Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

A Novel ljusskada Paradigm för användning i Retinal Regeneration Studier i vuxna zebrafisk

doi: 10.3791/51017 Published: October 24, 2013

Summary

Flera ljusskada protokoll har beskrivits till skada fotoreceptorer och därmed framkalla en retinal regeneration svar i vuxen zebrafisk. Detta protokoll beskriver en förbättrad metod som kan användas i pigmenterade djur och som skadar den stora majoriteten av stav och fotoreceptorer kon över hela näthinnan.

Abstract

Ljusinducerad retinal degeneration (LIRD) används ofta i både gnagare och zebrafisk till skada spö och fotoreceptorer konen. I vuxen zebrafisk, utlöser ljusmätare degeneration Müller gliaceller att återinträda i cellcykeln och producera transient-förstärkande stamfäder. Dessa stamceller fortsätter att föröka sig när de flyttar till det skadade området, där de i slutändan ger upphov till nya fotoreceptorer. För närvarande finns det två utbredda LIRD paradigm, som var och en leder till olika grader av ljusmätare förlust och motsvarande skillnader i förnyelse svar. Som flera genetiska och farmakologiska verktyg är tillgängliga för att testa rollen av individuella gener av intresse under regenerering, finns det ett behov att utveckla en robust LIRD paradigm. Här beskriver vi en LIRD protokoll som resulterar i omfattande och konsekvent förlust av både tappar och stavar fotoreceptorer där vi har kombinerat användningen av två tidigare etablerade LIRD tekniker. Vidare, Kan detta protokoll förlängas för användning i pigmenterade djur, vilket eliminerar behovet av att upprätthålla transgena linjer av intresse på albino bakgrund för LIRD studier.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ljusinducerad retinal degeneration (LIRD) används ofta i både gnagare och zebrafisk till skada spö och fotoreceptorer konen. I vuxen zebrafisk, utlöser ljusmätare degeneration Müller gliaceller att återinträda i cellcykeln och producera transient-förstärkande stamfäder. Dessa stamceller fortsätter att föröka sig när de flyttar till det skadade området, där de i slutändan ger upphov till nya fotoreceptorer. För närvarande finns det två utbredda LIRD paradigm, som var och en leder till olika grader av ljusmätare förlust och motsvarande skillnader i förnyelse svar. Som flera genetiska och farmakologiska verktyg är tillgängliga för att testa rollen av individuella gener av intresse under regenerering, finns det ett behov att utveckla en robust LIRD paradigm. Här beskriver vi en LIRD protokoll som resulterar i omfattande och konsekvent förlust av både tappar och stavar fotoreceptorer där vi har kombinerat användningen av två tidigare etablerade LIRD tekniker. Vidare, Kan detta protokoll förlängas för användning i pigmenterade djur, vilket eliminerar behovet av att upprätthålla transgena linjer av intresse på albino bakgrund för LIRD studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla procedurer som beskrivs i detta protokoll godkändes av djuret användning kommittén vid Wayne State University School of Medicine.

Ett. Mörkeranpassning

  1. Transfer ~ 10 vuxna albino eller pigmenterad fisk från den ordinarie bostadsmarknaden systemet i en mörk låda. Om tillgängligt, använd en mörk låda som är inbyggd i zebrafisk husmodulen, vilket möjliggör normal vattenflödet genom tanken. (Om ett sådant system inte är tillgängligt, placera akvariet i ett helt mörkt hölje, och se till att lufta fisken med syre).
  2. Hålla fisken i mörker under 10 dagar. Vid utfodring av djuren eller tillfoga nya fiskar till den mörka rutan, se till att så snabbt som möjligt för att undvika att utsätta fisken till en lång period av ljus.

