Summary
وقد وصفت متعددة البروتوكولات وقوع اضرار طفيفة للتلف خلايا مستقبلة للضوء وبالتالي تحفز على استجابة التجدد الشبكية في الزرد الكبار. يصف هذا البروتوكول وسيلة المحسنة التي يمكن استخدامها في الحيوانات المصطبغة وهذا يدمر الغالبية العظمى من قضيب مبصرات مخروط وعبر شبكية العين بأكملها.
Abstract
يستخدم تنكس الشبكية الناجم عن الضوء (LIRD) عادة في كل من القوارض والزرد إلى قضيب الضرر ومبصرات مخروط. في الزرد الكبار، تنكس مبصرة يؤدي الخلايا الدبقية مولر إلى إعادة إدخال دورة الخلية وإنتاج الأسلاف عابر تضخيم. تستمر هذه الأسلاف لتتكاثر كما تهاجر إلى المنطقة المتضررة، حيث أنها تعطي في نهاية المطاف إلى نشوء خلايا مستقبلة للضوء جديد. حاليا، هناك نوعان من النماذج المستخدمة على نطاق واسع LIRD، كل منها يؤدي إلى درجات متفاوتة من فقدان مبصرة والاختلافات المناظرة في استجابة التجدد. كما هي أدوات أكثر الوراثية والدوائية المتاحة لاختبار دور الجينات الفردية من الفائدة خلال التجديد، هناك حاجة إلى تطوير نموذج LIRD قوية. نحن هنا وصف بروتوكول LIRD أن يؤدي إلى خسارة على نطاق واسع وثابت من كل قضيب ومخروط خلايا مستقبلة للضوء الذي جمعنا بين استخدام اثنين من التقنيات LIRD المحددة سابقا. علاوة على ذلك، ويمكن تمديد هذا البروتوكول للاستخدام في الحيوانات المصطبغة، مما يلغي الحاجة للحفاظ على خطوط المعدلة وراثيا من الفائدة على خلفية البيضاء للدراسات LIRD.
Introduction
يستخدم تنكس الشبكية الناجم عن الضوء (LIRD) عادة في كل من القوارض والزرد إلى قضيب الضرر ومبصرات مخروط. في الزرد الكبار، تنكس مبصرة يؤدي الخلايا الدبقية مولر إلى إعادة إدخال دورة الخلية وإنتاج الأسلاف عابر تضخيم. تستمر هذه الأسلاف لتتكاثر كما تهاجر إلى المنطقة المتضررة، حيث أنها تعطي في نهاية المطاف إلى نشوء خلايا مستقبلة للضوء جديد. حاليا، هناك نوعان من النماذج المستخدمة على نطاق واسع LIRD، كل منها يؤدي إلى درجات متفاوتة من فقدان مبصرة والاختلافات المناظرة في استجابة التجدد. كما هي أدوات أكثر الوراثية والدوائية المتاحة لاختبار دور الجينات الفردية من الفائدة خلال التجديد، هناك حاجة إلى تطوير نموذج LIRD قوية. نحن هنا وصف بروتوكول LIRD أن يؤدي إلى خسارة على نطاق واسع وثابت من كل قضيب ومخروط خلايا مستقبلة للضوء الذي جمعنا بين استخدام اثنين من التقنيات LIRD المحددة سابقا. علاوة على ذلك، ويمكن تمديد هذا البروتوكول للاستخدام في الحيوانات المصطبغة، مما يلغي الحاجة للحفاظ على خطوط المعدلة وراثيا من الفائدة على خلفية البيضاء للدراسات LIRD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافق جميع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول من قبل لجنة استخدام الحيوانات في مدرسة جامعة واين ستيت في كلية الطب.
1. التكيف مع الظلام
- نقل ~ 10 الكبار الأسماك البيضاء أو المصطبغة من نظام الإسكان العادي في العلبة المظلمة. إذا كانت متوفرة، استخدام العلبة المظلمة التي بنيت في وحدة سكنية الزرد، والذي يسمح لتدفق المياه الطبيعية من خلال الخزان. (إذا كان مثل هذا النظام غير متوفر، ووضع حوض للأسماك في الضميمة مظلمة تماما، والتأكد من أن يهوي السمك مع الأكسجين).
- الحفاظ على الأسماك في الظلام لمدة 10 يوما. عند تغذية الحيوانات أو إضافة أسماك جديدة إلى مربع مظلم، للتأكد من التحرك بأسرع وقت ممكن لتجنب تعريض الأسماك لفترة طويلة من ضوء.
2. الأشعة فوق البنفسجية التعرض للضوء
- تأكد من قوة إلى مصدر للأشعة فوق البنفسجية هو OFF. إزالة خيوط ضوء الأشعة فوق البنفسجية من stereomicroscope الفلورسنت.
- استخدام مقلوب15 سم القطر الزجاج طبق بتري (أو شيء من مماثلة 2 سم ارتفاع) باعتبارها تقف لخيوط الأشعة فوق البنفسجية. الشريط طبق بيتري على مقاعد البدلاء المختبر.
