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Neuroscience

A Novel lumière paradigme de dommages pour utilisation dans les études de régénération rétinienne chez le poisson zèbre adulte

Published: October 24, 2013 doi: 10.3791/51017
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Anatomy and Cell Biology, Wayne State University School of Medicine, 2Department of Opthalmology, Wayne State University School of Medicine

Summary

Protocoles de légers dégâts multiples ont été décrits pour les photorécepteurs des dommages et par conséquent induire une réponse de régénération rétinienne chez le poisson zèbre adulte. Ce protocole décrit une méthode améliorée qui peut être utilisé chez les animaux pigmentés et qui endommage la grande majorité de la tige et des cônes photorécepteurs dans la rétine entière.

Abstract

Dégénérescence de la rétine induite par la lumière (LIRD) est couramment utilisé chez les rongeurs et poissons zèbres à la tige des dommages et des cônes photorécepteurs. Chez le poisson zèbre adulte, photorécepteur dégénérescence déclenche les cellules gliales de Müller à réintégrer le cycle cellulaire et de produire des progéniteurs transitoire-amplification. Ces ancêtres continuent à proliférer comme ils migrent vers la zone endommagée, où ils ont finalement donner naissance à de nouveaux photorécepteurs. Actuellement, il existe deux paradigmes LIRD largement utilisés, dont chacune entraîne degrés de perte des photorécepteurs et des différences correspondantes variant dans la réponse de régénération. En plus des outils génétiques et pharmacologiques sont disponibles pour tester le rôle des gènes individuels d'intérêt lors de la régénération, il est nécessaire de développer un paradigme LIRD robuste. Nous décrivons ici un protocole LIRD qui entraîne une perte généralisée et cohérente de deux photorécepteurs bâtonnets et des cônes dans lesquels nous avons combiné l'utilisation de deux techniques LIRD précédemment établies. Par ailleursCe protocole peut être étendu pour une utilisation chez les animaux pigmentés, ce qui élimine la nécessité de maintenir des lignées transgéniques d'intérêt sur le fond albinos pour les études LIRD.

Introduction

Dégénérescence de la rétine induite par la lumière (LIRD) est couramment utilisé chez les rongeurs et poissons zèbres à la tige des dommages et des cônes photorécepteurs. Chez le poisson zèbre adulte, photorécepteur dégénérescence déclenche les cellules gliales de Müller à réintégrer le cycle cellulaire et de produire des progéniteurs transitoire-amplification. Ces ancêtres continuent à proliférer comme ils migrent vers la zone endommagée, où ils ont finalement donner naissance à de nouveaux photorécepteurs. Actuellement, il existe deux paradigmes LIRD largement utilisés, dont chacune entraîne degrés de perte des photorécepteurs et des différences correspondantes variant dans la réponse de régénération. En plus des outils génétiques et pharmacologiques sont disponibles pour tester le rôle des gènes individuels d'intérêt lors de la régénération, il est nécessaire de développer un paradigme LIRD robuste. Nous décrivons ici un protocole LIRD qui entraîne une perte généralisée et cohérente de deux photorécepteurs bâtonnets et des cônes dans lesquels nous avons combiné l'utilisation de deux techniques LIRD précédemment établies. Par ailleursCe protocole peut être étendu pour une utilisation chez les animaux pigmentés, ce qui élimine la nécessité de maintenir des lignées transgéniques d'intérêt sur ​​le fond albinos pour les études LIRD.

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Protocol

Toutes les procédures décrites dans le présent protocole ont été approuvés par le comité de l'utilisation des animaux à la Wayne University School of Medicine Etat.

1. Adaptation à l'obscurité

  1. Transfert ~ 10 poissons adultes albinos ou pigmenté à partir du système de logement normale dans une enceinte sombre. Si possible, utilisez un boîtier noir qui est intégré dans le module de logement poisson zèbre, ce qui permet l'écoulement normal de l'eau dans le réservoir. (Si un tel système n'est pas disponible, placez le réservoir de poissons dans un boîtier entièrement noir, en veillant à aérer le poisson avec de l'oxygène).
  2. Gardez le poisson dans l'obscurité pendant 10 jours. Lors de l'alimentation des animaux ou en ajoutant de nouveaux poissons à la boîte sombre, assurez-vous de passer le plus rapidement possible pour éviter d'exposer le poisson à une longue période de lumière.