2. UV ljus exponering

  1. Se till att strömmen till UV-källan är OFF. Ta bort UV-ljus tråd från fluorescerande stereomikroskop.
    1. Använd en inverterad15 cm diameter glaspetriskål (eller något i en liknande 2 cm höjd) som ett stativ för UV glödtråden. Tape petriskålen till labbet bänken.
    2. Tejpa UV-ljuset glödtråden till toppen av den inverterade petriskål. Ordna så att ~ 2 mm från slutet av filamentet överhäng petriskålen.
  2. Skaffa en 250 ml glasbägare. Täck ½ av botten, sidorna och baksidan av bägaren med aluminiumfolie, och se till att "blanka" sidan av folien vänd mot insidan av bägaren. Om bägaren är graderad, täcka formulerad hälften av bägaren med folie, lämnar klara hälften av den exponerade bägaren.
  3. Fyll 250 ml bägare med 100 ml vatten från fisken anläggningen systemet.
  4. Placera 250 ml bägare i en 4 liter bägare. Fyll 4 liter bägare med vatten tills vattennivån är även med 100 ml vatten linje i 250 ml bägare.
  5. Lägg maximalt 10 dark-behandlade djur till 250 ml bägare. Täck över 250 ml bägare med en liten bit av aluminiumfolie.
  6. Placera hela bägaren anordningen omedelbart intill den UV-filamentet. Glödtråden ska röra vid utsidan av 4 liter bägare och vänd mot den exponerade delen av den 250 ml bägare. Kontrollera att 250 ml bägare är centrerad i botten av 4 liter bägare.
  7. Placera en stor, ogenomskinlig skärm bakom 4L bägaren, som tillåter de djur som ska exponeras, men förhindrar eventuella lab personal från att se spetsen av UV glödtråden. VARNING: Kontrollera att denna barriär är på plats innan du slår på strömmen till UV-källan.
  8. Slå på UV-strömkälla. Ställ timern i 30 min. Placera oavsett nödvändiga varningsetiketter för att se till att intet ont anande lab personal inte oavsiktligt utsätta sig för UV-strålning.
  9. Efter 30 min, stäng av UV-strömkälla. Avlägsna 250 ml bägare med fisken. OBS: Om flera omgångar av UV exponering krävs, låt strömkällan svalna (~ 20 min) innan du upprepar exponering protokollet. Se till att byta ut than 100 ml vatten med färsk systemet vatten för varje exponering. Vattnet i 4 liter bägare behöver inte bytas ut.

Tre. Halogenlampa ljusexponering

  1. Överför fisken från 250 ml bägare i en 1,8 L klar akryl akvarium. Fyll tanken till overflow märket.
  2. Ställ in halogenlampan området ljusbehandling. Skaffa fyra 250 W halogenlampor utility från en lokal järnaffär. Facing två lampor i samma riktning, ordna 29 cm isär på mitten. Arrange de andra två lampor på ett liknande sätt.
    1. Placera den andra uppsättningen lampor så att de står inför den första uppsättningen av lampor, lämnar ~ 73 cm mellan de två uppsättningarna av lampor. Detta skapar en rektangel-formad yta ljusbehandling av 29 x 73 cm.
  3. Skaffa en liten fläkt från en lokal järnaffär. Placera fläkten på samma avstånd mellan de två uppsättningarna av lampor, strax utanför ljuset behandlingsområdet.
  4. Placera två 1.8 L tankar fulla av vatten i mitten avljusbehandlingen område, på lika avstånd mellan de två uppsättningarna av lampor. Avståndet mellan lamporna och den yttre väggen på tanken bör vara ~ 29 cm. Obs: även om bara behandla 10 fiskar i en 1,8 L tank, använd detta arrangemang. Båda tankarna behövs för att hålla vattentemperaturen på varje tank inom det lämpliga området.
  5. Placera en syre luftare i varje tank.
  6. Täck varje tank med klar akryl lock, vilket ger en ~ 2 cm gap vid änden närmast fläkten. Arrange fläkten så att det kommer att blåsa luft in i detta gap. Placera en termometer i en eller båda av tankarna.
  7. Slå på strömmen till lamporna, fläkt, och luftare. Behåll ljusbehandling för upp till 4 dagar. Fisken ska inte utfodras under ljusbehandlingen, eftersom detta kommer att påverka vattenkvaliteten och leda till mer stress för djuren.
  8. Övervaka temperatur och vattennivå på en daglig basis. Hålla temperaturen vid 30-33 ° C. Om nödvändigt, justera fläkthastigheten och / eller avståndet mellan tankarna och lights.
    1. Toppa varje tank med systemet vatten som behövs, vanligtvis dagligen.
    2. Använd alltid sunt vuxen zebrafisk (vanligtvis 6-9 månader) för att upprätthålla en överlevnad på nära 100%. Men om en fisk hittas död i tanken, ta bort den omedelbart och ersätta vattnet i hela tanken.