- الشريط خيوط ضوء الأشعة فوق البنفسجية إلى أعلى طبق بتري المقلوب. ترتيب بحيث ~ 2 ملم من نهاية يتدلى خيوط طبق بيتري.
- الحصول على 250 مل دورق زجاجي. تغطية ½ من القاع، والجانبين، والجزء الخلفي من الدورق مع رقائق الألومنيوم، والتأكد من الجانب "لامعة" من احباط يواجه الداخلية من الدورق. إذا تخرج الكأس، وتغطي النصف اللهجة من الدورق مع احباط، وترك نصف اضحة من الدورق عرضة للخطر.
- ملء كوب 250 مل مع 100 مل من الماء من نظام مرفق الأسماك.
- ضع الدورق 250 مل في دورق L 4. ملء كوب L 4 مع الماء حتى مستوى الماء حتى مع خط المياه 100 مل في دورق 250 مل.
- إضافة بحد أقصى 10 معاملة الحيوانات غامق إلى الدورق 250 مل. تغطية الدورق 250 مل مع قطعة صغيرة من الألمنيوماحباط.
- وضع جهاز دورق كامل متاخم لخيوط الأشعة فوق البنفسجية. خيوط ينبغي أن لمس السطح الخارجي للدورق L 4 والتي تواجه جزء مكشوف من الدورق 250 مل. تأكد من أن الدورق 250 مل يتركز في الجزء السفلي من الكأس L 4.
- ضع كبيرة، وشاشة مبهمة وراء الدورق 4L، مما يسمح للحيوانات أن تتعرض، ولكن منع أي أفراد المختبر من رؤية غيض من خيوط الأشعة فوق البنفسجية. تحذير: تأكد من هذا الحاجز هو في المكان قبل تشغيل الطاقة إلى مصدر للأشعة فوق البنفسجية.
- بدوره على مصدر الطاقة للأشعة فوق البنفسجية. تعيين مؤقت لمدة 30 دقيقة. وضع علامات تحذير كل ما يلزم للتأكد من أن أفراد المختبر المطمئنين لا تعرض نفسها بطريق الخطأ للأشعة فوق البنفسجية.
- بعد 30 دقيقة، اغلاق مصدر الطاقة للأشعة فوق البنفسجية. إزالة الدورق 250 مل مع السمك. ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة جولات متعددة من التعرض للأشعة فوق البنفسجية، والسماح للمصدر الطاقة يبرد (~ 20 دقيقة) قبل تكرار التعرض البروتوكول. تأكد من استبدال رانه 100 مل من الماء بالماء نظام جديد للحصول على كل تعرض. لا يحتاج الماء في دورق L 4 لتحل محلها.
3. الهالوجين مصباح التعرض للضوء
- نقل الأسماك من 250 مل دورق إلى 1.8 L الاكريليك واضحة خزان الأسماك. ملء خزان إلى علامة تجاوز.
- إعداد مصباح ضوء الهالوجين منطقة العلاج. الحصول على أربعة 250 W مصابيح الهالوجين فائدة من متجر لاجهزة الكمبيوتر المحلي. تواجه اثنين من مصابيح في نفس الاتجاه، وترتيب 29 سم بعيدا عن المركز. ترتيب غيرها من المصابيح اثنين بطريقة مماثلة.
- وضع المجموعة الثانية من المصابيح بحيث أنهم يواجهون أول مجموعة من المصابيح، وترك ~ 73 سم في بين مجموعتين من المصابيح. وهذا يخلق منطقة المعالجة ضوء على شكل مستطيل من 29 × 73 سم.
- الحصول على مروحة صغيرة من متجر لاجهزة الكمبيوتر المحلي. وضع مروحة على مسافة واحدة بين مجموعتين من المصابيح، خارج للتو من منطقة المعالجة الخفيفة.
- وضع اثنين من الدبابات 1.8 L كامل من الماء في وسطمنطقة المعالجة الخفيفة، وعلى مسافة واحدة بين مجموعتين من المصابيح. المسافة بين المصابيح والجدار الخارجي لخزان الوقود يجب أن يكون ~ 29 سم. ملاحظة: حتى لو كان فقط 10 علاج الأسماك في خزان واحد 1.8 L، استخدم هذا الترتيب. وهناك حاجة إلى كل من الدبابات للحفاظ على درجة حرارة الماء من كل خزان ضمن النطاق المناسب.
- وضع جهاز للإشباع بالهواء الأكسجين في كل خزان.
- تغطية كل خزان مع الأغطية الاكريليك واضحة، وترك ~ 2 سم الفجوة في نهاية الأقرب إلى مروحة. ترتيب مروحة بحيث سوف تهب الهواء إلى هذه الفجوة. وضع ميزان الحرارة في واحد أو كلا من الدبابات.
- بدوره على السلطة إلى الأضواء، مروحة، وأجهزة التهوية. الحفاظ على ضوء العلاج لمدة تصل إلى 4 أيام. لا ينبغي أن يتم تغذية الأسماك خلال العلاج ضوء، لأن هذا سوف تؤثر على نوعية المياه ويؤدي إلى مزيد من الضغط على الحيوانات.
