Neuroscience

大人のゼブラフィッシュにおける網膜再生研究で使用するための新規な光ダメージパラダイム

Published: October 24, 2013 doi: 10.3791/51017

¹Department of Anatomy and Cell Biology, Wayne State University School of Medicine, ²Department of Opthalmology, Wayne State University School of Medicine

Summary

多重光損傷プロトコルが損傷光受容体に記述され、その結果、成体ゼブラフィッシュ網膜再生の応答を誘導しています。このプロトコルは、着色された動物は、その損害賠償の全体にわたる網膜桿体と錐体光受容体の大部分を使用することができる改良された方法を説明します。

Abstract

光誘起網膜変性（LIRD）は、一般的にげっ歯類および損傷ロッドと錐体光受容体にゼブラフィッシュの両方で使用されています。成体ゼブラフィッシュでは、光受容体の変性は、細胞周期を再入力し、過渡増幅前駆細胞を生成するためにミュラーグリア細胞をトリガします。これらの前駆細胞は、彼らが最終的に新たな光受容体を生じさせる損傷領域への移行として増殖し続けています。現在、二広く使用されLIRDパラダイム、各々の再生応じて感光体の損失と対応する差異の程度の差が生じる。がある多くの遺伝的および薬理学的ツールは、再生時のその他の個々の遺伝子の役割をテストすることが可能であるので、堅牢なLIRDパラダイムを開発する必要がある。ここで我々は2以前に確立LIRD技術の使用を組み合わせているロッドとコーン光受容体の両方の広範かつ一貫性のある損失の結果そのLIRDプロトコルを記述します。さらにこのプロトコルはLIRD研究のためのアルビノ背景に関心のあるトランスジェニック系統を維持する必要がなくなり着色された動物における使用のために拡張することができる。

Introduction

光誘起網膜変性（LIRD）は、一般的にげっ歯類および損傷ロッドと錐体光受容体にゼブラフィッシュの両方で使用されています。成体ゼブラフィッシュでは、光受容体の変性は、細胞周期を再入力し、過渡増幅前駆細胞を生成するためにミュラーグリア細胞をトリガします。これらの前駆細胞は、彼らが最終的に新たな光受容体を生じさせる損傷領域への移行として増殖し続けています。現在、二広く使用されLIRDパラダイム、各々の再生応じて感光体の損失と対応する差異の程度の差が生じる。がある多くの遺伝的および薬理学的ツールは、再生時のその他の個々の遺伝子の役割をテストすることが可能であるので、堅牢なLIRDパラダイムを開発する必要がある。ここで我々は2以前に確立LIRD技術の使用を組み合わせているロッドとコーン光受容体の両方の広範かつ一貫性のある損失の結果そのLIRDプロトコルを記述します。さらにこのプロトコルはLIRD研究のためのアルビノ背景に関心のあるトランスジェニック系統を維持する必要がなくなり着色された動物における使用のために拡張することができる。

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Protocol

このプロトコルで説明されているすべての手順は、医学のウェイン州立大学で動物使用委員会によって承認された。

1。暗順応

転送〜ダークエンクロージャに通常の住宅システムから10成体アルビノまたは着色された魚。可能であれば、タンクを通じて通常の水の流れを可能にゼブラフィッシュ住宅モジュールに組み込まれている暗い筐体を使用しています。（そのようなシステムが利用できない場合には、酸素と魚を通気することを確認し、完全に暗いエンクロージャ内に水槽を配置）。
10日間暗闇の中で魚を保管してください。動物を餌または暗箱に新しい魚を追加する場合は、光の長い期間に魚をさらす避けるためにできるだけ早く移動してください。