4. Tissue Collection

  1. 48 h efter starten av halogen ljusbehandlingen avlägsna fisk från behandlingsområdet.
    1. Bered en färsk etanolisk formaldehyd fixativ (1 del 37% formaldehyd, 9 delar 100% etanol).
    2. Euthanize zebrafisk med en anestetisk överdos av 2-fenoxietanol (0,4 mg / L).
    3. Överför euthanized zebrafisk till en pappershandduk. Enucleate ögat med böjda pincett.
    4. Placera enukleerade ögon i fixativ och lagra O / N vid 4 ° C.
  2. Cryoprotect ögonen.
    1. Tvätta ögonen i 5% sackaros 1x PBS under 30 min vid rumstemperatur, sedan ersätta medfärsk 5% sukros 1x PBS under 2 timmar. Nästa, tvätta ögonen i 30% sackaros 1x PBS O / N vid 4 ° C. Tvätta ögonen i en 01:01 (lika delar) mjukpapper frysmedium och 30% sackaros 1x PBS O / N vid 4 ° C.
  3. Bädda in ögonen i 100% vävnad frysmedium och förvara vid -80 ° C. Orient ögonen så att cryosectioning av vävnaden utförs på den dorsala / ventrala axeln.
  4. Kryosektion vävnaden och plats på glasskivor. Varma objektglas under 2 timmar vid 55 ° C. Lagra bilderna vid -80 ° C eller omedelbart utföra standard immunohistokemi.
  5. Utför standard immunohistokemi på sektioneras vävnad och bild med fluorescerande mikroskopi 40,51.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den hittills beskrivna ljusbehandling protokoll jämfördes med varje enskild metod för LIRD. I mörker-behandlade vuxna albinodjur (fig 3-5), gav de enskilda ljusbehandlingar i betydande förlust av staven (Figur 3) och könen (Figur 4) fotoreceptorer. Men både individuella behandlingar skadade hand fotoreceptorer i den dorsala delen av näthinnan, lämnar den ventrala näthinnan relativt skyddat från ljus behandlingar (figur 3 och 4). Dessutom, jämfört med halogenljus behandling, skadat UV-ljus behandling mer kon fotoreceptorer i den dorsala delen av näthinnan (jämför figur 4B med C, respektive). Kombinera UV och halogen ljus behandlingar resulterade i betydligt större förlust för både spö och fotoreceptorer konen hela näthinnan, i stort sett eliminerar neuroprotection av den ventrala delen av näthinnan (fig 3 och 4). Jämfört med de enskilda LIRD förfarandena användes en motsvarande ökning av proliferation observerades också i ventrala näthinnan när den sammanlagda ljusbehandlingen protokoll användes (Figur 5).

Pigmenterade djur är mer resistenta mot LIRD grund av retinal pigmenterat epitel, som absorberar ljus och skyddar fotoreceptorer från fototoxicitet. Som förväntat, mörk-anpassade pigmenterade djur var nästan helt resistenta mot halogenen ljusbehandlingen ensam (figur 6B, J och N). Vi fann att 48 timmar efter ljus debut, var stångfotoreceptorer reduceras i rygg näthinnan, men inte ventrala näthinnan (Figurerna 6E, F och Q). Cone ljusmätare kärnor var närvarande i vanliga siffror (Figur 6R). Jämfört med obehandlade näthinnor, halogenljusbehandling ensamt inte heller öka Müller gliaceller cellproliferation 48 timmar efter ljus debut (figurerna 7B och F). I albinodjur resulterade UV-ljus behandling ensam i något större skada på både tappar och stavar fotoreceptorer i rygg näthinnan (figur 3i och 4I). Men i pigmenterade djur, gjorde UV-ljus-behandling enbart inte avsevärt minska stav eller könen cellantal (figurerna 6C, G, K, O, Q och R). Dessutom framkallade UV behandling ensam bara en svag regenerativ svar i den dorsala delen av näthinnan i pigmenterade djur (figur 7C). I motsats till de enskilda LIRD resultat, som kombinerar UV-och halogen behandlingar ljus i signifikant större fotoreceptor skador och regenerativa responsen hos pigmenterade djur. Viktigt var betydande förlust av både stavar och koner observerats i både Dorsa l-och ventral näthinnor (fig 6D, H, L, P, Q och R). Jämfört med obehandlade och individuell LIRD förfarandena användes en motsvarande ökning av proliferation observerades också i både dorsala och ventrala halvor näthinnan när den sammanlagda ljusbehandlingen protokoll användes (Figur 5).