- رصد درجة الحرارة ومنسوب المياه على أساس يومي. المحافظة على درجة حرارة 30-33 درجة مئوية. إذا لزم الأمر، وضبط سرعة المروحة و / أو المسافة بين الدبابات ولىghts.
- أعلى قبالة كل خزان المياه مع نظام حسب الحاجة، عادة يومية.
- دائما استخدام الزرد البالغين الأصحاء (عادة 6-9 أشهر من العمر) للحفاظ على معدل البقاء على قيد الحياة من قرب 100٪. ومع ذلك، إذا تم العثور على الأسماك النافقة في الخزان، وإزالته فورا واستبدال المياه في الخزان بأكمله.
4. مجموعة الأنسجة
- 48 ساعة بعد بداية العلاج ضوء الهالوجين إزالة الأسماك من منطقة العلاج.
- إعداد الطازجة تثبيتي الايثانول الفورمالديهايد (1 جزء الفورمالديهايد بنسبة 37٪، 9 أجزاء الإيثانول بنسبة 100٪).
- الموت ببطء الزرد مع جرعة زائدة من مخدر 2-فينوكسييثانول (0.4 ملغم / لتر).
- نقل الزرد الموت الرحيم إلى منشفة ورقية. استأصل العين باستخدام ملقط المنحني.
- ضع عيون منزوعة النواة في تثبيتي، ومخزن O / N عند 4 درجة مئوية.
- Cryoprotect العينين.
- غسل العينين في 5٪ سكروز برنامج تلفزيوني 1X لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم استبدل معالطازجة 5٪ سكروز برنامج تلفزيوني 1X لمدة 2 ساعة. المقبل، وغسل العيون في 30٪ سكروز 1X PBS O / N عند 4 درجة مئوية. غسل العينين في 01:01 (أجزاء متساوية) من الأنسجة تجميد المتوسطة و 30٪ سكروز 1X PBS O / N عند 4 درجة مئوية.
- تضمين عيون في 100٪ نسيج تجميد المتوسطة وتخزينها في -80 درجة مئوية. توجيه نظر بحيث يتم تنفيذ cryosectioning من النسيج على المحور الظهري / بطني.
- Cryosection الأنسجة ومكان على الشرائح الزجاجية. الشرائح دافئ لمدة 2 ساعة على 55 درجة مئوية. الشرائح مخزن في -80 درجة مئوية أو تنفيذ فورا المناعية القياسية.
- أداء المناعية القياسية على الأنسجة مقطوع والصورة مع المجهر الفلورسنت 40،51.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تمت مقارنة نظام العلاج ضوء المذكورة حتى الآن إلى كل أسلوب الفردية من LIRD. في الحيوانات البيضاء الكبار المعالجة غامق (الشكلان 3-5)، أدى ضوء العلاجات الفردية في خسارة كبيرة من قضيب (الشكل 3) ومخروط (الشكل 4) خلايا مستقبلة للضوء. ومع ذلك، كل العلاجات الفردية تلف في المقام الأول المستقبلات الضوئية في النصف الظهري من شبكية العين، وترك شبكية العين بطني محمية نسبيا من العلاجات الخفيفة (الشكلان 3 و 4). وبالإضافة إلى ذلك، مقارنة مع العلاج ضوء الهالوجين، تلف العلاج ضوء الأشعة فوق البنفسجية أكثر مبصرات مخروط في النصف الظهري من شبكية العين (قارن مع أرقام 4B C، على التوالي). الجمع بين الأشعة فوق البنفسجية والعلاجات الهالوجين ضوء أدى إلى خسارة أكبر بكثير لكلا قضيب ومبصرات مخروط في جميع أنحاء شبكية العين، والقضاء إلى حد كبير على نeuroprotection من النصف البطنية من شبكية العين (الشكلان 3 و 4). مقارنة مع الأساليب LIRD الفردية، لوحظ وجود زيادة مقابلة في الانتشار أيضا في شبكية العين بطني عندما تم استخدام بروتوكول العلاج ضوء مجتمعة (الشكل 5).