2。 UV露光

UV源の電源がOFFになっていることを確認してください。蛍光実体顕微鏡からの紫外線フィラメントを取り外します。
1. 反転を使用してくださいUVフィラメント用のスタンドとして直径15cmのガラスシャーレ（または類似した2センチメートルの高さのようなもの）。実験台にシャーレテープ。
2. 反転したペトリ皿の上部にテープ紫外線フィラメント。フィラメント張り出し月末〜2ミリメートルペトリ皿になるよう配置します。
250mlのガラスビーカーを取得します。背面アルミホイルでビーカーのカバー下部の½、側面、そして、箔の "光沢のある"側がビーカーの内側に面していることを確認する。ビーカーを卒業されている場合は、露出したビーカーの明確な半分を残して、ホイルでビーカーの文言の半分をカバーしています。
魚施設システムから100mlの水で250mlのビーカーを埋める。
4リットルのビーカーに250mlのビーカーを置きます。水位が250mlのビーカーに100mlの水ラインと偶数になるまで水を4リットルのビーカーを埋める。
250mlのビーカーに10暗処置動物の最大値を追加します。アルミニウムの小片で250mlのビーカーをカバー箔。
UVフィラメントに隣接全体ビーカー装置を置きます。フィラメントは、4 Lのビーカーの外側に触れると250ミリリットルのビーカーの露出部分に直面しなければならない。 250mlのビーカーを4 Lのビーカーの底の中心にいることを確認してください。
露出する動物のためにできるように、しかし、UVフィラメントの先端を見てから、任意のラボ要員を防止、4Lビーカー背後に大規模な、不透明な画面を配置します。警告：この障壁はUV源の電源を入れる前に所定の位置にあることを確認してください。
UV電源をオンにします。 30分のタイマーを設定します。どんな必要な警告ラベルは、その無防備なラボの担当者が誤って紫外線に自分自身を公開しないように置きます。
30分後、UV電源を遮断する。魚と250mlのビーカーを取り外します。注：UV暴露の複数回が必要な場合、露出プロトコルを繰り返す前（〜20分）電源がクールダウンしましょう。 Tを交換することを確認してください彼は各露光のために新鮮なシステム水で100mlの水。 4リットルのビーカー中の水を交換する必要はない。

3。ハロゲンランプ露光

1.8 L明確なアクリルの魚飼育用の水槽に250mlのビーカーから魚を移す。オーバーフローマークに給油して下さい。
ハロゲンランプ光処理領域を設定する。地元の金物屋からの4つの250 Wのハロゲンランプユーティリティを入手します。同じ方向に2つのランプに面しており、中央には別に29センチメートルを手配。同様の方法で、他の2つのランプを配置します。
1. 彼らは、ランプの2つのセットの間の内〜73センチメートルを残して、ランプの第1のセットを対向されるようにランプの第2のセットを配置する。これは29×73センチメートルの長方形状の光治療領域を作成します。
地元の金物屋から小さなファンを得る。ちょうど光処理領域外、ランプの2つのセットの間の等距離のファンを配置します。
の中心に水の完全な2 1.8 Lタンクを置きランプの2つのセットの間の等距離光処理領域。ランプ、タンクの外壁の間の距離は〜29 cmであるべきである。注：のみ1 1.8 Lタンクに10魚を治療する場合でも、このような構成を使用しています。両方のタンクは適切な範囲内で、各タンクの水の温度を維持するために必要とされる。
各タンク内の酸素エアレーターを置きます。
ファンに最も近い端で1〜2センチのギャップを残し、透明アクリル蓋と各タンクをカバーしています。それがこの隙間に空気を爆破するようにファンを配置します。タンクの一方または両方に温度計を配置する。
ライト、ファン、エアレーターの電源をオンにします。最大4日間の光治療を維持する。これは動物に多くのストレスの水質と結果に影響を与えるような魚は、光治療中に供給されるべきではありません。
日常的に温度と水位を監視します。 30-33で温度を維持℃に必要に応じて、ファンの回転速度および/またはタンク及びリチウムの間の距離を調整するghts。
1. 必要に応じて、通常の毎日のシステム水で各タンクトップオフ。
2. 常に100％近くの生存率を維持するために、健康な成人ゼブラフィッシュ（通常生後6-9ヶ月）を使用します。魚は水槽で死体で発見された場合しかし、それをすぐに削除し、全体のタンク内の水を交換してください。

