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Neuroscience

Una novela ligera Paradigm daños para su uso en estudios de regeneración retiniana en adultos de pez cebra

Published: October 24, 2013 doi: 10.3791/51017
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Anatomy and Cell Biology, Wayne State University School of Medicine, 2Department of Opthalmology, Wayne State University School of Medicine

Summary

Múltiples protocolos de daño de la luz se han descrito a daños fotorreceptores y, por consiguiente inducir una respuesta de la regeneración de la retina en adultos de pez cebra. Este protocolo describe un método mejorado que se puede utilizar en animales pigmentados y que daña la gran mayoría de la varilla y fotorreceptores de los conos a través de toda la retina.

Abstract

La degeneración retiniana inducida por la luz (LIRD) se utiliza comúnmente en roedores y en pez cebra y daños a la varilla fotorreceptores de los conos. En el pez cebra adulto, degeneración de los fotorreceptores activa las células gliales de Müller para volver a entrar en el ciclo celular y la producción de progenitores transitoria-amplificación. Estos progenitores continúan proliferando a medida que migran a la zona dañada, donde se dan lugar en última instancia a nuevos fotorreceptores. Actualmente, hay dos paradigmas LIRD ampliamente utilizados, cada uno de los cuales da como resultado diversos grados de pérdida de fotorreceptores y las correspondientes diferencias en la respuesta de la regeneración. Como herramientas más genéticos y farmacológicos están disponibles para probar el papel de los genes individuales de interés durante la regeneración, hay una necesidad de desarrollar un paradigma LIRD robusta. Aquí se describe un protocolo LIRD que resulta en la pérdida generalizada y coherente de ambos fotorreceptores de los bastones y conos en el que hemos combinado el uso de dos técnicas LIRD previamente establecidos. Además, Este protocolo se puede extender para su uso en animales pigmentados, que elimina la necesidad de mantener las líneas transgénicas de interés en el fondo albino para estudios LIRD.

Introduction

La degeneración retiniana inducida por la luz (LIRD) se utiliza comúnmente en roedores y en pez cebra y daños a la varilla fotorreceptores de los conos. En el pez cebra adulto, degeneración de los fotorreceptores activa las células gliales de Müller para volver a entrar en el ciclo celular y la producción de progenitores transitoria-amplificación. Estos progenitores continúan proliferando a medida que migran a la zona dañada, donde se dan lugar en última instancia a nuevos fotorreceptores. Actualmente, hay dos paradigmas LIRD ampliamente utilizados, cada uno de los cuales da como resultado diversos grados de pérdida de fotorreceptores y las correspondientes diferencias en la respuesta de la regeneración. Como herramientas más genéticos y farmacológicos están disponibles para probar el papel de los genes individuales de interés durante la regeneración, hay una necesidad de desarrollar un paradigma LIRD robusta. Aquí se describe un protocolo LIRD que resulta en la pérdida generalizada y coherente de ambos fotorreceptores de los bastones y conos en el que hemos combinado el uso de dos técnicas LIRD previamente establecidos. Además, Este protocolo se puede extender para su uso en animales pigmentados, que elimina la necesidad de mantener las líneas transgénicas de interés en el fondo albino para estudios LIRD.

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Protocol

Todos los procedimientos descritos en este protocolo fue aprobado por el comité de la utilización de animales en la Facultad de Medicina de Wayne State University.

1. Adaptación a la oscuridad

  1. Transferencia ~ 10 peces adultos albino o pigmentado del sistema de vivienda normal en un recinto oscuro. Si está disponible, utilizar un recinto oscuro que está integrado en el módulo de vivienda pez cebra, que permite el flujo normal de agua a través del tanque. (Si tal sistema no está disponible, colocar el tanque de peces en un recinto completamente oscuro, asegurándose de airear el pescado con el oxígeno).
  2. Mantener a los peces en la oscuridad durante 10 días. Cuando la alimentación de los animales o la adición de nuevos peces a la caja oscura, asegúrese de avanzar lo más rápidamente posible para evitar la exposición de los peces a un largo período de luz.