الحيوانات المصطبغة قد تكون أكثر مقاومة للLIRD بسبب الظهارة الصباغية الشبكية، التي تمتص الضوء، ويحمي خلايا مستقبلة للضوء من الضيائية. كانت الحيوانات المصطبغة كما هو متوقع، داكنة تكييفها تقريبا مقاومة للعلاج ضوء الهالوجين وحده (أرقام 6B، J، وN) تماما. وجدنا أن 48 ساعة بعد ظهور ضوء، خفضت المستقبلات الضوئية في شبكية العين قضيب الظهرية، ولكن ليس شبكية العين بطني (أرقام 6E، F، وس). مخروط مبصرة النوى كانت موجودة في الأعداد الطبيعية (الشكل 6R). مقارنة مع شبكية العين دون علاج، وعلى ضوء الهالوجينالعلاج وحده كما لم مولر زيادة تكاثر الخلايا الدبقية 48 ساعة بعد ظهور ضوء (أرقام 7B و F). في الحيوانات البيضاء، أسفرت العلاج ضوء الأشعة فوق البنفسجية وحدها في أكبر قليلا الأضرار التي لحقت كلا قضيب ومخروط خلايا مستقبلة للضوء في شبكية العين الظهرية (أرقام 3I و4I). ومع ذلك، في الحيوانات المصطبغة، العلاج ضوء الأشعة فوق البنفسجية وحده لا تقلل إلى حد كبير قضيب أو مخروط عدد الخلايا (أرقام 6C، G، K، O، Q، R و). وبالإضافة إلى ذلك، العلاج بالأشعة فوق البنفسجية وحدها أثارت سوى استجابة ضعيفة التجدد في النصف الظهري من شبكية العين في الحيوانات المصطبغة (الشكل 7C). وعلى النقيض من نتائج LIRD الفردية، والجمع بين الأشعة فوق البنفسجية والعلاجات ضوء الهالوجين أدى إلى ضرر أكبر بكثير مبصرة واستجابة التجدد في الحيوانات المصطبغة. الأهم من ذلك، لوحظ فقدان كبير في كل من قضبان ومخاريط في كل من dorsa L وبطني شبكية العين (أرقام 6D، H، L، P، Q، R و). بالمقارنة مع الطرق LIRD غير المعالجة والفردية، لوحظ وجود زيادة مقابلة في الانتشار أيضا في كلا نصفي ظهري وبطني من شبكية العين عندما تم استخدام بروتوكول العلاج ضوء مجتمعة (الشكل 5).
الشكل 1. صورة تصور ضوء الإعداد العلاج الهالوجين. كانت متباعدة مجموعتين من أربعة مصابيح الهالوجين 250 W 29 سم على جانبي اثنين واضح 1.8 L الدبابات الاكريليك. وضعت مهوية والأنابيب بحيث لا تعيق ضوء. وقد تصدع الأغطية من الدبابات 2 سم للسماح تدفق الهواء من المروحة. وضعت مقياس الحرارة في واحدة من الدبابات لدرجة الحرارة التي يتعين رصدها. arget = "_blank"> اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر.
الشكل 2. صورة مسيئة للأشعة فوق البنفسجية الإعداد علاج ضوء. تم إصلاح مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية من stereomicroscope الفلورسنت بشكل آمن إلى كوب طبق بتري ~ 2 سم من أعلى مقاعد البدلاء. وقد شغل 250 مل دورق زجاجي، ملفوفة جزئيا في احباط، وسوف 100 مل من الماء النظام. وضعت السمكة داخل الدورق 250 مل. وكان مركز مل دورق 250 داخل دورق L 4، والذي كان مملوء بالماء النظام إلى مستوى الماء في كوب 250 مل. وضعت L دورق 4 المتاخمة للخيوط ضوء تركزت في الدورق 250 مل. وضعت درع مبهمة كبيرة حول الإعداد بأكمله. انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
FO: المحافظة على together.within الصفحات = "دائما"> 
الشكل (3). قضيب فقدان مبصرة في الزرد البيضاء بعد مختلف ضوء الضرر نماذج أقسام الشبكية من الكبار تيراغرام (NRD: EGFP). / الرداء immunolabeled مع GFP لاظهار قضيب مبصرة الكثافة (الأخضر) في ظهري (AD) وبطني (EH) شطر من شبكية العين . A، E) وقبل ظهور ضوء (0 ساعة)، EGFP إيجابية قضيب نوى مبصرة (ONL) وشرائح الخارجي (ROS) يمكن تصور. B، F) في 48 ساعة التالية الهالوجين ضوء ظهور (HLT)، اقتطاع ROS وأقل بكثير نوى قضيب (I) كانت موجودة في ظهري، ولكن ليس بطني شبكية العين. CG) في 48 ساعة بعد 30 دقيقة من التعرض للأشعة فوق البنفسجية (hpUV)، كانت أقل بكثير نوى قضيب موجودة في شبكية العين ظهري وبطني مقابل 0 ساعة (C، G < /> قوية)، ولكن ليس 48 العلاجات HLT (G، I). DH) 48 ساعة بعد ظهور العلاج ضوء مجتمعة (30 دقيقة من التعرض للأشعة فوق البنفسجية تليها العلاج الهالوجين؛ الأشعة فوق البنفسجية +48 HLT)، وكانت تقريبا لا ROS موجودة في شبكية العين الظهرية أو البطنية، بالإضافة إلى خسائر كبيرة في قضيب مبصرة نوى (I) الأول) الكمي لقضيب مبصرة نوى عبر 300 ميكرون من ظهري المركزية أو شبكية العين بطني. وصفت فروق ذات دلالة إحصائية (P ≤ 0.05) بين المجموعات على النحو التالي: "أ" لمختلف من 0 الموارد البشرية، "ب" لمختلف من 48 HLT و "ج" لمختلف من 48 hpUV. شريط النطاق في لوحة A يمثل 50 ميكرون وينطبق على لوحات ه. انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
