Summary
Deze video toont een eenvoudige en betrouwbare strategie voor de bereiding van zuivere kweken van endotheelcellen van embryonale voorhersenen binnen 10-12 dagen en zal nuttig zijn voor onderzoek zich op vele aspecten van cerebrale angiogenese.
Abstract
Embryonale hersenen endotheelcellen kan dienen als een belangrijk instrument in de studie van angiogenese en neurovasculaire ontwikkeling en interacties. De twee vasculaire netwerken van de embryonale voorhersenen, pial en periventriculaire, zijn ruimtelijk onderscheidend en hebben een verschillende herkomst en groeipatronen. Endotheliale cellen van de pial en periventriculaire vasculaire netwerken hebben unieke genexpressie profielen en functies. Hier geven we een stap-voor-stap protocol voor isolatie, cultuur en verificatie van zuivere populaties van endotheelcellen uit de periventriculaire vasculaire netwerk (PVECs) van de embryonale voorhersenen (grote hersenen). In deze benadering wordt telencephalon zonder pial membraan verkregen uit embryonale dag 15 muizen gehakt, gedigereerd met collagenase / dispase en mechanisch gedispergeerd in een enkele celsuspensie. PVECs worden gezuiverd van celsuspensie met behulp van positieve selectie met anti-CD-31/PECAM-1 antilichaam geconjugeerd aan microbolletjes met behulp van een sterk magnetischscheidingsmethode. Gezuiverde cellen worden gekweekt op collageen 1 gecoate cultuur gerechten in endotheelcellen kweekmedium totdat ze samenvloeiing en verder gesubkweekt. PVECs verkregen met dit protocol tentoonstelling kasseien en spil gevormd fenotypes, zoals gevisualiseerd door fase-contrast licht microscopie en fluorescentie microscopie. Zuiverheid van PVEC culturen werd opgericht met endotheelcellen markers. In onze handen, deze methode betrouwbaar en consistent levert zuivere populaties van PVECs. Dit protocol zal profiteren studies gericht op het verkrijgen van mechanistische inzichten in voorhersenen angiogenese, het begrijpen PVEC interacties, en cross-gesprekken met neuronale celtypes en heeft enorm potentieel voor therapeutische angiogenese.
Introduction
Angiogenese, neurogenese en neuronale migratie zijn kritieke gebeurtenissen in het centrale zenuwstelsel (CNS) ontwikkeling, herstel en regeneratie. Verschillende elegante studies hebben aangetoond dat endotheelcellen stimuleert neuronale proliferatie en vice versa door afgifte van oplosbare factoren en door direct contact. We vonden het merkwaardig dat in de meerderheid van deze studies 1-3, terwijl neuronale voorlopercellen / neurale stamcellen worden geïsoleerd uit de embryonale hersenen, worden ze gekweekt samen met endotheliale cellen van de volwassen hersenen, andere volwassen weefsel bronnen of endotheliale cellijnen. Dit kan gedeeltelijk te wijten zijn aan de technische moeilijkheden bij het isoleren en kweken van zuivere populaties van endotheelcellen van embryonale hersenen. Echter, angiogenese, neurogenese en neuronale migratie zijn gelijktijdige gebeurtenissen in ordes van grootte meer robuust in de embryonale hersenen dan in de normale volwassen hersenen. De periventriculaire vasculaire netwerk van de embryonic voorhersenen (grote hersenen) afkomstig uit een vat geplaatst in de basale ganglia primordium en ontwikkelt in de vorm van een ordelijke gradiënt van ventraal grote hersenen, rug van embryonale dag 11 (E11) 4,5. Deze plexus van schepen van de periventriculaire vasculaire netwerk zijn te onderscheiden van pial schepen op basis van afkomst, anatomische locatie, groeipatronen en ontwikkelingsregulatie 4,5. De richting van de voortplanting van de periventriculaire angiogenese verloop overeenkomt met de telencephalic dwarse neurogenetische verloop. Binnen de grote hersenen, de periventriculaire angiogenese gradiënt en het verloop van GABA neuronen migreren tangentiaal overlapt ruimtelijk en 6. Met betrekking tot de timing, de angiogenese gradiënt is op voorhand van de neurogenetische gradiënt en GABA neuron gradiënt met ongeveer een dag. Zo periventriculaire endotheelcellen zijn in ruimte en tijd goed gepositioneerd om kritische aanwijzingen te verstrekken aan telencephalic neurogenese ondersteunen enneuronale migratie 4,6. Daarom zou het gebruik van embryonale periventricular endotheelcellen in coculture experimenten met neuronale voorlopercellen en / of neuronen een gunstiger model voor het bestuderen neurovasculaire interacties en het ontwikkelen van nieuwe mogelijkheden voor de behandeling van neurodegeneratieve ziekte of ischemische / traumatisch hersenletsel te bieden.