2. UV exposition à la lumière

  1. Assurez-vous que la puissance de la source UV est éteinte. Retirez le filament de lumière UV stéréoscopique fluorescent.
    1. Utiliser un inversé15 cm de diamètre en verre de Pétri (ou quelque chose de semblable cm hauteur 2) comme un support pour le filament UV. Tape le boîte de Pétri à la paillasse.
    2. Tape le filament de lumière UV en haut de la boîte de Petri inversée. Arrangement de sorte que ~ 2 mm de l'extrémité des saillies de filament de la boîte de Pétri.
  2. Obtenir un bécher en verre de 250. Couvrir la moitié du bas, sur les côtés et l'arrière du bécher avec du papier d'aluminium, en s'assurant que le côté "brillant" de la feuille tournée vers l'intérieur du gobelet. Si le récipient est gradué, couvrir la moitié rédigé du bécher d'une feuille, laissant la moitié claire du bécher exposée.
  3. Remplir le bécher de 250 ml avec 100 ml d'eau du système d'installation de poisson.
  4. Placer le bécher de 250 ml dans un bécher 4. Remplissez le 4 L bécher avec de l'eau jusqu'à ce que le niveau de l'eau est encore à la ligne d'eau de 100 ml dans le bécher de 250 ml.
  5. Ajouter un maximum de 10 animaux sombre traités au bécher de 250 ml. Couvrir le bécher de 250 ml avec un petit morceau d'aluminiumdéjouer.
  6. Placer l'ensemble de l'appareil de gobelet à proximité immédiate du filament UV. Le filament doit être en contact avec l'extérieur du récipient 4 L et faisant face à la partie exposée du bécher de 250 ml. Assurez-vous que le bécher de 250 ml est centré dans le bas de la 4 L bécher.
  7. Placez un grand écran opaque derrière le bécher 4L, ce qui permet aux animaux d'être exposés, mais empêchant tout le personnel de laboratoire de voir le bout du filament UV. ATTENTION: assurez-vous que cette barrière est en place avant la mise sous tension de la source UV.
  8. Allumez la source d'alimentation UV. Régler la minuterie pour 30 min. Lieu que ce soit les étiquettes d'avertissement nécessaires pour s'assurer que le personnel de laboratoire sans méfiance ne pas accidentellement s'exposer au rayonnement UV.
  9. Après 30 minutes, éteindre la source d'alimentation UV. Retirer le bécher de 250 ml avec le poisson. Remarque: Si plusieurs tours de l'exposition aux UV sont nécessaires, laisser la source d'alimentation refroidir (~ 20 min) avant de répéter le protocole d'exposition. Veillez à remplacer til 100 ml d'eau avec de l'eau fraîche du système pour chaque exposition. L'eau dans le bécher 4 L n'a pas besoin d'être remplacé.

