球菌（金）在背（AD）和腹侧（EH）半的视网膜后，每个光背侧和腹侧视网膜损害范式（48 HLT，48 hpUV，UV +48 HLT）A，E）0小时，双锥形核B，F）在48 HLT，显著减少双球菌存在于腹侧视网膜（F，I）。 CG）于48 hpUV，显著减少双球菌（I）和大量碎片目前在背视网膜（C），而没有变化，观察在腹侧视网膜（G）。 DH）在紫外线+48 HLT，显著减少双锥（I）和非常小的碎片背侧和腹侧视网膜。 I）双跨300微米中央背侧或腹侧视网膜视锥细胞的量化。被描述为“，一个”从0小时，“B”不同为从48 HLT和“C”不同于48 hpUV的不同群体之间的显着差异（P≤0.05）。面板比例尺为100μm和适用于面板AH。 点击此处查看大图。

图5。变化是成年白化斑马鱼免疫标记与PCNA 增殖反应后各种光损伤范式。视网膜节细胞增殖（红色）显示背（AD）和腹侧（EH）减半后的视网膜每个的光损伤范式（48 HLT 48 hpUV，UV +48 HLT）。AE）在0小时，增殖缺席从内核层（ 积分非线性（INL））B，F）48 HLT，单祖细胞是视网膜背侧和腹侧视网膜的一小部分跨在INL本CG）在48 hpUV，祖细胞的列是存在于视网膜背，而只有单系祖细胞存在于一小部分视网膜腹侧D，H）在紫外线+48 HLT，大柱跨越背侧和腹侧视网膜祖细胞。面板比例尺为100μm和适用于面板AH。 点击此处查看大图。

图6。成年野生型（AB）的斑马鱼视网膜节TO-PRO-3染色显示所有原子核（AP;蓝色）和免疫标记ZPR-3显示杆杆和视锥感光损失在斑马鱼色素各种光损伤的范例。外段（品红）或ZPR-1双球菌（IP黄金）在背（AD，IJ）和腹侧（EH，MP）减半后视网膜的光损伤范式（48 HLT，48 hpUV和UV +48 HLT）AH）出席在背视网膜杆感光细胞核显着下跌48的HLT（B，Q）和背侧和腹侧视网膜UV +48 HLT（D，H，Q） IP）虽然锥核肥大我 n的背在48 hpUV（K），没有显着减少双锥核视网膜在48 HLT或48 hpUV的（JK，NO，R）。 UV +48 HLT（L，P，R）的背侧和腹侧视网膜锥核显著下降。QR）量化跨300微米中央背侧或腹侧视网膜感光杆和双锥形核。被描述为“，一个”从0小时，“B”不同为从48 HLT和“C”不同于48 hpUV的不同群体之间的显着差异（P≤0.05）。面板比例尺A代表200微米，适用于板啊。点击此处查看大图。

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图7。半色素斑马鱼的各种光损伤的范例。从成人与PCNA免疫标记显示细胞增殖（红色）在背侧（AD）和腹侧（EH）的野生型（AB）的斑马鱼的视网膜部分的增殖反应的视网膜后的每一个光损害范式（48 HLT，48 hpUV，和UV +48 HLT）AD）在视网膜背48 HLT和48 hpUV的（B，C）的INL，只有少数几个单系祖细胞存在，而列的祖细胞是目前在UV +48 HLT（D）。EH）在腹侧视网膜增殖，没有变化观察除了在紫外线+48 HLT（H），时间列祖细胞。面板比例尺为100μm，适用于板啊。7/51017fig7highres.jpg“目标=”_blank“>点击此处查看大图。

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Discussion

在这里，我们提供持续的强光曝晒普遍的感光损失和强大的再生反应的结果，结合短的紫外线照射。这个相结合的方法相比与个人LIRD方法，也是最有效的协议，损害双方的两部分的视网膜杆和视锥。重要的是，这种治疗是有效的颜料的动物，以及患白化病的动物。

虽然我们提供的证据表明与个别LIRD方法相比更为广泛和一致的损伤合并协议结果，科学的考虑，应该讨论之前选择一个LIRD的范例。我们的数据表明，相结合的方法时，应当使用的整个视网膜组织收集进行分析（即蛋白质组学，实时PCR）。我们发现，相结合的方法有最大的病灶大小，然后由卤素曝光，和最后的UV曝光。我们建议相结合的方法也可用于调查时差异可能影响杆和锥再生的基因或途径。基于实际的原因，如果这是不可能的，我们的数据表明，暴露于紫外线下一个最好的方法，这些研究是有限的，如果分析中央背视网膜。

实用的考虑也有理由时选择适当的LIRD的方法。第一个问题是所必需的设备的成本。所有的协议，需要长时间的暗适应（数据未示出）。自包含的黑暗围墙建到斑马鱼的外壳模块是非常方便的，但不是必需的。即使一个纸板箱可以使用，如果采取审慎态度到磁带或密封的接缝处，水参数进行监控。的卤素系LIRD的方法是非常经济的，方便的。所有项目可以在当地的五金商店购买的100美元下，并设置只需几分钟。 Ť他唯一实用的这种方法的缺点是工作在同一个房间作为光处理的不便。运行时，连续工作4天的灯光产生了良好的散热量和光的强度既分散注意力，并可能损害人类视觉。该UV和混合的处理方法需要紫外线源，这是不提供给每一个实验室。此外，应采取非常谨慎，以确保安全实验室成员进行紫外线光治疗时。因此，虽然它是更方便地在一个隔离的空间中有卤素光装置，进行了UV处理的安全性的关注导致需要这样的空间。这变成了一个额外的用于光治疗，如果在UV源，通常也会使用荧光显微镜容纳在“显微镜室”或成像核心不便。紫外线治疗，对照组和实验组动物表演多轮会需要一个分机关停显微镜室的时间长度ensive。

也许使用相结合的方法的最大优点是能够执行对色素沉着动物的视网膜再生研究。我们表明，无论是在背，腹视网膜杆和视锥重大损失的个人方法的结果。与此相反，组合LIRD范式的查询结果相似水平的普遍的杆和锥色素和白化动物损失。应用能力这个LIRD方法色素动物节省研究者显着的空间，时间，按日动物保健费用（如有），因为它消除了需要产生和维持白化背景利息转基因株系的视网膜再生的研究。总之，我们认为，科学，实用的优点大于潜在的不便这种改进LIRD方法。

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Disclosures

什么都没有透露。

Acknowledgments

笔者想感谢西峡罗优良的鱼类养殖和技术支持。这项工作是由美国国立卫生赠款R21EY019401（RT）和P30EY04068（RT），和启动资金RT，包括无限制的授予从韦恩州立大学，眼科防盲研究。 JT是由托马斯·C.隆隆韦恩州立大学研究生院提供的奖学金支持。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
UV light source	Leica	EL600
Glass Petri dish (150 x 20 mm)	Sigma-Aldrich/Pyrex	CLS3160152BO
250 ml glass beaker	Sigma-Aldrich/Pyrex	CLS1000250
4 L glass beaker	Sigma-Aldrich/Pyrex	CLS10004L
Aluminum foil	Fisher	01-213-105
250 W halogen lamps	Workforce	265-669
1.8 L clear acrylic tanks	Aquaneering	ZT180T
1.8 L clear acrylic tank lids	Aquaneering	ZT180LCL
Fan	Honeywell	HT-900
Aerator	Tetra	77853-900
Thermometer	Cole-Parmer	YO-08008-58
Bent forceps (5/45)	World Precision Instruments	504155