We benadrukken het belang van het verwijderen van de pial membraan, niet alleen om epitheliale besmetting cel te beperken, maar ook om pial endotheelcellen die moleculair en functioneel verschillend van endotheelcellen van de periventriculaire vasculaire netwerk 4,6 (genoemd PVECs te onderscheiden van pial EC's) zijn te scheiden . Hier beschrijven we de methode die we regelmatig gebruiken in ons laboratorium een rijke en zuivere opbrengst van PVECs verkrijgen. Deze endotheelcellen zijn bereid uit embryonale voorhersenen geïsoleerd uit een getimede-zwangere muis. Zij kunnen worden uitgebreid gesubkweekt en neer bevroren succes voor toekomstig gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van reagentia en oplossingen
- Coating van 35 mm kweekschaal: collageen type 1 oplossing wordt geleverd als een waterige oplossing van 20 mM azijnzuur (-100 mg eiwit / flacon). Verdun een zodanige hoeveelheid van collageen oplossing om een werkende concentratie van 0,01% met behulp van steriele weefselkweek kwaliteit water. Coat gerechten met 1 ml collageenoplossing voor 3-4 uur bij kamertemperatuur (KT) of 37 ° C of overnacht bij 2-8 ° C. Verwijder overtollige oplossing uit de gecoate schaal en laat het een nacht drogen. Spoel de schotel met weefselkweek kwaliteit water of PBS voor het toevoegen van media. Gecoate gerechten kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende een maand.
- Bereid compleet Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Vul het DMEM (500 ml) met 10% FBS en antibiotica-antimycotische oplossing (1x concentratie 1 ml/100 ml). Volledige DMEM kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende twee maanden.
- Bereid een aliquot (50 ml) DMEM met DNase I (0,001 mg / ml) (hierna DMEM-DNase I).
- Een volgende hoeveelheid (10 ml) DMEM met collagenase en dispase (1 mg / ml) (hierna DMEM-collagenase/dispase).
- Bereid endotheelcellen kweekmedium (ECCM 500 ml), aangevuld met EGF (5 ug), ECGS (100 mg) en 5 ul van antibiotica-antimycotische oplossing. ECCM kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende twee maanden.
- Voorverwarmen alle media voor gebruik.
- Bereid Zuivering buffer: PBS, pH 7,2 met 0,5% BSA en 2 mM EDTA. Houd buffer koud (2-8 ° C).
2. Verwijdering van embryo's en Dissection van Telencephalon
Alle experimenten met proefdieren zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik commissies van McLean Hospital en voldoen aan de NIH richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.
- Gebruik getimede zwangere CD1-muizen (embryonale dag 15). De dag van de vaginale plug ontdekking wordt beschouwd als embryonale dag 0 (E0). CD1 dammen produceren over het algemeen grote nesten, zo 10-12 embryos worden verwacht van een zwangere dam.
- Voor hysterotomie verdoven zwangere muizen een intraperitoneale injectie van ketamine (100 mg / kg) / xylazine (5 mg / kg). Voor muizen ongeveer 20-30 g, levert 0,3 ml van een 10 ml / kg ketamine / xylazine anestheticum en waarborgen die pijn en ongemak is minimaal tijdens intraperitoneale injecties van verdoving. Gebruik de hand terughoudendheid voor de injecties.
- Controleer diepe verdoving door teen knijpen. Verwijder embryo's uit diep verdoofde muizen. Onthoofden elk embryo onmiddellijk na verwijdering uit de moeder. Plaats de embryonale hoofden in steriele petrischaaltjes in ijskoud PBS.
- Volg hysterectomie door directe euthanasie met verdoving overdosis (130 mg / kg pentobarbital, ip), een methode voor euthanasie, die in overeenstemming is met de AVMA Richtlijnen voor de euthanasie van dieren: 2013 Edition.