3. Lampe halogène exposition à la lumière

  1. Transférer le poisson de 250 ml bécher dans un L aquarium en acrylique transparent 1.8. Remplir le réservoir jusqu'à la marque de débordement.
  2. Mettre en place la zone de traitement de la lumière d'une lampe halogène. Obtenir quatre lampes utilitaires halogène de 250 W à partir d'une quincaillerie locale. Face à deux lampes dans la même direction, organiser 29 cm de distance de centre à centre. Disposer les deux autres lampes de la même façon.
    1. Placer le second ensemble de lampes de sorte qu'ils font face à la première série de lampes, en laissant ~ 73 cm entre les deux séries de lampes. Cela crée une zone de traitement par la lumière en forme de rectangle de 29 x 73 cm.
  3. Procurez-vous un petit ventilateur à partir d'une quincaillerie locale. Placez le ventilateur à égale distance entre les deux ensembles de lampes, juste à l'extérieur de la zone de traitement par la lumière.
  4. Placez deux 1.8 L réservoirs remplis d'eau dans le centre de lala zone de traitement à la lumière, à égale distance entre les deux jeux de lampes. La distance entre les lampes et la paroi extérieure de la cuve doit être ~ 29 cm. Remarque: même si seulement traiter 10 poissons dans un réservoir de 1,8 L, utiliser cet arrangement. Les deux réservoirs sont nécessaires pour maintenir la température de l'eau de chaque réservoir dans la plage appropriée.
  5. Placer un aérateur de l'oxygène dans chaque réservoir.
  6. Couvrir chaque réservoir avec des couvercles acryliques claires, laissant un écart de ~ 2 cm à l'extrémité la plus proche du ventilateur. Disposer le ventilateur afin qu'il souffler de l'air dans cet espace. Placer un thermomètre dans l'une ou les deux des réservoirs.
  7. Tournez sur la puissance de la lumière, des ventilateurs et aérateurs. Maintenir traitement par la lumière pour un maximum de 4 jours. Le poisson ne doit pas être alimenté pendant le traitement par la lumière, car cela aura une incidence sur la qualité de l'eau et se traduisent par plus de stress pour les animaux.
  8. Surveiller le niveau de la température et de l'eau sur une base quotidienne. Maintenir la température à 30-33 ° C. Si nécessaire, ajuster la vitesse du ventilateur et / ou la distance entre les réservoirs et la lidro.
    1. Couronner chaque réservoir avec de l'eau du système en fonction des besoins, habituellement tous les jours.
    2. Toujours utiliser le poisson zèbre adulte en bonne santé (en général 6-9 mois d'âge) afin de maintenir un taux de survie de près de 100%. Toutefois, si un poisson est retrouvé mort dans le réservoir, retirez-le immédiatement et remplacez l'eau dans l'ensemble du réservoir.

4. Collection de tissus

  1. 48 h après le début du traitement par la lumière d'halogène retirer le poisson de la zone de traitement.
    1. Préparer fixateur de formaldéhyde éthanol frais (1 part 37% de formaldéhyde, 9 parties d'éthanol à 100%).
    2. Euthanasier poisson zèbre avec une surdose d'anesthésique de 2-phénoxyéthanol (0,4 mg / L).
    3. Transférer le poisson zèbre euthanasiés à une serviette en papier. Énucléer l'œil en utilisant des pinces courbes.
    4. Placez les yeux énucléés dans un fixateur et un magasin O / N à 4 ° C.
  2. Cryoprotect les yeux.
    1. Laver les yeux à 5% de saccharose 1x PBS pendant 30 min à température ambiante, puis remplacez-le parfrais 5% de saccharose 1x PBS pendant 2 heures. Ensuite, laver les yeux à 30% de saccharose 1x PBS O / N à 4 ° C. Laver les yeux dans un mélange 1:1 (parties égales) de milieu de congélation de tissu et de 30% de saccharose PBS 1x O / N à 4 ° C.
  3. Intégrer les yeux dans le milieu de congélation de tissu 100% et conserver à -80 ° C. Orienter les yeux pour que cryosectioning du tissu est réalisé sur l'axe dorsal / ventral.
  4. Cryosection le tissu et le placer sur des lames de verre. Diapositives chaudes pendant 2 heures à 55 ° C. Stocker les lames à -80 ° C ou d'effectuer immédiatement immunohistochimie standard.
  5. Effectuer standard d'immunohistochimie sur les tissus sectionnés et l'image par microscopie fluorescente 40,51.

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Representative Results

Le protocole de traitement de la lumière décrit ci-dessus a été comparée à chaque méthode individuelle de LIRD. Chez les animaux albinos adultes dark-traitées (figures 3-5), les traitements de lumière individuelles a entraîné une perte importante de la tige (Figure 3) et le cône (Figure 4) photorécepteurs. Cependant, les deux traitements individuels endommagés principalement photorécepteurs dans la moitié postérieure de la rétine, en laissant la rétine ventrale relativement protégés des traitements légers (figures 3 et 4). En outre, par rapport au traitement à la lumière d'halogène, le traitement par la lumière UV endommagé plus de photorécepteurs de cône dans la moitié postérieure de la rétine (comparer les figures 4B à C, respectivement). En combinant les traitements à la lumière ultraviolette et halogène entraîné significativement plus grande perte de la tige et des cônes photorécepteurs tout au long de la rétine, ce qui élimine en grande partie le neuroprotection de la moitié antérieure de la rétine (figures 3 et 4). En comparaison avec les méthodes LIRD individuelles, une augmentation correspondante de la prolifération a également été observée dans la rétine ventrale lorsque le protocole de traitement de la lumière combinée a été utilisé (Figure 5).