2. Exposición a la luz UV

  1. Asegúrese de que la alimentación de la fuente de radiación UV es OFF. Retire el filamento de la luz UV fluorescentes estereoscópica.
    1. Use un invertida15 cm de diámetro de cristal placa de Petri (o algo parecido a 2 cm de altura) como soporte para el filamento UV. Tape la placa de Petri para la mesa del laboratorio.
    2. Tape el filamento de luz UV al principio del plato invertido Petri. Organizar de manera que ~ 2 mm del extremo de los salientes de filamentos de la placa de Petri.
  2. Obtener un vaso de 250 ml de vidrio. Cubra la mitad de la parte inferior, lados, y la parte posterior del vaso de precipitados con papel de aluminio, asegurándose de que el lado "brillante" de la lámina se enfrenta al interior del vaso de precipitados. Si se graduó el vaso, cubrir la mitad redactado del vaso con papel de aluminio, dejando el claro de la mitad de la copa expuesta.
  3. Llenar el vaso de precipitados de 250 ml con 100 ml de agua del sistema de instalación de peces.
  4. Coloque el vaso de 250 ml en un vaso de precipitados de 4 l. Llenar el vaso con 4 L de agua hasta que el nivel del agua está aún con la línea de agua de 100 ml en el vaso de 250 ml.
  5. Añadir un máximo de 10 animales tratados oscuro al vaso de 250 ml. Cubrir el vaso de 250 ml con una pequeña pieza de aluminiopapel de aluminio.
  6. Colocar todo el aparato vaso de precipitados inmediatamente adyacente al filamento UV. El filamento debe estar en contacto con el exterior del vaso de precipitados de 4 L y frente a la parte expuesta del vaso de precipitados de 250 ml. Asegúrese de que el vaso de precipitados de 250 ml se centra en la parte inferior del vaso de precipitados de 4 l.
  7. Coloque una grande, detrás de la pantalla opaca vaso de precipitados de 4 l, lo que permite a los animales a ser expuestos, pero la prevención de cualquier personal de laboratorio de ver la punta del filamento de UV. ADVERTENCIA: asegúrese de que esta barrera es en su lugar antes de conectar la alimentación a la fuente de UV.
  8. Encienda la fuente de alimentación de UV. Ajuste del temporizador durante 30 min. Coloque lo que las etiquetas de advertencia necesarias para asegurar que el personal de laboratorio desprevenidos no querer exponerse a la radiación UV.
  9. Después de 30 minutos, apague la fuente de energía UV. Retire el vaso de 250 ml con el pescado. NOTA: si se requieren múltiples rondas de exposición UV, vamos a la fuente de alimentación se enfríe (~ 20 min) antes de repetir el protocolo de exposición. Asegúrese de sustituir tque 100 ml de agua con sistema de agua dulce para cada exposición. El agua en el vaso de precipitados de 4 L no necesita ser reemplazado.