- Onder een stereomicroscoop, verwijder de hersenen uit het hoofd met fijne microtip schaar en fijn pincet. Opmerking: Een hoge kwaliteit ontledenion is essentieel om succesvol te verwijderen de pial membraan van de embryonale hersenen. Dit wordt bereikt door de praktijk. Fijn pincet en microtip scharen zijn ook belangrijke instrumenten voor het verkrijgen van een goede dissectie.
- Gebruik de tang om een stevige grip op de hersenen en de microtip schaar naar afpellen de pial membraan. Verwijder het mesencephalon en metencephalon en isoleren het telencephalon. Transfer pial-vrij grote hersenen van alle embryo's naar een 35 mm cultuur schotel met 2 ml PBS in ijs.
3. Celisolatie
- Hak het telencephalon in 1-2 mm fragmenten met een scalpel en verzamel weefsel in een 15 ml Falcon buis met 2 ml compleet DMEM.
- Distantiëren weefsel grondig, maar voorzichtig met een pipet 1 ml tot klonten verdwijnen en een melkachtige suspensie wordt bereikt.
- Centrifugeer gedissocieerde cellen bij 800-1000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer pellet in DMEM-DNase I. voorzichtig distantiëren de cells opnieuw met 1 ml pipet en centrifugeer bij 800-1000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer de pellet in warme compleet DMEM. Filter cellen door een steriele 70 um nylon gaas. Verzamel gefilterde cellen en in het ijs te houden.
- Verzamel de cel-gedeelten van het gaas gehouden en verteren verder met DMEM-collagenase/dispase (2 ml) gedurende 1-2 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen 3x in DMEM-DNase I door centrifugatie bij 800-1000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zwembad deze cellen met de gefilterde cellen in stap 3.5 verzameld. Was de totale cellen eenmaal met complete DMEM. Ga verder met het aantal cellen en magnetische etikettering stappen te bepalen. Opmerking: Het is belangrijk om een enkele-celsuspensie voor magnetische kenmerken te verkrijgen.
4. Magnetische Labeling
- Dit protocol geeft de magnetische kenmerken van 10 7 cellen. Voor cel aantallen lager dan 10 7, gebruiken dezelfde reagens volume en voor mobiele nummers van meer dan 10 7, opschalen alle reagens volumes en het totale volumedienovereenkomstig (bijv. voor 2 x 10 7 totaal cellen, gebruik twee keer het volume van alle aangegeven reagentia). Houd alle reagentia en cellen in ijs.
- Bepaal het aantal cellen met een hemocytometer.
- Centrifugeer celsuspensie bij 300 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Aspireren supernatans volledig.
- Voeg 90 μl/10 7 cellen zuivering buffer om de celpellet gevolgd door 10 ul CD31 microbolletjes. De Microbeads verstrekt door de fabrikant worden geconjugeerd anti-muis CD31 antilichaam monoklonale.
- Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten in de koelkast. Opmerking: Hogere temperaturen en / of langere incubatietijd gedurende magnetische kenmerken kan leiden tot niet-specifieke binding.
- Was de cellen door toevoeging van 1-2 ml/10 7 cellen zuivering buffer en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 minuten. Verwijder de supernatant en resuspendeer cellen in 500 ui buffer zuivering. Ga verder met magnetische afscheiding of zuiveringsstap.
5. Puhet zuiveren
- Plaats MS kolom in het magneetveld van MACS Separator.
- Kolom spoelen met 500 ul van zuivering buffer.
- Breng celsuspensie op de kolom. Plaats geschikt aantal cellen naar MS kolom als hoger aantal cellen in de kolom kunnen verstoppen. Let op: Elke kolom MS is geschikt voor een maximum aantal van 2 x 10 7 cellen, voor een groter aantal cellen, gebruiken meer kolommen.
- Verzamelen en gooi flow-through met ongelabelde cellen.
- Waskolom met 500 ui buffer zuivering driemaal. Tijdens het wassen stappen, zorg ervoor dat de kolom reservoir leeg is voordat het toevoegen daaropvolgende zuivering buffer porties.
- Verwijder kolom uit de MACS separator en plaats deze op een 15 ml Falcon buis.
- Een plunjer wordt geleverd samen met de kolom MS. Pipetteer 1 ml van zuivering buffer op de kolom MS en onmiddellijk spoelen van de magnetisch gelabelde cellen door stevig indrukken van de zuiger in de kolom.
- Plaat celIs op een 35 mm kweekschaal vooraf bekleed met collageen type 1 en groeien cellen ECCM in een incubator ingesteld op 37 ° C met 95% O2 en 5% CO2.