Animaux pigmentées sont plus résistants à LIRD en raison de l'épithélium pigmentaire de la rétine, qui absorbe la lumière et protège les photorécepteurs de phototoxicité. Animaux pigmentés comme prévu, adaptés à l'obscurité était presque complètement résistant au traitement de la lumière halogène seul (figures 6B, J et N). Nous avons constaté que 48 heures après le début de la lumière, les photorécepteurs tige ont été réduites dans la rétine dorsale, mais pas rétine ventrale (figures 6E, F et Q). Cone photorécepteur noyaux étaient présents en nombre normales (Figure 6R). Par rapport à la rétine non traités, la lumière halogèneseul traitement n'a pas non plus augmenter la prolifération des cellules gliales Müller 48 heures après le début de la lumière (figures 7B et F). Chez les animaux albinos, traitement par la lumière UV seul a entraîné une légère plus de dégâts aux deux bâtonnets et des cônes photorécepteurs de la rétine dorsale (figures 3i et 4i). Cependant, chez les animaux pigmentés, traitement par la lumière UV seul n'a pas significativement réduit tige ou le nombre de cellules de cône (figures 6C, G, K, O, Q et R). En outre, le traitement UV seul seulement suscité une réponse régénérative faible dans la moitié postérieure de la rétine chez les animaux pigmentés (Figure 7C). Contrairement aux résultats LIRD individuels, combinant les UV et les traitements de lumière halogène entraîné significativement plus de dégâts des photorécepteurs et la réponse régénérative chez les animaux pigmentés. Surtout, une perte significative de deux bâtonnets et des cônes a été observée à la fois dans le Dorsa l et ventrale rétines (Figures 6D, H, L, P, Q et R). Par rapport aux méthodes de LIRD personne non traitées et une augmentation correspondante de la prolifération a également été observée dans les deux moitiés dorsale et ventrale de la rétine lorsque le protocole de traitement de la lumière combinée a été utilisé (Figure 5).

Figure 1
Figure 1. Photographie illustrant la configuration du traitement par la lumière halogène. Deux séries de quatre lampes halogènes 250 W étaient espacés de 29 cm de chaque côté de deux réservoirs de 1,8 L en acrylique clair. L'aérateur et le tube ont été placées de manière à ne pas obstruer la lumière. Les couvercles des réservoirs ont été fissurés 2 cm pour permettre une ventilation du ventilateur. Un thermomètre est placé dans l'un des réservoirs pour la température doit être surveillée.Arget = "_blank"> Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 2
Figure 2. Photographie illustrant la configuration du traitement par la lumière UV. La source de lumière UV d'une loupe binoculaire fluorescent a été solidement fixé à une boîte de Pétri en verre ~ 2 cm sur le dessus de table. Un bécher de 250 ml en verre, partiellement enveloppé dans du papier, a été rempli par 100 ml d'eau du système. Le poisson a été placé dans le bécher de 250 ml. Le bécher de 250 ml a été centré à l'intérieur d'un bêcher 4, qui a été rempli avec de l'eau du système pour le niveau de l'eau dans le bécher de 250 ml. Le 4 L bêcher a été placé à côté du filament de lumière centré sur le bécher de 250 ml. Un grand écran opaque a été placé autour de l'ensemble de l'installation. Cliquez ici pour agrandir l'image .