Figur 1
Figur 1. Fotografera visar halogen inställning ljusbehandling. Två uppsättningar av fyra 250 W halogenlampor var placerade 29 cm på vardera sidan av två tydliga 1.8 stridsvagnar L akryl. Luftaren och slang placerades så att det inte hindrar ljuset. Locken i tankarna var knäckt 2 cm så att luftflödet från fläkten. En termometer placerades i en av tankarna för den temperatur som skall övervakas.Arget = "_blank"> Klicka här för att se större bild.

Figur 2
Figur 2. Fotografera som visar UV-inställning ljusbehandling. Den UV-ljuskälla från en fluorescerande stereomikroskop säkert fastställdes till ett glas petriskål ~ 2 cm från bänken toppen. En 250 ml glasbägare, delvis insvept i folie, fylldes kommer 100 ml systemets vatten. Fisken placerades inne i 250 ml bägare. Den 250 ml bägare var centrerad inuti en 4 liter bägare, som var fylld med systemet vatten till nivån för vattnet i 250 ml bägare. Den 4 liter bägare placerades intill ljuset glödtråd centrerad vid 250 ml bägare. En stor ogenomskinlig skärm placerades runt hela installationen. Klicka här för att se större bild .


Figur 3. Rod fotoreceptor förlust i albino zebrafisk efter olika paradigm ljusskada Retinal sektioner från vuxen Tg (nrd: EGFP). / Alb immunolabeled med GFP för att visa staven ljusmätare densitet (grön) i den dorsala (AD) och ventrala (EH) halvor av näthinnan . A, E) Före lätta debut (0 h), EGFP-positiv stav ljusmätare kärnor (ENDA) och yttre segment (ROS) kan visualiseras. B, F) Vid 48 timmar efter halogenljus debut (HLT), stympad ROS och betydligt färre stav kärnor (I) var närvarande i den dorsala men inte ventrala näthinnan. CG) Vid 48 h efter 30 min av UV-exponering (hpUV), var signifikant färre stav kärnor närvarande i de dorsala och ventrala näthinnor jämfört med 0 tim (C, G < / Strong>), men inte 48 HLT behandlingar (G, I). DH) 48 tim efter starten av kombinerad ljusbehandling (30 min UV exponering följt av halogen behandling, UV 48 HLT), nästan ingen ROS var närvarande i dorsala eller ventrala näthinnor, förutom en betydande förlust av stång fotoreceptor kärnor (I) . I) Kvantifiering av spö ljusmätare kärnor över 300 nm i centrala rygg eller ventrala näthinnan. Signifikanta skillnader (p ≤ 0,05) mellan grupperna visas som: "a" för annorlunda från 0 hr, "b" för olika från 48 HLT och "c" för olika från 48 hpUV. Skala bar i panel A representerar 50 pm och gäller paneler AH. Klicka här för att se större bild .

iles/ftp_upload/51017/51017fig4.jpg "width =" 500px "/>
Figur 4. Dubbelkonig förlust i albino zebrafisk efter olika paradigm lätta skador. Av vuxen albino zebrafisk näthinnan sektioner immunolabeled med ZPR-1 för att visa dubbla koner (guld) i den dorsala (AD) och ventrala (EH) halvor av näthinnan efter varje av ljuset skador paradigm (48 HLT, 48 hpUV och UV +48 HLT). A, E) vid 0 tim, dubbel kon kärnor var närvarande i rygg-och ventrala näthinnor. B, F) Vid 48 HLT, var signifikant färre dubbelkonerna närvarande i den ventrala näthinnan bara (F, I). CG) Vid 48 hpUV, signifikant färre dubbelkonerna (I) och en stor mängd smuts var närvarande i den dorsala näthinnan endast (C), medan inga förändringar observerades i ventrala näthinnan (G). DH) Vid UV +48 HLT, betydligt färre dubbelkonigs (I) och mycket lite skräp var närvarande i dorsala och ventrala näthinnor. I) Kvantifiering av dubbla koner över 300 nm i centrala rygg eller ventrala näthinnan. Signifikanta skillnader (p ≤ 0,05) mellan grupperna visas som, "a" för annorlunda från 0 hr, "b" för olika från 48 HLT och "c" för olika från 48 hpUV. Skala bar i panel A representerar 100 ìm och gäller för paneler AH. Klicka här för att se större bild .