- Verander het medium om de vier dagen. Gebruik PVECs voor experimenten of subcultuur na 10-12 dagen wanneer het gerecht is samenvloeiing.
6. Subcultuur van PV ECS
- Verwijder de ECCM en spoel de monolaag van PVECS met 1-2 ml steriel PBS.
- Voeg voorzichtig 1,5 ml 0,25% trypsine-EDTA-oplossing om de cel monolaag bedekken.
- Breng het gerecht aan de incubator. Binnen 5-7 minuten, zullen cellen los van het oppervlak van de schotel.
- Nadat de cellen losgemaakt, onmiddellijk een gelijk volume trypsine remmer toe en vermaal meerdere malen.
- Breng de cellen naar een steriele 15 ml Falcon buis. Centrifugeer het buisje bij 500 xg gedurende 5 minuten.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 ml voorverwarmd ECCM.
- Zaad de cellen voor het uitbreiden van de cultuur, imveroudering of andere testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De fenotypische karakterisatie van PVECs van dag 1-12 wordt getoond door fase-contrast lichtmicroscopie (figuur 2). De cellen die aan de schotel op dag 1 laten zien morfologie kenmerk van celdeling (Figuur 2A). Tussen de 5-8 dagen, PVECs overgang van kasseien op gevormde morfologie typisch voor endotheelcellen en meer verwant aan de in vivo toestand (figuren 2B en 2C) spindel. Per dag 12 de PVEC cultuur behaalt volledige samenvloeiing (figuur 2D). PVECs kan gemakkelijk worden gesubkweekt naar de kolonie (figuren 2E-G) uit te breiden. Zuiverheid van endotheliale celculturen werd opgericht met endotheelcellen markers - isolectin B4, CD-31/PECAM-1, Von Willebrand Factor (vWF) en VE-cadherine en was vastbesloten om een honderd procent na subcultuur (figuren 2H-K).
Hoge vergroting beelden van PVECs bereid uit CD1 embryo evenals Tie2-GFP embryo 4 (waarvan endotheelcellen tot expressie GFP) weergegeven (figuur 3). Naast de gemeenschappelijke geplaveide en spoelvormige morfologie (Figuren 3A-C), werden veelhoekige morfologie met slanke processen ook waargenomen in isolectin-B4 gemerkt en Tie2-GFP + ve PVECs (figuren 3D en 3E). In enkele collageen beklede kweekplaten (in afwezigheid van Matrigel), PVECs gevormde rooster patroon lijkt op de unieke eigenschap van de in vivo periventriculaire vasculaire netwerk (Figuur 3F). Dit weerspiegelt de hoge angiogene potentieel van PVECs. Een angiogenese assay werd uitgevoerd waarbij PVECs (2 x 10 4 cellen) werden toegevoegd aan kweekplaten bekleed met Matrigel matrix. PVECs toonde robuuste buis vorming binnen 18 uur (Figuur 3G). Deze resultaten leveren sterk bewijs dat dit systeem kan worden gebruikt als een in vitro endotheelcel model. PVECs geïsoleerdCD1 embryo kan snel worden gelabeld met Qdot nanokristallen (Figuur 3H) die intense stabiele fluorescentie te leveren in het cytoplasma van levende cellen en kan worden gebruikt voor lange termijn studies van levende PVECs, zoals migratie, motiliteit, morfologie, cel-functie assays en in vivo experimenten. PVECs getransfecteerd kunnen worden met een mobiele tracers zoals Cell Light Plasma Membraan-RFP, BacMam 2.0 (Figuur 3I) volgens de instructies van de fabrikant voor een duidelijke visualisatie van cel morfologie in live cell imaging experimenten.