Figure 3. Perte photorécepteurs tige chez le poisson zèbre albinos suite à divers paradigmes de dégâts de lumière des sections rétiniennes à partir adulte Tg (NRD: egfp). / Alb immunomarquées avec la GFP pour montrer tige densité photorécepteur (vert) dans la dorsale (AD) et ventrale (EH) moitiés de la rétine . A, E) Avant l'apparition de lumière (0 h), les noyaux des photorécepteurs tige EGFP-positive (ONL) et les segments extérieurs (ROS) peut être visualisé. B, F) à 48 h suivant l'apparition de la lumière halogène (HLT), tronquée ROS et beaucoup moins de noyaux de tige (I) étaient présents dans la dorsale, mais pas rétine ventrale. CG) à 48 h après 30 min d'exposition aux UV (hpUV), beaucoup moins de noyaux de tige étaient présents dans la rétine dorsale et ventrale par rapport à 0 h (C, G < / Strong>), mais pas 48 traitements de HLT (G, I). DH) 48 heures suivant le début du traitement de la lumière combinée (30 exposition aux UV min suivi d'un traitement d'halogène; UV +48 HLT), presque pas de ROS étaient présents dans la rétine dorsale ou ventrale, en plus d'une perte importante de la tige photorécepteur noyaux (I) . I) Quantification de la tige photorécepteur noyaux à travers 300 um de la dorsale centrale ou de la rétine ventrale. Des différences significatives (p ≤ 0,05) entre les groupes sont représentés comme suit: «A» pour différent de 0 h, "b" pour différentes à partir de 48 HLT et "c" pour différentes à partir de 48 hpUV. La barre d'échelle dans le panneau A représente 50 um et s'applique aux panneaux AH. Cliquez ici pour agrandir l'image .

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Figure 4. Perte de double cône chez le poisson zèbre albinos après divers paradigmes de dégâts de lumière. Des sections rétiniennes à partir de poisson zèbre albinos adulte immunomarquées avec Zpr-1 pour montrer cônes doubles (or) dans la dorsale (AD) et des moitiés ventrales (EH) de la rétine après chacune de la lumière paradigmes de dégâts (48 HLT, 48 hpUV et UV +48 HLT). A, E) à 0 heure, les noyaux double cône étaient présents dans les rétines dorsale et ventrale. B, F) Au 48 HLT, beaucoup moins de cônes doubles étaient présents dans la rétine ventrale seulement (F, I). CG) Au 48 hpUV, beaucoup moins de cônes doubles (I) et une grande quantité de débris était présent dans la rétine dorsale seulement (C), tandis qu'aucun changement n'a été observé dans la rétine ventrale (G). DH) A UV +48 HLT, beaucoup moins à double cônes (I), et très peu de débris est présent dans la rétine dorsale et ventrale. I) La quantification des doubles cônes répartis sur 300 um de la dorsale centrale ou de la rétine ventrale. Des différences significatives (p ≤ 0,05) entre les groupes sont représentés comme, "a" pour différent de 0 h, "b" pour différentes à partir de 48 HLT et "c" pour différentes à partir de 48 hpUV. La barre d'échelle dans le panneau A représente 100 um et s'applique aux panneaux AH. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 5
Figure 5. Changements est la réponse de prolifération après divers paradigmes de dégâts de lumière. Sections rétiniennes du poisson zèbre albinos adulte immunomarquées avec PCNA pour montrer la prolifération des cellules (rouge)la dorsale (AD) et ventrale (EH) moitiés de la rétine après chacun des paradigmes de légers dégâts (48 HLT, 48 hpUV et UV +48 HLT). AE) à 0 heure, la prolifération était absent de la couche nucléaire interne ( INL). B, F) Au 48 HLT, les cellules progénitrices simples étaient présents dans l'INL sur la rétine dorsale et dans une petite partie de la rétine ventrale. CG) A 48 hpUV, des colonnes de cellules souches étaient présents dans la rétine dorsale, tandis que les cellules progénitrices simples sont présentes dans une petite partie de la rétine ventrale. D, H) A 48 HLT UV, de grandes colonnes de cellules progénitrices sont présents sur la rétine dorsale et ventrale. La barre d'échelle dans le panneau A représente 100 um et s'applique aux panneaux AH. Cliquez ici pour agrandir l'image .