iles/ftp_upload/51017/51017fig4.jpg "العرض =" 500px "/>
الشكل 4. خسارة مزدوجة مخروط في الزرد البيضاء بعد مختلف ضوء الضرر النماذج. أقسام الشبكية من الزرد البيضاء الكبار immunolabeled مع ZPR-1 لاظهار المخاريط مزدوجة (الذهب) في ظهري (AD) وبطني نصفين (EH) في شبكية العين بعد كل من ضوء وكانت النماذج الضرر (48 HLT، 48 hpUV، والأشعة فوق البنفسجية +48 HLT). A، E) عند 0 ساعة، مزدوج النواة مخروط موجودة في شبكية العين ظهري وبطني. B، F) في 48 HLT، كانت موجودة في أقل بكثير المخاريط مزدوج شبكية العين بطني فقط (F، I). CG) في 48 hpUV، أقل بكثير المخاريط مزدوجة (I) وكمية كبيرة من الحطام كان حاضرا في شبكية العين الظهرية فقط (C)، في حين لم يلاحظ أي تغيرات في شبكية العين بطني (G). DH) في الأشعة فوق البنفسجية +48 HLT، أقل بكثير مخروط مزدوجةكان ق (I) والقليل جدا الحطام موجودة في شبكية العين ظهري وبطني. I) الكمي من المخاريط مزدوج عبر 300 ميكرون من ظهري المركزية أو شبكية العين بطني. وصفت فروق ذات دلالة إحصائية (P ≤ 0.05) بين مجموعات على النحو "، وهو" لمختلف من 0 الموارد البشرية، "ب" لمختلف من 48 HLT و "ج" لمختلف من 48 hpUV. شريط النطاق في لوحة A يمثل 100 ميكرون وينطبق على لوحات ه. انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 5. التغييرات هو استجابة الانتشار بعد مختلف ضوء الضرر النماذج. أقسام الشبكية من الزرد البيضاء الكبار immunolabeled مع PCNA لاظهار تكاثر الخلايا (الحمراء) في الظهرية (AD) وبطني (EH) شطر من شبكية العين بعد كل من النماذج وقوع اضرار طفيفة (48 HLT، 48 hpUV، والأشعة فوق البنفسجية +48 HLT). AE) في 0 الموارد البشرية، وكان انتشار غائبة عن الطبقة النووية الداخلية ( INL). B، F) في 48 HLT، كانت الخلايا الاصلية واحدة موجودة في INL عبر شبكية العين الظهرية وجزء صغير من شبكية العين بطني. CG) في 48 hpUV، وكانت أعمدة من الخلايا الاصلية موجودة في شبكية العين الظهرية، في حين كانت فقط الخلايا الاصلية واحدة موجودة في جزء صغير من شبكية العين بطني. D، H) في الأشعة فوق البنفسجية +48 HLT، كانت أعمدة كبيرة من الخلايا الاصلية موجودة في جميع أنحاء شبكية العين ظهري وبطني. شريط النطاق في لوحة A يمثل 100 ميكرون وينطبق على لوحات ه. انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
FO: المحافظة على together.within الصفحات = "دائما"> 
الشكل (6). قضيب ومخروط فقدان مبصرة في الزرد المصطبغة بعد مختلف ضوء الضرر نماذج أقسام الشبكية من الكبار البرية من نوع (AB) الزرد ملطخة TO-PRO-3 لإظهار كافة نوى (AP؛ الازرق). وimmunolabeled مع ZPR-3 لاظهار قضيب شرائح الخارجي (ه؛ أرجواني) أو ZPR-1 إلى المخاريط مزدوجة (IP؛ الذهب) في ظهري (AD، IJ) وبطني (EH، MP) شطر من شبكية العين بعد كل من النماذج وقوع اضرار طفيفة (48 HLT، 48 hpUV، والأشعة فوق البنفسجية +48 HLT). ه) انخفاض كبير في قضيب مبصرة النوى كانت موجودة في شبكية العين الظهرية في 48 HLT (B، Q) في شبكية العين وظهري وبطني في الأشعة فوق البنفسجية +48 HLT (D، H، Q) . IP) على الرغم من نوى مخروط ومتضخما أنا ن شبكية العين الظهرية في 48 hpUV (K)، أي انخفاض كبير في نوى مزدوجة مخروط كانوا حاضرين في 48 أو 48 HLT hpUV (JK، NO، R). كان انخفاض كبير في نوى مخروط موجودة في شبكية العين ظهري وبطني في الأشعة فوق البنفسجية +48 HLT (L، P، R). QR) الكمي لقضيب مبصرة ومزدوجة النواة مخروط عبر 300 ميكرون من ظهري المركزية أو شبكية العين بطني. وصفت فروق ذات دلالة إحصائية (P ≤ 0.05) بين مجموعات على النحو "، وهو" لمختلف من 0 الموارد البشرية، "ب" لمختلف من 48 HLT و "ج" لمختلف من 48 hpUV. شريط النطاق في لوحة A يمثل 200 ميكرون وينطبق على لوحات ه. انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