3. Halógena luz de la lámpara de exposición

  1. Transferir el pescado de 250 ml vaso en un claro L pecera 1.8 acrílico. Llenar el depósito hasta la marca de desbordamiento.
  2. Configure la lámpara de luz halógena área de tratamiento. Obtener cuatro 250 W Lámparas halógenas de servicios públicos en una ferretería local. Frente a dos lámparas en la misma dirección, organizar 29 cm de distancia en el centro. Colocar los otros dos lámparas en una manera similar.
    1. Coloque el segundo conjunto de lámparas de modo que se enfrentan a la primera serie de lámparas, dejando ~ 73 cm entre los dos conjuntos de lámparas. Esto crea un área de tratamiento de la luz en forma de rectángulo de 29 x 73 cm.
  3. Obtener un pequeño ventilador en una ferretería local. Coloque el ventilador equidistante entre los dos conjuntos de lámparas, a las afueras de la zona de tratamiento de la luz.
  4. Coloque dos 1.8 L tanques llenos de agua en el centro de laárea de tratamiento de la luz, a medio camino entre los dos conjuntos de lámparas. La distancia entre las lámparas y la pared exterior del tanque debe ser ~ 29 cm. Nota: aunque sólo el tratamiento de 10 peces en un tanque de 1.8 L, utilice este arreglo. Se necesitan tanto los tanques para mantener la temperatura del agua de cada tanque dentro del rango apropiado.
  5. Coloque un aireador de oxígeno en cada tanque.
  6. Cubra cada tanque con tapas de acrílico transparente, dejando una brecha de ~ 2 cm en el extremo más cercano al ventilador. Organizar el ventilador para que sople aire dentro de este vacío. Coloque un termómetro en uno o ambos de los tanques.
  7. Encienda la energía a las luces, ventiladores, y aireadores. Mantener el tratamiento de la luz para un máximo de 4 días. El pescado no debe ser alimentado durante el tratamiento de la luz, ya que esto afectará la calidad del agua y dar lugar a más estrés a los animales.
  8. Controle la temperatura y del nivel del agua sobre una base diaria. Mantener la temperatura a 30-33 ° C. Si es necesario, ajustar la velocidad del ventilador y / o la distancia entre los tanques y la lilos dere.
    1. Remate de cada tanque de agua de la instalación, según sea necesario, por lo general todos los días.
    2. Siempre use pez cebra adulto sano (típicamente 6-9 meses de edad) para mantener una tasa de supervivencia de cerca de 100%. Sin embargo, si un pez es encontrado muerto en el tanque, retire inmediatamente y reemplazar el agua en todo el tanque.

4. Colección de tejidos

  1. 48 horas después de la aparición del tratamiento con luz halógeno eliminar el pescado de la zona de tratamiento.
    1. Preparar fijador formaldehído etanólico fresca (1 parte de 37% de formaldehído, 9 partes de etanol 100%).
    2. La eutanasia de pez cebra con una sobredosis anestésica de 2-fenoxietanol (0,4 mg / L).
    3. Transferir el pez cebra eutanasia a una toalla de papel. Enucleación del ojo utilizando pinzas curvas.
    4. Coloque ojos enucleados en fijador y almacenar O / N a 4 ° C.
  2. Cryoprotect los ojos.
    1. Lavar los ojos en 5% de sacarosa 1x PBS durante 30 min a temperatura ambiente, a continuación, reemplazar confresca 5% de sacarosa 1x PBS durante 2 hr. A continuación, lavar los ojos en el 30% de sacarosa 1x PBS O / N a 4 ° C. Lavar los ojos en una mezcla 1:1 (partes iguales) de medio de congelación tisular y 30% de sacarosa 1x PBS O / N a 4 ° C.
  3. Insertar los ojos en el 100% de medio de congelación de tejido y se almacenan a -80 ° C. Oriente los ojos de manera que cryosectioning del tejido se realiza en el eje dorsal / ventral.
  4. Cryosection el tejido y el lugar en portaobjetos de vidrio. Diapositivas caliente durante 2 horas a 55 ° C. Diapositivas Almacenar a -80 ° C o realizar inmediatamente inmunohistoquímica estándar.
  5. Realizar inmunohistoquímica estándar sobre el tejido seccionado y la imagen con microscopía de fluorescencia 40,51.

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Representative Results

El protocolo de tratamiento de la luz hasta ahora descrito se comparó con cada método de LIRD. En los animales albinos adultos tratados con oscuro (Figuras 3-5), los tratamientos de luz individuales dieron como resultado una pérdida significativa de la varilla (figura 3) y el cono (Figura 4) fotorreceptores. Sin embargo, ambos tratamientos individuales dañados principalmente fotorreceptores en la mitad dorsal de la retina, dejando la retina ventral relativamente protegido de los tratamientos de luz (Figuras 3 y 4). Además, en comparación con el tratamiento con luz halógena, el tratamiento con luz UV daña más conos en la mitad dorsal de la retina (compárense las Figuras 4B con C, respectivamente). La combinación de los tratamientos de luz UV y halógeno resultó en significativamente mayor pérdida de tanto varilla y fotorreceptores de los conos a lo largo de la retina, en gran medida la eliminación de la Neuroprotection de la media ventral de la retina (Figuras 3 y 4). En comparación con los métodos LIRD individuales, también se observó un aumento correspondiente en la proliferación en la retina ventral cuando se utilizó el protocolo de tratamiento combinado de la luz (Figura 5).