Figure 6. Rod et la perte photorécepteur cône chez le poisson zèbre pigmentée suivant différents paradigmes de dégâts de lumière sections rétiniennes de type sauvage poisson zèbre adulte (AB) colorées avec TO-PRO-3 pour montrer tous les noyaux (AP, bleu). Et immunomarquées avec Zpr-3 pour montrer tige segments extérieurs (AH; magenta) ou Zpr-1 à cônes doubles (IP; or) dans la dorsale (AD, IJ) et ventrale (EH, MP) moitiés de la rétine après chacun des paradigmes de légers dégâts (48 HLT, 48 hpUV et UV +48 HLT). AH) des diminutions significatives de tige photorécepteur noyaux étaient présents dans la rétine dorsale à 48 HLT (B, Q) et dans la rétine dorsale et ventrale à UV +48 HLT (D, H, Q) . IP) Bien que les noyaux de cône ont été hypertrophié i n la rétine dorsale à 48 hpUV (K), aucune diminution significative de deux noyaux de cône étaient présents à 48 HLT ou 48 hpUV (JK, NO, R). Des diminutions importantes dans les noyaux des cônes étaient présents dans la rétine dorsale et ventrale à UV +48 HLT (L, P, R). QR) Quantification de la tige photorécepteur et double noyaux de cône à travers 300 um de la dorsale centrale ou de la rétine ventrale. Des différences significatives (p ≤ 0,05) entre les groupes sont représentés comme, "a" pour différent de 0 h, "b" pour différentes à partir de 48 HLT et "c" pour différentes à partir de 48 hpUV. La barre d'échelle dans le panneau A représente 200 um et s'applique aux panneaux AH. Cliquez ici pour agrandir l'image .

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Figure 7. réponse de prolifération chez le poisson zèbre pigmentée suivant divers dommages légers paradigmes. sections rétiniennes de type sauvage poisson zèbre adulte (AB) immunomarquées avec PCNA pour montrer la prolifération cellulaire (rouge) dans la dorsale (AD) et ventrale (EH) moitiés de la rétine après chaque les paradigmes légers dégâts (48 HLT, 48 hpUV et UV +48 HLT). Active Directory) dans la rétine dorsale, seules quelques cellules progénitrices simples étaient présents dans l'INL à 48 HLT et 48 hpUV (B, C), tandis que les colonnes de cellules souches étaient présents à UV +48 HLT (D). EH) Dans la rétine ventrale, aucun changement n'a été observé dans la prolifération sauf à UV +48 HLT (H), au cours de laquelle des colonnes de temps de cellules progénitrices étaient présents. La barre d'échelle dans le panneau A représente 100 um et s'applique aux panneaux AH.7/51017fig7highres.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image.

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Discussion

Ici, nous montrons que la combinaison d'une exposition aux UV court avec une lumière continuelles résultats d'exposition à une perte des photorécepteurs généralisée et une réponse de régénération robuste. En comparaison avec les méthodes de LIRD individuels, cette méthode combinée est aussi le protocole le plus efficace pour endommager les bâtonnets et les cônes dans les deux moitiés de la rétine. Surtout, ce traitement est efficace chez les animaux pigmentés ainsi que les animaux albinos.

Bien que nous fournissions des preuves que les résultats des protocoles combinés à des dommages plus étendus et cohérente par rapport aux méthodes LIRD individuelles, des considérations scientifiques devraient être discutées avant de choisir un paradigme LIRD. Nos données suggèrent que le procédé combiné doit être utilisé lorsque l'ensemble du tissu rétinien est collecté pour analyse (c.-à-protéomique, la PCR en temps réel). Nous avons constaté que la méthode combinée a eu le plus grand taille de la lésion, suivie par l'exposition d'halogène, et enfin l'exposition aux UV. Nous suggéronsque la méthode combinée également être utilisé lors d'enquêtes sur un gène ou une voie qui pourrait affecter différemment tige et la régénération de cône. Si ce n'est pas possible pour des raisons pratiques, nos données suggèrent que l'exposition aux rayons UV est la meilleure méthode suivante pour ces études, si l'analyse se limite à la rétine dorsale centrale.