4。組織採取

ハロゲンライト治療の発症後48時間は、治療エリアから魚を取り外す。
1. 新鮮なエタノールホルムアルデヒド固定液（1部37％ホルムアルデヒド、9部100％エタノール）を準備。
2. 2 - フェノキシエタノールの麻酔過剰投与（0.4 mg / Lで）とゼブラフィッシュを安楽死させる。
3. ペーパータオルに安楽死させたゼブラフィッシュを転送します。湾曲したピンセットを使って目を摘出。
4. 4℃で固定し、店O / Nで除核の目を置き
目をCryoprotect。
1. 室温で30分間、5％スクロースを1×PBSで目を洗い、その後に置き換える2時間のために新鮮な5％蔗糖1X PBS。次に、4℃で30％のショ糖1X PBS O / Nで目を洗う4℃で組織凍結培地、30％ショ糖1X PBS O / Nの1:1（等分）で目を洗う
-80℃で100％の組織凍結培地や店舗で目を埋め込む℃にオリエント組織の凍結切片を腹/背軸上で実行されるように、目。
スライドガラス上の凍結切片組織と場所。 55℃で2時間のためのウォームスライド-80°Cまたは直後にストアスライドは、標準的な免疫組織化学を行う。
蛍光顕微鏡^40,51と切片の組織および画像上の標準的な免疫組織化学を実行します。

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Representative Results

上述光治療プロトコルはLIRDの個々の方法と比較した。暗い処置成体動物のアルビノ （ 図3-5）において、個々の光治療が重要なロッドの損失（ 図3）とコーン（ 図4）感光体が得られた。ただし、両方の個々の治療は、主に比較的軽い治療（図3及び図4）から保護腹側網膜を残して、網膜の背側半分に感光体が損傷している。また、ハロゲンライトの治療と比較して、紫外線治療は、網膜の背側半分（それぞれ、Cと図4Bを比較）より錐体が破損。 UVおよびハロゲン光トリートメントを組み合わせることで、主にn個を排除し、網膜全体の桿体と錐体光受容体の両方に有意に大きな損失をもたらした網膜の腹側（図3および図4）のeuroprotection。合成光治療プロトコルを用いた場合、個々のLIRDの方法と比較し、増殖の増加に対応するも、腹側網膜において観察された（ 図5）。

着色された動物は、光を吸収し、光毒性から光受容体を保護し、網膜色素上皮に起因LIRDに対してより耐性があります。予想通り、暗順応色素性動物は単独のハロゲンライトの治療にほぼ完全に耐性であった（ 図6（b）、J、およびN）。我々は48時間光発症後、桿体が背網膜に減少したことがわかった、ではなく腹側網膜（ 図6E、F、およびQ）。錐体光受容体核は、通常の数字（ 図6R）に存在した。未処理の網膜、ハロゲンランプと比較して単独の治療法はまた、光発症後ミュラーグリア細胞増殖48時間（ 図7BおよびF）は増加しなかった。 アルビノの動物、単独の紫外線治療に背網膜の桿体と錐体光受容体（ 図3Iと4I）の両方にわずかに大きい被害をもたらした。しかしながら、着色された動物では、UV光単独処理が著しくロッドまたは錐体細胞数（ 図6C、G、K、O、Q、及びR）減少させなかった。また、単独のUV処理のみ色素沈着、動物における網膜の背側半分（ 図7C）に弱い再生応答を誘発した。個々のLIRD結果とは対照的に、UV及びハロゲンライト処理を組み合わせること有意に高い感光体の損傷や着色された動物における回生応答をもたらした。重要なことに、ロッドと錐体の両方の著しい損失がdorsumの複数形の両方で観察された lおよび腹側網膜（ 図6D、H、L、P、Q、及びR）。未処理および個別のLIRD方法と比較して、増殖の増加に対応するも、合成光治療プロトコルは（ 図5）を用いた網膜の背側と腹側半部の両方で観察された。