g7.jpg "العرض =" 500px "/>
الرقم 7. استجابة الانتشار في الزرد المصطبغة بعد مختلف ضوء الضرر النماذج. أقسام الشبكية من الكبار البرية من نوع (AB) الزرد immunolabeled مع PCNA لاظهار تكاثر الخلايا (الحمراء) في ظهري (AD) وبطني (EH) شطر من شبكية العين بعد كل من في ضوء النماذج الضرر (48 HLT، 48 hpUV، والأشعة فوق البنفسجية +48 HLT). م) في شبكية العين الظهرية، كانت قليلة فقط الخلايا الاصلية واحدة موجودة في INL في 48 و 48 HLT hpUV (B، C)، بينما الأعمدة من الخلايا الاصلية كانت موجودة في الأشعة فوق البنفسجية +48 HLT (D). EH) في شبكية العين بطني، لم يلاحظ أي تغييرات في الانتشار إلا في الأشعة فوق البنفسجية +48 HLT (H)، التي كانت في وقت من الأعمدة الخلايا الاصلية موجودة. شريط النطاق في لوحة A يمثل 100 ميكرون وينطبق على لوحات ه.7/51017fig7highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا تبين لنا أن الجمع بين التعرض للأشعة فوق البنفسجية قصيرة مع استمرار التعرض للضوء الساطع النتائج في فقدان مبصرة على نطاق واسع واستجابة التجدد قوية. مقارنة مع الأساليب LIRD الفردية، وهذه الطريقة مجتمعة هو أيضا على البروتوكول الأكثر فعالية لإتلاف كلا قضبان ومخاريط في كل شطر من شبكية العين. الأهم من ذلك، من فعالية هذا العلاج في الحيوانات المصطبغة وكذلك الحيوانات البيضاء.
على الرغم من أننا تقديم الدليل على ان نتائج بروتوكول موحد في المزيد من الضرر على نطاق واسع وثابت مقارنة مع الأساليب LIRD الفردية، وينبغي مناقشة الاعتبارات العلمية قبل اختيار نموذج LIRD. وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن طريقة مجتمعة ينبغي أن تستخدم عندما يتم جمع أنسجة الشبكية كامل للتحليل (أي البروتينات، في الوقت الحقيقي PCR). وجدنا أن الأسلوب مجتمعة كان لها أكبر حجم الآفة، يليه التعرض الهالوجين، وأخيرا التعرض للأشعة فوق البنفسجية. نقترحأن طريقة مجتمعة أن تستخدم أيضا عند التحقيق في الجين أو المسار الذي يمكن أن يؤثر بشكل مختلف قضيب وتجديد مخروط. إذا لم يكن ذلك ممكنا لأسباب عملية، البيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أن التعرض للأشعة فوق البنفسجية هو أفضل الطريقة التالية لهذه الدراسات، إذا تم تحليل تقتصر على شبكية العين الظهرية الوسطى.
هناك ما يبرر الاعتبارات العملية أيضا عند اختيار طريقة LIRD المناسبة. الشاغل الأول هو تكلفة المعدات اللازمة. جميع البروتوكولات تتطلب فترة طويلة من التكيف مع الظلام (لا تظهر البيانات). من العلبة المظلمة مكتفية ذاتيا المضمن في وحدة سكنية الزرد ومريحة للغاية، ولكن ليس من الضروري. حتى صندوق من الورق المقوى يمكن أن تستخدم، إذا تم الحرص على الشريط أو ختم طبقات، ويتم رصد المعلمات المياه. طريقة LIRD القائم على الهالوجين غير اقتصادية للغاية ومريحة. ويمكن شراء جميع البنود لأقل من 100 دولار في متجر لاجهزة الكمبيوتر المحلي وإعداد يستغرق سوى بضع دقائق. Tانه عيب العملي الوحيد من هذا الأسلوب هو إزعاج للعمل في نفس الغرفة مع وعلاج ضوء. الأضواء توليد كمية لا بأس بها من الحرارة عند تشغيل مستمر لمدة 4 أيام وشدة الضوء على حد سواء تشتيت ويحتمل أن تكون ضارة إلى رؤية الإنسان. تتطلب أساليب الأشعة فوق البنفسجية والأشعة فوق البنفسجية مصدر مجتمعة، وهي ليست متاحة لكل مختبر. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تؤخذ بعناية كبيرة لضمان سلامة أفراد المختبر عند تنفيذ العلاج ضوء الأشعة فوق البنفسجية. وهكذا، في حين أنها أكثر ملاءمة لجعل الجهاز ضوء الهالوجين في مساحة منعزلة، ومخاوف تتعلق بالسلامة من العلاج بالأشعة فوق البنفسجية يتطلب مثل هذا الفضاء. هذا يصبح مصدر إزعاج إضافي إذا أيضا يستخدم عادة مصدر للأشعة فوق البنفسجية يستخدم لعلاج ضوء لالمجهر الفلورسنت يضم في "غرفة المجهر" أو التصوير الأساسية. سيكون أداء جولات متعددة من العلاجات للأشعة فوق البنفسجية من أجل السيطرة والمجموعات التجريبية من الحيوانات تستلزم اغلاق غرفة المجهر لتحويلةطول ensive من الزمن.