We gekweekt PVECs niet alleen ECCM, maar ook in rattenhersenen endotheliale celgroei medium (RBECGM) DMEM en F12-medium. Zowel fasecontrast (Figuren 4A, 4C en 4E) en isolectin B4 gelabeld beelden (figuren 4B, 4D en 4F) van PVECs gekweekt in ECCM (Figuren 4A en 4B), RBECGM (Figuren 4C en
Figuur 1. Schematische voorstelling van PVEC isolatie. Het protocol voor isolatie en purification van PVECs uit de embryonale telencephalon wordt samengevat in een schema. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2. Fenotypisch karakteriseren PVECs. (AG) Fase contrast afbeeldingen van PVEC cultuur op verschillende tijdstippen na plating. (A) PVEC cultuur op dag 1. Cellen hebben gehecht en tonen delen morfologie. (B) PVEC cultuur op dag 5 en (C) op dag 8 overgang van kasseien vorm morfologie spindel. (D) PVEC cultuur bereikt samenloop op dag 12. (E) PVECs na subcultuur op dag 1, (F) dag 5 (G (HJ) immunolabeling van PVECs gebruik endotheel markers: isolectin B4 (H), Von Willebrand Factor (I), CD31/PECAM (J) en VE-cadherine (K). Schaalbalken: A, 100 micrometer (geldt BJ), K, 50 pm. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3. Morfologie van PVECs. (AE) Hoge vergroting beelden van isolectin-B4 geëtiketteerd en Tie2-GFP + ve PVECs tonen kasseien en spil vormige morfologie (AC) en veelhoekige morfologie met slanke lange extensies (D, E). (<strong> F) PVECs vertonen een hoge angiogene potentieel in cultuur schotel, zelfs in de afwezigheid van Matrigel. (G) PVECs tonen robuuste buis formatie in een angiogenese assay op Matrigel. (H) PVECs gelabeld met Qdot nanokristallen. (I) PVECs getransfecteerd met Cell Light Plasma Membraan-RFP, BacMam 2.0. Schaalbalken: A, 50 pm, B, 15 micrometer (geldt CE), F, 100 micrometer (geldt G, H), I, 50 pm. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 4. PVECs gekweekt in verschillende voedingsbodems tonen variant morfologie. (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PVEC zijn meer fysiologisch relevante dan volwassen hersenen endotheelcellen en EC's uit ander weefsel bronnen voor onderzoek gericht op neurovasculaire interacties en ook therapeutisch potentieel. Voor PVEC voorbereiding, is het essentieel begin met dissectie snel werken om een goede levensvatbaarheid te bereiken, aangezien de dode cellen niet-specifiek kan binden aan CD31 microbolletjes. Bovendien, als eencellige suspensie niet bereikt voordat de magnetische etiket stap resulteert dit in problemen omdat celklonten de kolom verstoppen. Een voordeel van deze methode is dat er geen noodzaak voor incubatie met trypsine om cellen los te maken van magnetische korrels, een tijdrovende en dikwijls moeilijke stap in andere magnetische bead-based scheidingsmethodes voor EC preparaten 4,7. Bovendien is deze techniek niet afzonderlijk grote hoeveelheden embryonale hersenweefsel nodig. PVEC kan constant worden bereid met behulp van een getimede zwangere muis caoximately 12 dagen, subgekweekt en gebruikt in een grote verscheidenheid van in vitro en in vivo experimenten.
De zuiverheid van PVECs na isolatie is dan 90% en de zuiverheid van PVECs na subcultuur 100%. Naast endotheelcellen wordt PECAM-1 op het oppervlak van monocyten / macrofagen. Microglia, de macrofaag populatie van het CZS is echter zeer laag in de embryonale hersenen van muizen in vergelijking met postnatale of volwassen hersenen 8. Monocyten / microglia nodig medium aangevuld met 10% foetaal kalf serum en specifieke groeifactoren te groeien, ze zullen uiteindelijk sterven in ECCM en zal niet lang na subcultuur van PVECs. Bij 100% zuiver PVECs nodig onmiddellijk na isolatie (bijvoorbeeld genexpressie testen) gebruiken we fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) methode. PVECs worden dan geïsoleerd van Tie2GFP embryo (waarin alleen endotheelcellen uitdrukken GFP) en streng gesorteerd per dual FACS-analyse. De zuiverheid van de gesorteerde endotheell cellen worden verzekerd door verzameling cellen die zijn dubbel positief voor GFP en CD31/PECAM-1 6.
Culturen zijn ook nauw waargenomen in de eerste week van isolatie voor vervuilende celtypen zoals pericytes. Aangezien pericyte cellen onregelmatig gevormd en zal nooit vormen een confluente monolaag tegenstelling endotheelcellen die bestaan uit spoelvormige of veelhoekige, contact cellen die groeien als kolonies, ze gemakkelijk te herkennen indien aanwezig. Als pericyte gedetecteerd wordt, een lagere concentratie van trypsine (0,05%), gevolgd door een snelle behandeling met trypsine procedure (2-3 min) wordt gebruikt voor subcultuur van PVECs. Pericytes vereisen een langere behandeling met trypsine tijd (7-10 min) en wordt bevestigd blijven. Bovendien, de plating efficiëntie van trypsine pericyten (indien aanwezig) is zeer slecht. Deze stappen elimineren pericyte vervuiling en zorgen dat gesubkweekt PVECs zuiver zijn.