図1。写真はハロゲンライト処理の設定を示す4つの250 Wハロゲンランプの二組は、2つの透明なアクリル1.8 Lタンクの両側に29センチメートル間隔をあけられた。光を妨げないようにエアレーターとチューブはように配置した。タンクの蓋は、ファンからの空気の流れを可能にするには、2センチ割れていた。温度計を監視するための温度タンクのいずれかに入れた。ARGET = "_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図2。写真は紫外線治療セットアップを描いた。蛍光実体顕微鏡からUV光源がしっかり〜2センチメートルベンチトップオフガラスシャーレに固定した。部分的に箔に包まれた250mlのガラス製ビーカーに、充填されたシステム水100mlう。魚を250mlのビーカーの内側に入れた。 250mlのビーカーを250mlのビーカー中の水のレベルは、システム水を充填した4リットルのビーカーの内側中心にした。 4リットルのビーカーを250mlのビーカーを中心とする光フィラメントに隣接して配置した。大きな不透明シールドは全体のセットアップの周りに配置されました。大きな画像を表示するには、ここをクリックしてください。

図3。様々な光損傷パラダイム続くアルビノゼブラフィッシュにおける桿体損失大人のTg（NRD：EGFP）から網膜切片。/ ALBは桿体の背で密度（緑）（AD）および腹側を表示するようにGFPで免疫標識（EH）網膜の半分光発症（0時間）、EGFP陽性ロッド感光核（ONL）と外側のセグメント（ROS）に先立ち。A、E）は、可視化することができる。B、F）48時間以下のハロゲンライト発症（HLT）、切り捨てROSでと大幅に少なくロッド核は（I）網膜背側に存在するが、腹ではありませんでした。CG）48時間のUV曝露（hpUV）の30分後に、大幅に少なくロッド核0時間に比べて背側と腹側網膜に存在していた（C、G < / strong>の）ではなく、48 HLTトリートメント（G、I）。 DH）合成光治療の48時間以下の開始（ハロゲン処理に続いて30分間のUV露光、UV +48 HLT）、殆どROSは、桿体核（I）の有意な損失に加えて、背側または腹側網膜中に存在しなかった中央の背側または腹側網膜の300μmの横断桿体核の。I）定量。 "" 48 HLTと48 hpUV異なるために "C"とは異なるために0時間、 "B"とは異なるために：群間に有意差（P≤0.05）は次のように描かれている。パネルのスケールバーは50μmでを表し、AHのパネルに適用されます大きい画像を表示するには、ここをクリック。

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図4。様々な光損傷パラダイム続くアルビノゼブラフィッシュでダブルコーン損失。網膜セクションは成人アルビノゼブラフィッシュからは、光の各続く背にダブルコーン（ゴールド）（AD）と網膜の腹側（EH）の半分を表示するZPR-1で免疫標識ダメージパラダイム（48 HLT、48 hpUV、およびUV +48 HLT）、E）0時間、ダブルコーン核では、背側と腹側網膜に存在していた。B、F）48 HLTで、有意に少なかっダブルコーンに存在していた腹網膜のみ（F、I）。変更が腹網膜（G）は観察されなかった一方48 hpUV、大幅に少なくダブルコーン（I）と破片が多量でCG）は、唯一の背側網膜（C）中に存在していた。 UV +48 HLT、大幅に少なくダブルコーンでDH）S（I）とほとんど残骸は背側と腹側網膜に存在していた。 I）中央の背側または腹側網膜の300μmの横断ダブルコーンの定量。群間に有意差（p≤0.05） "" 48 HLTおよび48 hpUVとは異なる "c"は0と異なるための時間、 "b"のとは異なるために、として示されている。パネルのスケールバーは、100μmを表し、AHのパネルに適用されます大きい画像を表示するには、ここをクリック。