Figur 5
Figur 5. Förändringar är spridning svar efter olika paradigm lätta skador. Retinal sektioner från vuxen albino zebrafisk immunolabeled med PCNA att visa cellproliferation (röd) iden dorsala (AD) och ventrala (EH) halvor av näthinnan efter varje av de lätta skador paradigm (48 HLT, 48 hpUV, och UV 48 hlt). AE) Vid 0 h, var proliferation frånvarande från det inre nukleära skiktet ( INL). B, F) Vid 48 HLT, var ensamstående progenitorceller närvarande i INL över den dorsala näthinnan och i en liten del av den ventrala näthinnan. CG) Vid 48 hpUV, var kolumner av progenitorceller närvarande i dorsala näthinnan, medan endast enstaka progenitorceller var närvarande i en liten del av den ventrala näthinnan. D, H) Vid UV 48 HLT, var stora kolonner av progenitorceller förekommer utmed den dorsala och ventrala näthinnan. Skala bar i panel A representerar 100 ìm och gäller för paneler AH. Klicka här för att se större bild .


Figur 6. Tappar och stavar ljusmätare förlust i pigmenterad zebrafisk efter olika paradigm ljusskada Retinal sektioner från vuxna vildtyp (AB) zebrafisk färgas med TO-PRO-3 för att visa alla kärnor (AP, blå). Samt immunolabeled med ZPR-3 för att visa staven yttre segment (AH, magenta) eller ZPR-1 till dubbla koner (IP, guld) i rygg (AD, IJ) och ventrala (EH, MP) halvor av näthinnan efter varje av de lätta skador paradigm (48 HLT, 48 hpUV och UV +48 HLT). AH) Betydande minskningar i staven ljusmätare kärnor var närvarande i rygg näthinnan vid 48 HLT (B, Q) och i den dorsala och den ventrala näthinnan på UV +48 HLT (D, H, Q) . IP) Även om kon kärnor hypertrophied i n den dorsala näthinnan vid 48 hpUV (K), inga signifikanta minskningar i dubbel kon kärnor var närvarande vid 48 HLT eller 48 hpUV (JK, NO, R). Signifikanta minskningar i kon kärnor var närvarande i den dorsala och den ventrala näthinnan på UV +48 HLT (L, P, R). QR) Kvantifiering av spö ljusmätare och dubbelkonig kärnor över 300 nm i centrala rygg eller ventrala näthinnan. Signifikanta skillnader (p ≤ 0,05) mellan grupperna visas som, "a" för annorlunda från 0 hr, "b" för olika från 48 HLT och "c" för olika från 48 hpUV. Skala bar i panel A representerar 200 ìm och gäller för paneler AH. Klicka här för att se större bild .

g7.jpg "width =" 500px "/>
Figur 7. Proliferation svar i pigmenterad zebrafisk vid olika paradigm lätta skador. Retinal sektioner från vuxen vildtyp (AB) zebrafisk immunolabeled med PCNA att visa cellproliferation (röd) i den dorsala (AD) och ventrala (EH) halvor av näthinnan efter var och en av de lätta skador paradigm (48 HLT, 48 hpUV och UV +48 HLT). e.Kr) i rygg näthinnan, var bara några enstaka stamceller som finns i INL vid 48 HLT och 48 hpUV (B, C), medan kolumner av stamceller var närvarande vid UV +48 HLT (D). EH) i ventrala näthinnan, sågs inga förändringar av proliferation observerades förutom vid UV +48 HLT (H), vid vilken tidpunkt kolumner av stamceller var närvarande. Skala bar i panel A representerar 100 ìm och gäller för paneler AH.7/51017fig7highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se större bild.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Här visar vi att kombinera en kort UV-exponering med en kontinuerlig ljusa resultat ljusexponering i utbredd ljusmätare förlust och en robust förnyelse svar. Jämfört med de enskilda LIRD metoder, detta är kombinerad metod också det mest effektiva protokollet för att skada både stavar och koner i båda halvorna av näthinnan. Huvudsakligen är denna behandling effektivt pigmenterade djur samt albino djur.