De ECCM medium een lage serum medium met hydrocortison,heparine en 2% foetaal runderserum en aangevuld met epidermale groeifactor (EGF) en endotheliale celgroei Supplement (ECG). PVECs gekweekt in ECCM toonde spoelvormige morfologie consistent. De rattenhersenen ECGM bevat 10% foetaal runderserum, groeifactoren en VEGF. PVECs gegroeid in deze media hebben zeer langwerpige morfologie en langer duren om confluentie bereiken. De DMEM-F12 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum, GlutaMAX en endotheliale celgroei vullen en induceert proliferatie meer dan andere media. Hoewel PVECs gegroeid in deze media toonde zeer snelle groei en bereikte confluentie in 4 dagen, hun morfologie waren vlak of slechts veelhoekige. We zijn gegroeid PVECs in ECCM tot drie passages zonder verlies van fenotype en functie. Daarom ECCM is het medium dat we liever voor PVEC cultuur.
PVECs gekweekt samen met neuronale precursoren door dit protocol waarschijnlijk neurogenese en neuronale migratie stimuleren om far-grotere mate dan endotheelcellen van volwassen hersenen of uit andere bronnen en kan waardevol voor het helpen van herstel van de neurologische functie in een beroerte, traumatisch hersenletsel of neurodegeneratie. Neuronale voorlopers getransplanteerd in de volwassen hersenen zijn vaak gemeld tot stilstand en niet om te migreren naar regio's die nieuwe neuronen nodig. Dit probleem wordt opgenomen om het ontbreken van substraten die neuronale migratie als radiale gliale geleiders 9 vergemakkelijken. Vaatstelsel wordt steeds meer gewaardeerd als substraten voor neuronale migratie 6,10,11. PVECs kan een oplossing voor deze geblokkeerd neuronale precursors bij transplantatie sites bieden. Coimplantation van PVECs en neuronen in de beschadigde hersengebieden kunnen begeleide de migratie van neuronen vergemakkelijken door endotheelcellen en helpen bij het bereiken functioneel herstel. De nauwe betrokkenheid van endotheelcellen met het migreren van neuronen ook maakt ze bij uitstek geschikt om groeifactoren en morphogens direct en selectief in te leverenmigrerende neuronen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een Nationale Alliantie voor onderzoek naar schizofrenie en depressie (NARSAD) Young Investigator Award en de National Institutes of Health verlenen R01NS073635 naar AV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNase I | Sigma | D-4527 | |
| Collagen, Type 1 solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| DPBS | Quality Biologicals | 114057-131 | |
| EDTA | Fisher Scientific | M4055 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| CD31 microbeads | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| MACS separator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Bioscience | 352350 | |
| Antibiotic and antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| 35 mm Culture dish | BD Bioscience | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352097 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352098 | |
| ECCM kit | BD Bioscience | 355054 | Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF, and Soybean Trypsin Inhibitor |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| RBECGM | Cell Applications | R819-500 | |
| DMEM F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 305050-061 | |
| Tissue culture grade water | Life Technologies | 15230162 | |
| 0.25% Trypsin | Life Technologies | 15050 | |
| Soybean trypsin inhibitor | BD Bioscience | 5425 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Life Technologies | Q25021 | |
| CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| Biotinylated Isolectin B4 antibody | Sigma | L2140 | |
| Anti-Von Willebrand factor | Sigma | F3520 | |
| Anti-CD31/PECAM-1 | BD Pharmingen | 550274 | |
| VECTASHIELD Hardset Mounting Media with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Ketamine | Butler Schein Animal Health Supply | 44028 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 1009 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Inverted microscope | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| Fluorescent microscope | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| Fine forceps | Roboz Surgical Instrument | 7 inox | |
| Fine microtip scissors | Roboz Surgical Instrument | RS5611 |
References
- Shen, Q., S, G., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
- Milner, R. A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system. BMC Neurosci. 8, 3 (2007).
- Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo. 19, 1469-1485 (2008).
- Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).
- Vasudevan, A., Bhide, P. G. Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale. Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).
- Won, C. K., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).
- Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).
- Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6, (2011).
- Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain. 2, 461-466 (1999).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