ولعل أكبر ميزة لاستخدام أسلوب مجتمعة هو القدرة على إجراء دراسات على الحيوانات تجديد الشبكية الصباغي. وتبين لنا أن لا نتائج أسلوب الفردية في خسارة كبيرة من قضبان ومخاريط في الشبكية ظهري وبطني. في المقابل، فإن الجمع بين نتائج النموذج LIRD في مستويات مماثلة من قضيب على نطاق واسع وفقدان مخروط في كل من الحيوانات المصطبغة والبيضاء. القدرة على تطبيق هذا الأسلوب LIRD للحيوانات المصطبغة يوفر مساحة كبيرة الباحث، والوقت، والبدل اليومي تكاليف الرعاية الحيوانية (إن وجدت)، كما أنه يزيل الحاجة إلى إيجاد والحفاظ على خطوط المعدلة وراثيا من الفائدة على خلفية البيضاء للدراسات التجديد الشبكية . معا، ونحن نشعر أن المزايا العلمية والعملية تعويضهم عن المتاعب المحتملة لهذا الأسلوب تحسين LIRD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر شيشيا لوه لتربية الأسماك الممتازة والدعم التقني. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R21EY019401 (RT) وP30EY04068 (RT)، وبدء الأموال لRT، بما في ذلك منحة غير مقيد من البحوث للوقاية من العمى في جامعة واين ستيت، قسم طب وجراحة العيون. كان مدعوما من قبل JT توماس C. الدمدمة الزمالة التي تقدمها مدرسة جامعة واين ستيت العليا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UV light source | Leica | EL600 | |
| Glass Petri dish (150 x 20 mm) | Sigma-Aldrich/Pyrex | CLS3160152BO | |
| 250 ml glass beaker | Sigma-Aldrich/Pyrex | CLS1000250 | |
| 4 L glass beaker | Sigma-Aldrich/Pyrex | CLS10004L | |
| Aluminum foil | Fisher | 01-213-105 | |
| 250 W halogen lamps | Workforce | 265-669 | |
| 1.8 L clear acrylic tanks | Aquaneering | ZT180T | |
| 1.8 L clear acrylic tank lids | Aquaneering | ZT180LCL | |
| Fan | Honeywell | HT-900 | |
| Aerator | Tetra | 77853-900 | |
| Thermometer | Cole-Parmer | YO-08008-58 | |
| Bent forceps (5/45) | World Precision Instruments | 504155 |
References
- Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J. Neurosci. 27, 7028-7040 (2007).
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J. Neurosci. 26, 6303-6313 (2006).
- Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. Regeneration of inner retinal neurons after intravitreal injection of ouabain in zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).
- Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
- Thummel, R., et al. Pax6a and Pax6b are required at different points in neuronal progenitor cell proliferation during zebrafish photoreceptor regeneration. Exp. Eye Res. 90, 572-582 (2010).
- Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J. Neurobiol. 44, 289-307 (2000).
- Vihtelic, T. S., Soverly, J. E., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Retinal regional differences in photoreceptor cell death and regeneration in light-lesioned albino zebrafish. Exp. Eye Res. 82, 558-575 (2006).
- Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Muller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
- Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev. Neurobiol. 67, 1009-1031 (2007).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Dev. Biol. 6, 36 (2006).
- Thummel, R., et al. Characterization of Muller glia and neuronal progenitors during adult zebrafish retinal regeneration. Exp. Eye Res. 87, 433-444 (2008).
- Thummel, R., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Enright, J. M., Hyde, D. R. Inhibition of Muller glial cell division blocks regeneration of the light-damaged zebrafish retina. Dev. Neurobiol. 68, 392-408 (2008).
- Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. J. Comp. Neurol. 518, 800-814 (2010).
- Morris, A. C., Scholz, T. L., Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. Genetic dissection reveals two separate pathways for rod and cone regeneration in the teleost retina. Dev. Neurobiol. 68, 605-619 (2008).
- Bignami, A., Dahl, D. The radial glia of Muller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp. Eye Res. 28, 63-69 (1979).
- Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog. Retin. Eye Res. 25, 397-424 (2006).
- Bringmann, A., Wiedemann, P. Muller glial cells in retinal disease. Ophthalmologica. 227, 1-19 (2012).
- Eisenfeld, A. J., Bunt-Milam, A. H., Sarthy, P. V. Muller cell expression of glial fibrillary acidic protein after genetic and experimental photoreceptor degeneration in the rat retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 25, 1321-1328 (1984).
- Anderson, D. H., Guerin, C. J., Erickson, P. A., Stern, W. H., Fisher, S. K. Morphological recovery in the reattached retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 168-183 (1986).