Animales pigmentadas son más resistentes a la LIRD debido al epitelio pigmentario de la retina, la cual absorbe la luz y protege los fotorreceptores de fototoxicidad. Animales pigmentadas Como era de esperar, adaptados a la oscuridad eran casi completamente resistentes al tratamiento de luz halógena solo (Figuras 6B, J, y N). Se encontró que 48 horas después del inicio de la luz, la vara fotorreceptores se redujeron en la retina dorsal, pero no retina ventral (Figura 6E, F, preguntas y respuestas). Cono fotorreceptores núcleos estaban presentes en un número normal (Figura 6R). En comparación con retinas no tratadas, luz halógenotratamiento por sí solo también no aumentó la proliferación de células gliales Müller 48 horas después del inicio de la luz (figuras 7B y C). En los animales albinos, tratamiento con luz UV solo resultado ligeramente mayor daño a ambos fotorreceptores conos y bastones de la retina dorsal (Figura 3I y 4I). Sin embargo, en los animales pigmentadas, tratamiento con luz ultravioleta sola no redujo significativamente el número de células varilla o cono (Figuras 6C, G, K, O, Q y R). Además, el tratamiento UV solos sólo provocó una débil respuesta regenerativa en el medio dorsal de la retina en animales pigmentados (Figura 7C). En contraste con los resultados LIRD individuales, la combinación de la UV y tratamientos de luz de halógeno resultó en significativamente mayor daño fotorreceptor y la respuesta regenerativa en los animales pigmentadas. Es importante destacar que se observó una pérdida significativa de ambos conos y bastones, tanto en la parte dorsal l y ventral retinas (Figuras 6D, H, L, P, Q y R). En comparación con los métodos LIRD no tratados e individual, también se observó un aumento correspondiente en la proliferación tanto en mitades dorsal y ventral de la retina cuando se utilizó el protocolo de tratamiento combinado de la luz (Figura 5).

Figura 1
Figura 1. Fotografía que muestra la configuración del tratamiento con luz halógena. Dos juegos de cuatro lámparas halógenas de 250 W se espaciaron 29 cm a cada lado de dos tanques de acrílico 1,8 L claras. El aireador y tubos fueron colocados de forma que no obstruya la luz. Las tapas de los tanques estaban agrietadas 2 cm para permitir el flujo de aire desde el ventilador. Un termómetro se coloca en uno de los tanques para la temperatura a monitorizar.arget = "_blank"> Haga clic para ampliar la imagen.

La figura 2
Figura 2. Fotografía que muestra la configuración del tratamiento con luz UV. La fuente de luz UV de un microscopio estereoscópico fluorescente fue fijado firmemente a una placa de Petri de vidrio ~ 2 cm de la parte superior del banco. Un vaso de precipitados de vidrio de 250 ml, parcialmente envuelto en papel de aluminio, se llenó voluntad 100 ml de agua del sistema. Los peces fueron colocados en el interior del vaso de 250 ml. El vaso de precipitados de 250 ml se centró dentro de un vaso de precipitados de 4 L, que estaba llena de agua del sistema con el nivel del agua en el vaso de precipitados de 250 ml. El 4 L vaso de precipitados se coloca al lado del filamento de luz centrada en el vaso de 250 ml. Una gran pantalla opaca se colocó alrededor de toda la instalación. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .


Figura 3. Barra de la pérdida de fotorreceptores en el pez cebra albina tras varios daños ligeros paradigmas secciones de retina adulta Tg (NRD: egfp). / Alb immunolabeled con las buenas prácticas agrarias para mostrar la barra de densidad de fotorreceptores (verde) en el dorsal (AD) y ventral (EH) reduce a la mitad de la retina . A, E) Antes del inicio de la iluminación (0 h), los núcleos de los fotorreceptores varilla EGFP-positivas (ONL) y los segmentos externos (ROS) se puede visualizar. B, C) ​​A las 48 h siguientes al inicio de la luz halógena (HLT), truncada ROS y significativamente menos núcleos varilla (I) estaban presentes en el dorsal, pero no la retina ventral. CG) A las 48 h después de 30 min de exposición a UV (hpUV), un número significativamente menor núcleos varilla estaban presentes en las retinas dorsal y ventral en comparación con 0 hr (C, G < / Strong>), pero no 48 tratamientos Equipo de Alto Nivel (G, I). DH) 48 horas siguientes al inicio del tratamiento combinado de luz (30 min exposición UV seguido por el tratamiento de halógeno; UV 48 Equipo de Alto Nivel), casi no hay ROS estaban presentes en las retinas dorsal o ventral, además de una pérdida significativa de la varilla fotorreceptor núcleos (I) . I) La cuantificación de la varilla de núcleos de fotorreceptores a través de 300 micras de la dorsal central o retina ventral. Diferencias significativas (p ≤ 0.05) entre los grupos se representan como: "a" de diferente de 0 hr, "b" para diferentes de 48 Equipo de Alto Nivel y "c" para diferentes de 48 hpUV. Barra de escala en el panel A representa 50 micras y se aplica a los paneles AH. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

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La Figura 4. Pérdida de doble cono en el pez cebra albina tras varios daños ligeros paradigmas. Secciones de retina del pez cebra adulto albino immunolabeled con Zpr-1 para mostrar conos dobles (oro) en el dorsal (AD) y mitades ventral (EH) de la retina después de cada una de la luz paradigmas de daños (48 HLT, 48 hpUV y UV 48 HLT). A, E) a 0 horas, los núcleos de doble cono estaban presentes en la retina dorsal y ventral. B, F) Al 48 Equipo de Alto Nivel, un número significativamente menor conos dobles estaban presentes en sólo la retina ventral (F, I). CG) En 48 hpUV, un número significativamente menor conos dobles (I) y una gran cantidad de restos estaba presente sólo en la retina dorsal (C), mientras que no se observaron cambios en la retina ventral (G). DH) A UV 48 Equipo de Alto Nivel, un número significativamente menor de cono dobles (I) y muy poco escombros estaba presente en las retinas dorsal y ventral. I) La cuantificación de conos dobles a través de 300 micras de la dorsal central o retina ventral. Diferencias significativas (p ≤ 0.05) entre los grupos se representan como, "a" de diferente de 0 hr, "b" para diferentes de 48 Equipo de Alto Nivel y "c" para diferentes de 48 hpUV. Barra de escala en el panel A representa a 100 micras y se aplica a los paneles AH. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

La figura 5
Figura 5. Los cambios son respuesta de proliferación después de varios daños ligeros paradigmas. Secciones de retina de pez cebra adulto albino immunolabeled con PCNA para mostrar la proliferación celular (en rojo) enel dorsal (AD) y ventral (EH) mitades de la retina después de cada uno de los daños ligeros paradigmas (48 HLT, 48 hpUV y UV 48 HLT). AE) a 0 horas, la proliferación estuvo ausente de la capa nuclear interna ( INL). B, F) Al equipo de alto nivel 48, las células progenitoras individuales estaban presentes en la INL través de la retina dorsal y en una pequeña parte de la retina ventral. CG) En 48 hpUV, columnas de células progenitoras estaban presentes en la retina dorsal, mientras que sólo las células progenitoras individuales estaban presentes en una pequeña porción de la retina ventral. D, H) en la UV 48 Equipo de Alto Nivel, grandes columnas de células progenitoras estaban presentes a través de la retina dorsal y ventral. Barra de escala en el panel A representa a 100 micras y se aplica a los paneles AH. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .


La Figura 6. Conos y bastones fotorreceptores pérdida en el pez cebra pigmentada tras varios daños ligeros paradigmas secciones de retina de pez cebra adultos de tipo salvaje (AB) teñidas con A-PRO-3 para mostrar todos los núcleos (AP, azul). Immunolabeled y con Zpr-3 para mostrar la barra segmentos externos (AH, magenta) o Zpr-1 a los conos dobles (IP, el oro) en el dorsal (AD, IJ) y ventral (EH, MP) mitades de la retina después de cada uno de los daños ligeros paradigmas (48 HLT, 48 hpUV y UV 48 HLT). AH) una disminución significativa en la varilla fotorreceptor núcleos estaban presentes en la retina dorsal a 48 hl (B, Q) y en la retina dorsal y ventral a UV 48 Equipo de Alto Nivel (D, H, Q) . IP) Aunque núcleos cono se hipertrofiado i n la retina dorsal a 48 hpUV (K), no hay una disminución significativa en los núcleos de doble cono estuvieron presentes en 48 o 48 hpUV Equipo de Alto Nivel (JK, NO, R). Disminuciones significativas en los núcleos cono estaban presentes en la retina dorsal y ventral en la UV 48 Equipo de Alto Nivel (L, P, R). QR) La cuantificación de la varilla de fotorreceptores y los núcleos de doble cono a través de 300 micras de la dorsal central o retina ventral. Diferencias significativas (p ≤ 0.05) entre los grupos se representan como, "a" de diferente de 0 hr, "b" para diferentes de 48 Equipo de Alto Nivel y "c" para diferentes de 48 hpUV. Barra de escala en el panel A representa a 200 micras y se aplica a los paneles AH. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

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Figura 7. Respuesta de proliferación en el pez cebra pigmentada siguiendo diversos daños ligeros paradigmas. Secciones de retina de pez cebra adultos de tipo salvaje (AB) immunolabeled con PCNA para mostrar la proliferación celular (rojo) en el dorsal (AD) y ventral (EH) reduce a la mitad de la retina después de cada una de la luz de los paradigmas de daños (48 HLT, 48 hpUV y UV 48 HLT). AD) en la retina dorsal, sólo unas pocas células progenitoras estaban presentes en el INL a 48 Equipo de Alto Nivel y 48 hpUV (B, C), mientras que las columnas de las células progenitoras estaban presentes en la UV 48 Equipo de Alto Nivel (D). EH) En la retina ventral, no se observaron cambios en la proliferación, excepto en la UV 48 Equipo de Alto Nivel (H), en el que columnas de la hora de las células progenitoras estaban presentes. Barra de escala en el panel A representa a 100 micras y se aplica a los paneles AH.7/51017fig7highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic para ampliar la imagen.

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Discussion

Aquí nos muestran que la combinación de una exposición a UV corta con una luz brillante continua exposición resulta en la pérdida de fotorreceptores extendida y una respuesta robusta regeneración. En comparación con los métodos LIRD individuales, este método combinado es también el protocolo más eficaz para dañar los dos conos y bastones en ambas mitades de la retina. Es importante destacar que este tratamiento es eficaz en animales pigmentadas, así como animales albinos.

A pesar de aportar pruebas de que los resultados del protocolo combinado en un daño más generalizado y constante en comparación con los métodos LIRD individuales, las consideraciones científicas deben ser discutidos antes de seleccionar un paradigma LIRD. Nuestros datos sugieren que el método combinado debe ser utilizada cuando todo el tejido de la retina se recoge para análisis (es decir, la proteómica, la PCR en tiempo real). Hemos encontrado que el método combinado tuvo el mayor tamaño de la lesión, seguido por la exposición de halógeno, y, finalmente, la exposición a rayos UV. Sugerimosque el método combinado también se puede utilizar en la investigación de un gen o vía que podría afectar diferencialmente varilla y la regeneración de cono. Si esto no es posible por razones prácticas, nuestros datos sugieren que la exposición a rayos UV es la siguiente mejor método para estos estudios, si el análisis se limita a la retina dorsal central.