図5。変更は、様々な光損傷パラダイムに続く増殖応答です。PCNAと免疫標識成体アルビノゼブラフィッシュから網膜のセクションでは、細胞の増殖（赤）を表示する0時間で背側（AD）および腹側（EH）光損傷パラダイム（48 HLT、48 hpUV、およびUV +48 HLT）のそれぞれ後に網膜の半分になります。AE）は 、増殖が内顆粒層を欠席した（ INL）。B、F）48 HLTでは、単一の前駆細胞は、背側網膜の両端INLおよび腹側網膜の小さな部分に存在していた。CG）48 hpUVでは、前駆細胞の列は、背側網膜に存在した単一前駆細胞は、腹側網膜の小さな部分に存在している。D、H）UV +48 HLTでは、前駆細胞の大規模なカラムは、背側と腹側網膜渡って存在していた。パネルのスケールバーは、100μmを表し、AHのパネルに適用されます大きい画像を表示するには、ここをクリック。

図6。ロッドと様々な光損傷パラダイム続く色素沈着ゼブラフィッシュにおける錐体損失成体野生型（AB）ゼブラフィッシュの網膜のセクションでは、すべての核（AP、青）を示すためにTO-PRO-3で染色した。とロッドを表示するZPR-3で免疫標識外節（AH;マゼンタ）またはZPR-1ダブルコーン（IP;金）に背側に（AD、IJ）と網膜の腹側（EH、MP）半分光損傷パラダイムのそれぞれ、以下の（48 HLT、48 hpUV、およびUV +48 HLT）。AH）桿体核の大幅な減少は、UV +48 HLT（D、H、Q）で48 HLT（B、Q）でと背側と腹側網膜の背側網膜に存在していた。IP）コーン核が肥大していたが、私 nは48 hpUV（K）、ダブルコーン核に有意減少で背側網膜は48 HLTまたは48 hpUV（JK、NO、R）で存在していた。コーン核の大幅な減少は、UV +48 HLT（L、P、R）で背と腹側網膜に存在していた。QR）桿体および中央背側または腹側網膜の300μmの横断ダブルコーン核の定量。群間に有意差（p≤0.05） "" 48 HLTおよび48 hpUVとは異なる "c"は0と異なるための時間、 "b"のとは異なるために、として示されている。パネルのスケールバーは200μmのを表し、AHのパネルに適用されます大きい画像を表示するには、ここをクリック。

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図7。背側（AD）および腹側（EH）の細胞増殖（赤）を表示するようにPCNAと免疫標識成体野生型（AB）ゼブラフィッシュからの様々な光のダメージパラダイム。網膜切片続く色素沈着ゼブラフィッシュにおける増殖応答は、それぞれ以下の網膜の半分光損傷パラダイム（48 HLT、48 hpUV、およびUV +48 HLT）。AD）背網膜では、わずか数シングル前駆細胞は、48 HLT及び48 hpUV（B、C）でのINLに存在していた間、列前駆細胞のUV +48 HLT（D）において存在した。EH）腹側網膜においては、増殖の変化は前駆細胞の時間列が存在していたれるUV +48 HLT（H）を除いて観察されなかった。パネルのスケールバーは、100μmを表し、AHのパネルに適用されます。7/51017fig7highres.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

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Discussion

ここでは、広範な光受容体の損失や堅牢な再生レスポンスの継続明るい光露光結果と短い紫外線照射を組み合わせることを示している。個人LIRDの方法と比較して、この結合方法は、また、網膜の両方の半分にロッドとコーンの両方を損傷するための最も効果的なプロトコルです。重要なことに、この処置は、着色された動物と同様に、 アルビノ動物において効果的である。