Des considérations pratiques sont également garantis lors de la sélection de la méthode LIRD approprié. La première préoccupation est le coût de l'équipement nécessaire. Tous les protocoles nécessitent une longue période d'adaptation sombre (données non présentées). Une enceinte sombre autonome qui est intégré dans le module de logement poisson zèbre est très pratique, mais pas nécessaire. Même une boîte en carton peut être utilisé, si on prend soin de ruban ou sceller les joints et les paramètres de l'eau sont surveillés. La méthode LIRD base d'halogène est extrêmement économique et pratique. Tous les articles peuvent être achetés pour moins de 100 $ US à un magasin local de matériel et mis en place ne prend que quelques minutes. Til seul inconvénient pratique de cette méthode est l'inconvénient de travailler dans la même pièce que le traitement par la lumière. Les lumières de générer une bonne quantité de chaleur lors de l'exécution en continu pendant 4 jours, et l'intensité de lumière est à la fois distrayant et potentiellement dommageable pour la vision humaine. Les méthodes UV et combinés nécessitent une source UV, qui n'est pas disponible pour tous les laboratoires. En outre, un grand soin doit être pris pour assurer la sécurité des membres du laboratoire lors de l'exécution d'un traitement par la lumière UV. Ainsi, alors qu'il est plus commode d'avoir l'appareil de lumière halogène dans un espace isolé, les inquiétudes en matière de sécurité du traitement UV nécessitent un tel espace. Cela devient un inconvénient supplémentaire si la source UV utilisé pour le traitement de la lumière est aussi généralement utilisé pour un microscope à fluorescence logé dans une «salle de microscope» ou noyau d'imagerie. Effectuer plusieurs cycles de traitements UV pour le contrôle et le groupe expérimental d'animaux nécessiterait la fermeture de la salle de microscope pour un posteensive longueur de temps.

Peut-être le plus grand avantage à utiliser la méthode combinée est la capacité à réaliser des études de régénération rétiniennes sur les animaux pigmentés. Nous montrons que ni méthode individuelle entraîne une perte importante de bâtonnets et de cônes dans la rétine dorsale et ventrale. En revanche, les LIRD résultats de paradigme combinées à des niveaux similaires de tige et de pertes de cône dans les deux animaux pigmentés et albinos. La possibilité d'appliquer cette méthode LIRD aux animaux pigmentés sauve l'espace de chercheur significative, l'heure et le per diem des coûts des soins des animaux (le cas échéant), car elle élimine la nécessité de créer et maintenir des lignées transgéniques d'intérêt sur ​​le fond albinos pour les études de régénération rétiniennes . Ensemble, nous pensons que les avantages scientifiques et pratiques l'emportent sur les inconvénients potentiels de cette méthode de LIRD améliorée.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier Xixia Luo pour un excellent élevage de poissons et de soutien technique. Ce travail a été financé par le National Institutes of Health des subventions R21EY019401 (RT) et P30EY04068 (RT) national, et des fonds de démarrage à la température ambiante, y compris une subvention sans restriction de la recherche pour prévenir la cécité à la Wayne State University, Department of Ophthalmology. JT a été soutenue par un Thomas C. Rumble bourse fourni par l'école Wayne State University Graduate.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UV light source Leica EL600
Glass Petri dish (150 x 20 mm) Sigma-Aldrich/Pyrex CLS3160152BO
250 ml glass beaker Sigma-Aldrich/Pyrex CLS1000250
4 L glass beaker Sigma-Aldrich/Pyrex CLS10004L
Aluminum foil Fisher 01-213-105
250 W halogen lamps Workforce 265-669
1.8 L clear acrylic tanks Aquaneering ZT180T
1.8 L clear acrylic tank lids Aquaneering ZT180LCL
Fan Honeywell HT-900
Aerator Tetra 77853-900
Thermometer Cole-Parmer YO-08008-58
Bent forceps (5/45) World Precision Instruments 504155

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References

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Thomas, J. L., Thummel, R. A Novel… More

Thomas, J. L., Thummel, R. A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (80), e51017, doi:10.3791/51017 (2013).

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