Consideraciones prácticas también están garantizados para seleccionar el método LIRD apropiado. La primera preocupación es el coste del equipo necesario. Todos los protocolos requieren un prolongado período de adaptación a la oscuridad (datos no mostrados). Un recinto oscuro autónomo que está integrado en el módulo de vivienda pez cebra es muy conveniente, pero no necesario. Incluso una caja de cartón podría ser utilizado, si se tiene cuidado en cinta o sellar las costuras, y los parámetros del agua son monitoreados. El método LIRD a base de halógeno es extremadamente económico y conveniente. Todos los artículos se pueden comprar por menos de 100 dólares EE.UU. en una ferretería local y establecer tarda sólo unos minutos. Tsólo desventaja práctica de este método es el inconveniente de trabajar en la misma habitación que el tratamiento de la luz. Las luces generan una buena cantidad de calor al funcionar de forma continua durante 4 días y la intensidad de la luz es a la vez molesto y potencialmente perjudicial para la visión humana. Los métodos de UV y combinado requieren una fuente de UV, que no está disponible para todos los laboratorios. Además, el gran cuidado se debe tomar para garantizar la seguridad de los miembros del laboratorio cuando se realiza un tratamiento con luz UV. Por lo tanto, mientras que es más conveniente tener el aparato de luz halógena en un espacio aislado, los problemas de seguridad de la UV necesitan tal tratamiento un espacio. Esto se convierte en un inconveniente adicional si la fuente de UV utilizada para el tratamiento de la luz también se utiliza típicamente para un microscopio de fluorescencia alojados en una habitación "microscopio" o núcleo formador de imágenes. La realización de varias rondas de tratamientos UV para el control y los grupos experimentales de animales sería necesario el cierre de la sala de microscopio en busca de un extlongitud Ensive de tiempo.

Tal vez la mayor ventaja de utilizar el método combinado es la capacidad para llevar a cabo estudios de regeneración retina en animales pigmentadas. Se demuestra que ninguno de los métodos resultados individuales en una pérdida significativa de bastones y conos en la retina dorsal y ventral. En contraste, los resultados combinados de paradigma LIRD en niveles similares de varilla extendida y la pérdida de cono en ambos animales pigmentadas y albino. La posibilidad de aplicar este método a los animales LIRD pigmentadas ahorra el espacio investigadora significativa, el tiempo y los costos de viáticos cuidado de los animales (en su caso), ya que elimina la necesidad de generar y mantener las líneas transgénicas de interés en el fondo albino para estudios de regeneración retiniana . Juntos, creemos que las ventajas científicas y prácticas superan a los inconvenientes potenciales de este método LIRD mejorado.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a Xixia Luo excelente para la cría de peces y soporte técnico. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones R21EY019401 (RT) y P30EY04068 (RT), y los fondos de puesta en marcha a la temperatura ambiente, incluida una subvención sin restricciones de Investigación para Prevención de la Ceguera a la Universidad Estatal de Wayne, Departamento de Oftalmología. JT fue apoyado por una beca Thomas C. Rumble proporcionado por la Escuela de Graduados de la Universidad Estatal Wayne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UV light source Leica EL600
Glass Petri dish (150 x 20 mm) Sigma-Aldrich/Pyrex CLS3160152BO
250 ml glass beaker Sigma-Aldrich/Pyrex CLS1000250
4 L glass beaker Sigma-Aldrich/Pyrex CLS10004L
Aluminum foil Fisher 01-213-105
250 W halogen lamps Workforce 265-669
1.8 L clear acrylic tanks Aquaneering ZT180T
1.8 L clear acrylic tank lids Aquaneering ZT180LCL
Fan Honeywell HT-900
Aerator Tetra 77853-900
Thermometer Cole-Parmer YO-08008-58
Bent forceps (5/45) World Precision Instruments 504155

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Thomas, J. L., Thummel, R. A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (80), e51017, doi:10.3791/51017 (2013).

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