Även om vi bevisa att de kombinerade protokoll resulterar i mer omfattande och konsekvent skada jämfört med de enskilda LIRD metoder, bör vetenskapliga överväganden diskuteras innan du väljer en LIRD paradigm. Våra data tyder på att den kombinerade metoden bör användas när hela näthinnevävnad tas för analys (dvs. proteomik, realtids-PCR). Vi fann att den kombinerade metoden hade den största lesionsstorleken, följt av halogen exponering, och slutligen den UV-exponering. Vi föreslåratt den kombinerade metoden också användas vid utredning av en gen eller bana, som differentiellt skulle kunna påverka tappar och stavar regenerering. Om detta inte är möjligt av praktiska skäl, våra data tyder på att UV-exponering är den näst bästa metoden för dessa studier, om analysen begränsas till den centrala rygg näthinnan.

Praktiska överväganden är också motiverad när man väljer lämplig LIRD metoden. Den första bekymmer är kostnaderna för den nödvändiga utrustningen. Samtliga protokoll kräver en långvarig period av mörkeranpassning (data visas ej). En fristående mörkt hölje som är inbyggd i zebrafisk husmodulen är extremt bekväm, men inte nödvändigt. Även en kartong kan användas, om man är försiktig med tejp eller täta sömmarna, och vattnet parametrar övervakas. Den halogen-baserade LIRD metoden är extremt ekonomiskt och bekvämt. Alla objekt kan köpas för under $ 100 US på en lokal järnaffär och inrätta tar bara några minuter. Than bara praktisk nackdel med denna metod är besväret av att arbeta i samma rum som den ljusbehandling. Lamporna generera en bra mängd värme under drift kontinuerligt under 4 dagar och ljusintensiteten är både störande och potentiellt skadliga för mänsklig syn. UV och kombinerade metoder kräver en UV-källa, som inte är tillgänglig för varje laboratorium. Dessutom bör stor försiktighet vidtas för att garantera säkerheten för de lab medlemmar när de utför en UV-ljusbehandling. Således, medan det är mer praktiskt att ha apparaten halogenljus i ett isolerat utrymme, oro för säkerheten i UV-behandling kräver ett sådant utrymme. Detta blir ytterligare en olägenhet om UV-källan används för ljusbehandlingen är också typiskt för en fluorescerande mikroskop inrymt i ett "mikroskop room" eller avbildning kärna. Utföra flera omgångar av UV-behandlingar för kontroll och experimentella grupper av djur skulle kräva stänga av mikroskopet utrymme för en extensive tidslängd.

Kanske den största fördelen med att använda den kombinerade metoden är förmågan att utföra retinal regenerering studier på pigmenterade djur. Vi visar att varken enskilda metoden resulterar i betydande förlust av stavar och koner i rygg och ventrala näthinnan. Däremot de kombinerade LIRD paradigm ger liknande nivåer av utbredd tappar och stavar förlust i både pigmenterade och albino djur. Förmågan att tillämpa denna LIRD metod pigmenterade djur räddar forskaren betydande utrymme, tid, och dagtraktamenten djur sjukvårdskostnader (om någon), eftersom det eliminerar behovet av att skapa och upprätthålla transgena linjer av intresse på albino bakgrunden för retinal förnyelse studier . Tillsammans anser vi att de vetenskapliga och praktiska fördelarna överväger de eventuella olägenheter av denna förbättrade LIRD metoden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Xixia Luo för utmärkt fisk djurhållning och teknisk support. Detta arbete har finansierats av National Institutes of Health bidrag R21EY019401 (RT) och P30EY04068 (RT), och nystartade fonder till RT, inklusive en obegränsad bidrag från forskning att förebygga blindhet till Wayne State University, Department of Ophthalmology. JT fick stöd av ett Thomas C. Rumble Fellowship tillhandahålls av Wayne State University Graduate School.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UV light source Leica EL600
Glass Petri dish (150 x 20 mm) Sigma-Aldrich/Pyrex CLS3160152BO
250 ml glass beaker Sigma-Aldrich/Pyrex CLS1000250
4 L glass beaker Sigma-Aldrich/Pyrex CLS10004L
Aluminum foil Fisher 01-213-105
250 W halogen lamps Workforce 265-669
1.8 L clear acrylic tanks Aquaneering ZT180T
1.8 L clear acrylic tank lids Aquaneering ZT180LCL
Fan Honeywell HT-900
Aerator Tetra 77853-900
Thermometer Cole-Parmer YO-08008-58
Bent forceps (5/45) World Precision Instruments 504155