- Bruce, A. E., Oates, A. C., Prince, V. E., Ho, R. K. Additional hox clusters in the zebrafish: divergent expression patterns belie equivalent activities of duplicate hoxB5 genes. Evol. Dev. 3, 127-144 (2001).
- Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Res. Bull. 49, 377-391 (1999).
- Lewis, G. P., Fisher, S. K. Muller cell outgrowth after retinal detachment: association with cone photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 1542-1545 (2000).
- Fischer, A. J., Bongini, R. Turning Muller glia into neural progenitors in the retina. Mol. Neurobiol. 42, 199-209 (2010).
- Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends Mol. Med. 16, 193-202 (2010).
- Close, J. L., Liu, J., Gumuscu, B., Reh, T. A. Epidermal growth factor receptor expression regulates proliferation in the postnatal rat retina. Glia. 54, 94-104 (2006).
- Das, A. V., et al. Neural stem cell properties of Muller glia in the mammalian retina: regulation by Notch and Wnt signaling. Dev. Biol. 299, 283-302 (2006).
- Ikeda, T., Puro, D. G. Regulation of retinal glial cell proliferation by antiproliferative molecules. Exp. Eye Res. 60, 435-443 (1995).
- Liu, B., et al. Wnt signaling promotes muller cell proliferation and survival after injury. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54, 444-453 (2013).
- Osakada, F., et al. Wnt signaling promotes regeneration in the retina of adult mammals. J. Neurosci. 27, 4210-4219 (2007).
- Wan, J., et al. Preferential regeneration of photoreceptor from Muller glia after retinal degeneration in adult rat. Vision Res. 48, 223-234 (2008).
- Wan, J., Zheng, H., Xiao, H. L., She, Z. J., Zhou, G. M. Sonic hedgehog promotes stem-cell potential of Muller glia in the mammalian retina. Biochem. Biophys. Res. Commun. 363, 347-354 (2007).
- Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Muller glial cells. J. Comp. Neurol. 509, 225-238 (1002).
- Chang, G. Q., Hao, Y., Wong, F. Apoptosis: final common pathway of photoreceptor death in rd, rds, and rhodopsin mutant mice. Neuron. 11, 595-605 (1993).
- Marc, R. E., et al. Extreme retinal remodeling triggered by light damage: implications for age related macular degeneration. Mol. Vis. 14, 782-806 (2008).
- Portera-Cailliau, C., Sung, C. H., Nathans, J., Adler, R. Apoptotic photoreceptor cell death in mouse models of retinitis pigmentosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 974-978 (1994).
- Noell, W. K., Walker, V. S., Kang, B. S., Berman, S. Retinal damage by light in rats. Invest. Ophthalmol. 5, 450-473 (1966).
- Wenzel, A., Grimm, C., Samardzija, M., Reme, C. E. Molecular mechanisms of light-induced photoreceptor apoptosis and neuroprotection for retinal degeneration. Prog. Retin. Eye Res. 24, 275-306 (2005).
- Cicerone, C. M. Cones survive rods in the light-damaged eye of the albino rat. Science. 194, 1183-1185 (1976).
- La Vail, M. M. Survival of some photoreceptor cells in albino rats following long-term exposure to continuous light. Invest. Ophthalmol. 15, 64-70 (1976).
- Thomas, J. L., Nelson, C. M., Luo, X., Hyde, D. R., Thummel, R. Characterization of multiple light damage paradigms reveals regional differences in photoreceptor loss. Exp. Eye Res. 97, 105-116 (2012).
- Qin, Z., et al. FGF signaling regulates rod photoreceptor cell maintenance and regeneration in zebrafish. Exp. Eye Res. 93, 726-734 (2011).
- Craig, S. E., et al. The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 3244-3252 (2010).
- Morris, A. C., Schroeter, E. H., Bilotta, J., Wong, R. O., Fadool, J. M. Cone survival despite rod degeneration in XOPS-mCFP transgenic zebrafish. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 4762-4771 (2005).
- Nelson, C. M., Hyde, D. R. Muller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina. Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).
- Powell, C., Elsaeidi, F., Goldman, D. Injury-dependent Muller glia and ganglion cell reprogramming during tissue regeneration requires Apobec2a and Apobec2b. J. Neurosci. 32, 1096-1109 (2012).
- Ramachandran, R., Reifler, A., Wan, J., Goldman, D. Application of Cre-loxP recombination for lineage tracing of adult zebrafish retinal stem cells. Methods Mol. Biol. 884, 129-140 (2012).
- Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/Dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15858-15863 (2011).
- Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Insm1a-mediated gene repression is essential for the formation and differentiation of Muller glia-derived progenitors in the injured retina. Nat. Cell Biol. 14, 1013-1023 (2012).
- Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev. Cell. 22, 334-347 (2012).
- Morris, A. C., Forbes-Osborne, M. A., Pillai, L. S., Fadool, J. M. Microarray analysis of XOPS-mCFP zebrafish retina identifies genes associated with rod photoreceptor degeneration and regeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 2255-2266 (2011).
- Thummel, R., Bailey, T. J., Hyde, D. R. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J. Vis. Exp. (58), e3603 (2011).