我々はより広範囲かつ一貫性のある損傷を合わせプロトコルの結果は個々のLIRD方法と比較しているという証拠を提供しますが、科学的な考察はLIRDパラダイムを選択する前に議論されるべきである。我々のデータは、全体の網膜組織（ すなわちプロテオミクス、リアルタイムPCR）分析のために収集されたときに合成法が利用されるべきことを示唆している。私達は結合された方法は、ハロゲン暴露が続く最大の病変の大きさ、そして最後にUV照射を持っていたことが分かった。我々は提案します示差桿体と錐体の再生を行うことができる遺伝子または経路を調査する際に組み合わせる方法を用いることもできる。これは実用的な理由のために可能でない場合、我々のデータは、分析が中央背側網膜に限定されている場合UV曝露は、これらの研究のための次の最良の方法であることを示唆している。

適切LIRD方法を選択する際の実用的な考慮事項についても保証されています。最初の懸念は、必要な機器のコストです。すべてのプロトコルは、暗順応（データは示さず）の長時間を必要とする。ゼブラフィッシュの住宅モジュールに組み込まれている自己完結型の暗い筐体は非常に便利ですが、必要ありません。ケアテープに取らまたは継ぎ目を密封しても段ボール箱を使用することができ、水のパラメータが監視される。ハロゲン系LIRD法は、非常に経済的で便利です。すべての項目は地元の金物店で100ドル以下で米国のために購入し、わずか数分かかります設定することができます。 T彼はこの方法の唯一の実用的な欠点は、光治療と同じ部屋で作業の不便さである。 4日間連続して実行するときにライトは熱の良い量を生成し、光強度は気が散ると、人間の視覚に損傷を与える可能性もある。 UVと組み合わせた方法はすべての実験室を利用できませんUV源が必要です。また、細心の注意紫外線処理を行う際に、ラボ部材の安全性を確保するために取られるべきである。それは単離された空間内にハロゲンライト装置を有することがより便利であるしつつ、UV処理の安全性の懸念は、このようなスペースを必要とする。光治療のために使用されるUV光源はまた、典型的には、 "顕微鏡ルーム"又はイメージングコア内に収容された蛍光顕微鏡用に使用されている場合には、追加の不便となる。制御や動物の実験群のためのUV処理の複数のラウンドを実行すると、内線用顕微鏡室をシャットダウンする必要とするでしょう時間のensive長。

おそらく複合メソッドを使用する最大の利点は、着色された動物で網膜再生研究を実行する機能です。私たちは、背側と腹側の網膜のロッドとコーンの大きな損失でも個々のメソッドの結果があることを示している。対照的に、広範なロッドと色素沈着とアルビノ動物の両方に円錐損失の同様のレベルで複合LIRDパラダイム結果。それは網膜再生研究のためのアルビノの背景に興味のあるトランスジェニック系統を生成し、維持する必要がなくなりますように着色された動物にこのLIRD法を適用する能力は、研究者の重要な空間、時間、および日当動物ケアのコストを（もしあれば）を保存。一緒に、我々は、科学的かつ実用的な利点は、この改良LIRD法の潜在不便を上回ると感じています。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Acknowledgments

著者は、優れた魚の飼育と技術サポートのため西夏羅に感謝したいと思います。この作品は、健康補助R21EY019401（RT）とP30EY04068（RT）の国立研究所によって資金を供給し、ウェイン州立大学、眼科部門に失明を防止するための研究から無制限の助成金を含め、RTに資金を立ち上げました。 JTは、ウェイン州立大学大学院で提供されるトマスC.ランブルフェローシップによってサポートされていました。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
UV light source	Leica	EL600
Glass Petri dish (150 x 20 mm)	Sigma-Aldrich/Pyrex	CLS3160152BO
250 ml glass beaker	Sigma-Aldrich/Pyrex	CLS1000250
4 L glass beaker	Sigma-Aldrich/Pyrex	CLS10004L
Aluminum foil	Fisher	01-213-105
250 W halogen lamps	Workforce	265-669
1.8 L clear acrylic tanks	Aquaneering	ZT180T
1.8 L clear acrylic tank lids	Aquaneering	ZT180LCL
Fan	Honeywell	HT-900
Aerator	Tetra	77853-900
Thermometer	Cole-Parmer	YO-08008-58
Bent forceps (5/45)	World Precision Instruments	504155