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J. Neurosci. 27, 7028-7040 (2007).
  2. Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J. Neurosci. 26, 6303-6313 (2006).
  3. Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. Regeneration of inner retinal neurons after intravitreal injection of ouabain in zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).
  4. Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
  5. Thummel, R., et al. Pax6a and Pax6b are required at different points in neuronal progenitor cell proliferation during zebrafish photoreceptor regeneration. Exp. Eye Res. 90, 572-582 (2010).
  6. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J. Neurobiol. 44, 289-307 (2000).
  7. Vihtelic, T. S., Soverly, J. E., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Retinal regional differences in photoreceptor cell death and regeneration in light-lesioned albino zebrafish. Exp. Eye Res. 82, 558-575 (2006).
  8. Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Muller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
  9. Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev. Neurobiol. 67, 1009-1031 (2007).
  10. Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Dev. Biol. 6, 36 (2006).
  11. Thummel, R., et al. Characterization of Muller glia and neuronal progenitors during adult zebrafish retinal regeneration. Exp. Eye Res. 87, 433-444 (2008).
  12. Thummel, R., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Enright, J. M., Hyde, D. R. Inhibition of Muller glial cell division blocks regeneration of the light-damaged zebrafish retina. Dev. Neurobiol. 68, 392-408 (2008).
  13. Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. J. Comp. Neurol. 518, 800-814 (2010).
  14. Morris, A. C., Scholz, T. L., Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. Genetic dissection reveals two separate pathways for rod and cone regeneration in the teleost retina. Dev. Neurobiol. 68, 605-619 (2008).
  15. Bignami, A., Dahl, D. The radial glia of Muller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp. Eye Res. 28, 63-69 (1979).
  16. Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog. Retin. Eye Res. 25, 397-424 (2006).
  17. Bringmann, A., Wiedemann, P. Muller glial cells in retinal disease. Ophthalmologica. 227, 1-19 (2012).
  18. Eisenfeld, A. J., Bunt-Milam, A. H., Sarthy, P. V. Muller cell expression of glial fibrillary acidic protein after genetic and experimental photoreceptor degeneration in the rat retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 25, 1321-1328 (1984).
  19. Anderson, D. H., Guerin, C. J., Erickson, P. A., Stern, W. H., Fisher, S. K. Morphological recovery in the reattached retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 168-183 (1986).
  20. Bruce, A. E., Oates, A. C., Prince, V. E., Ho, R. K. Additional hox clusters in the zebrafish: divergent expression patterns belie equivalent activities of duplicate hoxB5 genes. Evol. Dev. 3, 127-144 (2001).
  21. Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Res. Bull. 49, 377-391 (1999).
  22. Lewis, G. P., Fisher, S. K. Muller cell outgrowth after retinal detachment: association with cone photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 1542-1545 (2000).
  23. Fischer, A. J., Bongini, R. Turning Muller glia into neural progenitors in the retina. Mol. Neurobiol. 42, 199-209 (2010).
  24. Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends Mol. Med. 16, 193-202 (2010).
  25. Close, J. L., Liu, J., Gumuscu, B., Reh, T. A. Epidermal growth factor receptor expression regulates proliferation in the postnatal rat retina. Glia. 54, 94-104 (2006).
  26. Das, A. V., et al. Neural stem cell properties of Muller glia in the mammalian retina: regulation by Notch and Wnt signaling. Dev. Biol. 299, 283-302 (2006).
  27. Ikeda, T., Puro, D. G. Regulation of retinal glial cell proliferation by antiproliferative molecules. Exp. Eye Res. 60, 435-443 (1995).
  28. Liu, B., et al. Wnt signaling promotes muller cell proliferation and survival after injury. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54, 444-453 (2013).
  29. Osakada, F., et al. Wnt signaling promotes regeneration in the retina of adult mammals. J. Neurosci. 27, 4210-4219 (2007).
  30. Wan, J., et al. Preferential regeneration of photoreceptor from Muller glia after retinal degeneration in adult rat. Vision Res. 48, 223-234 (2008).
  31. Wan, J., Zheng, H., Xiao, H. L., She, Z. J., Zhou, G. M. Sonic hedgehog promotes stem-cell potential of Muller glia in the mammalian retina. Biochem. Biophys. Res. Commun. 363, 347-354 (2007).
  32. Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Muller glial cells. J. Comp. Neurol. 509, 225-238 (1002).
  33. Chang, G. Q., Hao, Y., Wong, F. Apoptosis: final common pathway of photoreceptor death in rd, rds, and rhodopsin mutant mice. Neuron. 11, 595-605 (1993).
  34. Marc, R. E., et al. Extreme retinal remodeling triggered by light damage: implications for age related macular degeneration. Mol. Vis. 14, 782-806 (2008).
  35. Portera-Cailliau, C., Sung, C. H., Nathans, J., Adler, R. Apoptotic photoreceptor cell death in mouse models of retinitis pigmentosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 974-978 (1994).
  36. Noell, W. K., Walker, V. S., Kang, B. S., Berman, S. Retinal damage by light in rats. Invest. Ophthalmol. 5, 450-473 (1966).
  37. Wenzel, A., Grimm, C., Samardzija, M., Reme, C. E. Molecular mechanisms of light-induced photoreceptor apoptosis and neuroprotection for retinal degeneration. Prog. Retin. Eye Res. 24, 275-306 (2005).
  38. Cicerone, C. M. Cones survive rods in the light-damaged eye of the albino rat. Science. 194, 1183-1185 (1976).
  39. La Vail, M. M. Survival of some photoreceptor cells in albino rats following long-term exposure to continuous light. Invest. Ophthalmol. 15, 64-70 (1976).
  40. Thomas, J. L., Nelson, C. M., Luo, X., Hyde, D. R., Thummel, R. Characterization of multiple light damage paradigms reveals regional differences in photoreceptor loss. Exp. Eye Res. 97, 105-116 (2012).
  41. Qin, Z., et al. FGF signaling regulates rod photoreceptor cell maintenance and regeneration in zebrafish. Exp. Eye Res. 93, 726-734 (2011).
  42. Craig, S. E., et al. The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 3244-3252 (2010).
  43. Morris, A. C., Schroeter, E. H., Bilotta, J., Wong, R. O., Fadool, J. M. Cone survival despite rod degeneration in XOPS-mCFP transgenic zebrafish. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 4762-4771 (2005).
  44. Nelson, C. M., Hyde, D. R. Muller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina. Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).
  45. Powell, C., Elsaeidi, F., Goldman, D. Injury-dependent Muller glia and ganglion cell reprogramming during tissue regeneration requires Apobec2a and Apobec2b. J. Neurosci. 32, 1096-1109 (2012).
  46. Ramachandran, R., Reifler, A., Wan, J., Goldman, D. Application of Cre-loxP recombination for lineage tracing of adult zebrafish retinal stem cells. Methods Mol. Biol. 884, 129-140 (2012).
  47. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/Dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15858-15863 (2011).
  48. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Insm1a-mediated gene repression is essential for the formation and differentiation of Muller glia-derived progenitors in the injured retina. Nat. Cell Biol. 14, 1013-1023 (2012).
  49. Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev. Cell. 22, 334-347 (2012).
  50. Morris, A. C., Forbes-Osborne, M. A., Pillai, L. S., Fadool, J. M. Microarray analysis of XOPS-mCFP zebrafish retina identifies genes associated with rod photoreceptor degeneration and regeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 2255-2266 (2011).
  51. Thummel, R., Bailey, T. J., Hyde, D. R. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J. Vis. Exp. (58), e3603 (2011).
A Novel ljusskada Paradigm för användning i Retinal Regeneration Studier i vuxna zebrafisk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thomas, J. L., Thummel, R. A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (80), e51017, doi:10.3791/51017 (2013).More

Thomas, J. L., Thummel, R. A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (80), e51017, doi:10.3791/51017 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter