Summary
यह वीडियो 10-12 दिनों के अंदर भ्रूण अग्रमस्तिष्क से endothelial कोशिकाओं की शुद्ध संस्कृति की तैयारी के लिए एक आसान और विश्वसनीय रणनीति को दर्शाता है और मस्तिष्क angiogenesis के कई पहलुओं पर ध्यान केंद्रित अनुसंधान के लिए उपयोगी हो जाएगा.
Abstract
भ्रूण मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं angiogenesis और neurovascular विकास और बातचीत के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में काम कर सकते हैं. भ्रूण अग्रमस्तिष्क, pial और periventricular के दो संवहनी नेटवर्क, स्थानिक विशिष्ट होते हैं और अलग मूल और विकास पैटर्न है. Pial और periventricular संवहनी नेटवर्क से endothelial कोशिकाओं अद्वितीय जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल और कार्य किया है. यहाँ हम भ्रूण अग्रमस्तिष्क (telencephalon) की periventricular संवहनी नेटवर्क (PVECs) से endothelial कोशिकाओं का शुद्ध आबादी के अलगाव, संस्कृति, और सत्यापन के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल उपस्थित थे. इस दृष्टिकोण में, भ्रूण दिन 15 चूहों से प्राप्त pial झिल्ली से रहित telencephalon, कीमा बनाया हुआ है collagenase / dispase के साथ पचा, और एक एकल कक्ष निलंबन में यंत्रवत् छितरी हुई है. PVECs एक मजबूत चुंबकीय का उपयोग microbeads संयुग्मित anti-CD-31/PECAM-1 एंटीबॉडी के साथ सकारात्मक चयन का उपयोग सेल निलंबन से शुद्ध कर रहे हैंजुदाई विधि. वे मिला हुआ है और आगे subcultured बनने तक शुद्ध कोशिकाओं endothelial सेल संस्कृति के माध्यम में कोलेजन 1 लेपित संस्कृति व्यंजन पर सुसंस्कृत हैं. चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी प्रकाश और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना के रूप में PVECs, इस प्रोटोकॉल प्रदर्शनी पत्थर और धुरी आकार phenotypes के साथ प्राप्त की. PVEC संस्कृतियों की पवित्रता endothelial सेल मार्कर के साथ स्थापित किया गया था. हमारे हाथ में, इस विधि मज़बूती से और लगातार PVECs का शुद्ध आबादी पैदावार. इस प्रोटोकॉल, अग्रमस्तिष्क angiogenesis में यंत्रवत अंतर्दृष्टि रहा PVEC बातचीत, और neuronal सेल प्रकार के साथ पार वार्ता को समझने और चिकित्सीय angiogenesis के लिए जबरदस्त क्षमता रखती करने के उद्देश्य से पढ़ाई को फायदा होगा.
Introduction
Angiogenesis, न्यूरोजेनेसिस और neuronal प्रवास केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के विकास, मरम्मत और उत्थान में महत्वपूर्ण घटनाओं रहे हैं. कई सुरुचिपूर्ण पढ़ाई endothelial कोशिकाओं घुलनशील कारकों की रिहाई के माध्यम से और सीधे संपर्क से neuronal प्रसार और इसके विपरीत प्रोत्साहित दिखाया है. हम यह उत्सुक neuronal progenitors / न्यूरल स्टेम सेल भ्रूण के मस्तिष्क से अलग कर रहे हैं, जबकि इन अध्ययनों में 1-3 के बहुमत में, वे वयस्क मस्तिष्क, अन्य वयस्क ऊतक स्रोतों, या endothelial सेल लाइनों के साथ से endothelial कोशिकाओं के साथ cocultured हो पाया. इस भाग में भ्रूण के मस्तिष्क से endothelial कोशिकाओं का शुद्ध आबादी अलग और संवर्धन के साथ जुड़े तकनीकी कठिनाइयों के कारण हो सकता है. हालांकि, angiogenesis, neurogenesis, और neuronal प्रवास सामान्य वयस्क मस्तिष्क में से भ्रूण के मस्तिष्क में और अधिक मजबूत परिमाण के आदेश में होने वाली समवर्ती घटनाओं रहे हैं. embryoni की periventricular संवहनी नेटवर्कसी अग्रमस्तिष्क (telencephalon) बेसल ganglia उत्स के भीतर स्थित एक पोत से निकलती है और भ्रूण दिन 11 (E11) 4,5 द्वारा telencephalon पृष्ठीय को उदर से एक अर्दली ढाल के रूप में विकसित करता है. Periventricular संवहनी नेटवर्क के जहाजों के इस जाल मूल, संरचनात्मक स्थान, विकास पैटर्न, और विकास विनियमन 4,5 पर आधारित pial जहाजों से अलग कर रहे हैं. periventricular angiogenesis ढाल के प्रसार की दिशा telencephalic अनुप्रस्थ neurogenetic ढाल से मेल खाता है. Telencephalon के भीतर, periventricular angiogenesis ढाल और पलायन GABA न्यूरॉन्स की ढाल tangentially के रूप में अच्छी तरह से स्थानिक 6 overlaps. समय के लिए सम्मान के साथ, angiogenesis ढाल के बारे में एक दिन से neurogenetic ढाल और GABA न्यूरॉन ढाल के अग्रिम में है. इस प्रकार, periventricular endothelial कोशिकाओं स्थानिक हैं और अस्थायी अच्छी तरह telencephalic न्यूरोजेनेसिस समर्थन करने के लिए महत्वपूर्ण cues प्रदान करने के लिए तैनात है औरneuronal प्रवास 4,6. इसलिए, neuronal progenitors और / या न्यूरॉन्स के साथ coculture प्रयोगों में भ्रूण periventricular endothelial कोशिकाओं का उपयोग neurovascular अध्ययन बातचीत और neurodegenerative रोग या इस्कीमिक / घाव मस्तिष्क की चोट के इलाज के लिए उपन्यास रास्ते के विकास के लिए एक अधिक अनुकूल मॉडल उपलब्ध कराएगा.
हम उपकला सेल संदूषण सीमित करने के लिए, लेकिन यह भी molecularly और periventricular संवहनी नेटवर्क 4,6 (pial ईसीएस से अलग करने के लिए कहा जाता PVECs) के endothelial कोशिकाओं से कार्यात्मक अलग कर रहे हैं जो pial endothelial कोशिकाओं को अलग करने के लिए न केवल, pial झिल्ली को दूर करने के महत्व पर जोर . यहाँ, हम हम नियमित PVECs के एक अमीर और शुद्ध उपज प्राप्त करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में उपयोग करने वाले विधि का वर्णन. ये endothelial कोशिकाओं एक ही समय गर्भवती माउस से अलग भ्रूण forebrains से तैयार कर रहे हैं. वे भविष्य में उपयोग के लिए सफलतापूर्वक विस्तार subcultured, और नीचे जमे हुए किया जा सकता है.
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Protocol
1. अभिकर्मकों और समाधान की तैयारी
- 35 मिमी संस्कृति डिश की कोटिंग: कोलेजन टाइप 1 समाधान 20 मिमी एसिटिक एसिड (~ 100 मिलीग्राम प्रोटीन / शीशी) में एक जलीय समाधान के रूप में आपूर्ति की है. बाँझ टिशू कल्चर ग्रेड पानी का उपयोग कर 0.01% की एक काम एकाग्रता के लिए कोलेजन समाधान का एक उचित मात्रा पतला. 1 कमरे के तापमान (आर टी) में 3-4 घंटे के लिए कोलेजन समाधान के मिलीलीटर या 37 डिग्री सेल्सियस, या रात 2-8 डिग्री सेल्सियस के साथ कोट व्यंजन लेपित पकवान से अतिरिक्त समाधान निकालें और यह रातोंरात सूखे की अनुमति. मीडिया जोड़ने से पहले टिशू कल्चर ग्रेड पानी या पीबीएस के साथ पकवान कुल्ला. लेपित व्यंजन एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
- पूरा Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) तैयार करें. (; 1 ml/100 मिलीलीटर 1x एकाग्रता) 10% FBS और एंटीबायोटिक antimycotic समाधान के साथ DMEM (500 मिलीलीटर) पूरक. पूरा DMEM दो महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
- एक विभाज्य DNase मैं (0.001 मिलीग्राम / एमएल) के साथ DMEM के (50 मिलीलीटर) तैयार, (डी के रूप में भेजासदस्य DNase मैं).
- Collagenase और dispase (DMEM-collagenase/dispase के रूप में) (1 मिलीग्राम / एमएल) के साथ DMEM के एक और विभाज्य (10 मिलीलीटर) तैयार करें.
- EGF (5 ग्राम) के साथ पूरक Endothelial सेल संस्कृति माध्यम (ECCM, 500 मिलीलीटर), तैयार करें, ईसीजी (100 मिलीग्राम) और एंटीबायोटिक antimycotic समाधान के 5 μl. ECCM दो महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
- उपयोग करने से पहले सभी मीडिया Prewarm.
- 0.5% BSA और 2 मिमी EDTA के साथ पीबीएस, पीएच 7.2: शोधन बफर तैयार करें. ठंड बफर रखें (2-8 डिग्री सेल्सियस).
2. Telencephalon की भ्रूण और विच्छेदन का हटाया
प्रयोगशाला पशुओं का उपयोग सभी प्रयोगों मैकलीन अस्पताल के पशु की देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित और प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए एनआईएच दिशा निर्देशों के अनुरूप हैं.
- समय गर्भवती CD1 चूहों (भ्रूण दिन 15) का प्रयोग करें. योनि प्लग खोज का दिन भ्रूण दिन 0 (E0) माना जाता है. CD1 बांधों आम तौर पर बड़े litters उपज है, इसलिए 10-12 भ्रूणएक गर्भवती बांध से उम्मीद कर रहे हैं.
- Hysterotomy के लिए, Ketamine (100 मिलीग्राम / किग्रा) / xylazine (5 मिलीग्राम / किग्रा) की एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ गर्भवती चूहों anesthetize. चूहों लगभग 20-30 ग्राम के लिए, एक 10 मिलीग्राम / किग्रा Ketamine / xylazine संवेदनाहारी समाधान के 0.3 मिलीलीटर देने और उस दर्द को सुनिश्चित करने और संकट संवेदनाहारी के intraperitoneal इंजेक्शन के दौरान कम से कम है. इंजेक्शन के लिए हाथ संयम का प्रयोग करें.
- पैर के अंगूठे चुटकी से गहरी संज्ञाहरण की जाँच करें. गहरा anesthetized चूहों से भ्रूण निकालें. तुरंत मां से हटाने पर प्रत्येक भ्रूण सिर काटना. बर्फ के ठंडे पीबीएस में बाँझ पेट्री डिश में भ्रूण सिर रखें.
- 2013 संस्करण: संवेदनाहारी जरूरत से ज्यादा (130 मिलीग्राम / किग्रा pentobarbital, आईपी), पशु की इच्छामृत्यु के लिए AVMA दिशा निर्देशों के अनुरूप है जो इच्छामृत्यु, के लिए एक विधि के साथ तत्काल इच्छामृत्यु द्वारा गर्भाशय का पालन करें.
- एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत, ठीक microtip कैंची और ठीक संदंश के साथ सिर से मस्तिष्क को हटा दें. नोट: एक उच्च गुणवत्ता काटनाआयन सफलतापूर्वक भ्रूण के मस्तिष्क से pial झिल्ली को दूर करने के लिए आवश्यक है. इस अभ्यास के द्वारा हासिल की है. ठीक संदंश और microtip कैंची भी एक अच्छा विच्छेदन प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण औजार हैं.
- Pial झिल्ली दूर छील करने के लिए मस्तिष्क और microtip कैंची पर एक फर्म पकड़ पाने के लिए संदंश का प्रयोग करें. Mesencephalon और metencephalon निकालें और telencephalon अलग. बर्फ में 2 मिलीलीटर पीबीएस के साथ एक 35 मिमी संस्कृति डिश के लिए सभी भ्रूण से pial मुक्त telencephalon स्थानांतरण.
3. सेल अलगाव
- एक स्केलपेल ब्लेड के साथ 1-2 मिमी टुकड़ों में telencephalon क़ीमा और पूरा DMEM के 2 मिलीलीटर युक्त एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में ऊतक इकट्ठा.
- Clumps गायब हो और एक दूधिया निलंबन हासिल की है जब तक एक 1 मिलीलीटर विंदुक के साथ धीरे लेकिन पूरी तरह ऊतक अलग कर देना.
- अपकेंद्रित्र आरटी पर 5 मिनट के लिए 800-1000 XG पर कोशिकाओं अलग.
- ध्यान CE अलग कर देना धीरे DMEM-DNase मैं में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली निकालेंLLS फिर आरटी पर 5 मिनट के लिए 800-1000 XG में 1 मिलीलीटर विंदुक और अपकेंद्रित्र का उपयोग कर.
- गर्म पूरा DMEM में गोली Resuspend. एक बाँझ 70 माइक्रोन नायलॉन जाल के माध्यम से फिल्टर कोशिकाओं. फ़िल्टर की कोशिकाओं को इकट्ठा और बर्फ में रहते हैं.
- जाल पर बनाए रखा सेल भागों लीजिए और आरटी पर 1-2 मिनट के लिए DMEM-collagenase/dispase (2 मिलीग्राम) के साथ आगे पचाने. आरटी पर 5 मिनट के लिए 800-1000 XG पर centrifugation के माध्यम से DMEM-DNase मैं में कोशिकाओं 3x धो लें. 3.5 चरण में एकत्र फ़िल्टर की कोशिकाओं के साथ इन कोशिकाओं पूल. पूरा DMEM के साथ एक बार कुल कोशिकाओं को धो लें. सेल नंबर और चुंबकीय लेबलिंग कदम का निर्धारण करने के लिए आगे बढ़ें. नोट: यह चुंबकीय लेबलिंग से पहले एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है.
4. चुंबकीय लेबलिंग
- इस प्रोटोकॉल 10 7 कोशिकाओं के चुंबकीय लेबलिंग से पता चलता है. सेल नंबर के लिए कम से कम 10 7, वही अभिकर्मक मात्रा का उपयोग करें और सेल नंबर के लिए अधिक से अधिक 10 7, सभी अभिकर्मक मात्रा और कुल मात्रा को पैमाने परतदनुसार (जैसे 2 10 x 7 कुल कोशिकाओं के लिए, सभी संकेत अभिकर्मकों की दो बार की मात्रा का उपयोग करें). बर्फ में सभी अभिकर्मकों और कोशिकाओं रखें.
- एक hemocytometer साथ सेल संख्या निर्धारित करते हैं.
- आरटी पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र. महाप्राण पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला.
- CD31 microbeads की 10 μl द्वारा पीछा सेल गोली शुद्धि बफर के 90 μl/10 7 कोशिकाओं जोड़ें. निर्माता द्वारा प्रदान microbeads विरोधी माउस CD31 एंटीबॉडी मोनोक्लोनल संयुग्मित रहे हैं.
- अच्छी तरह मिक्स और फ्रिज में 15 मिनट के लिए सेते हैं. नोट: चुंबकीय लेबलिंग के दौरान उच्च तापमान और / या लंबी ऊष्मायन समय अविशिष्ट बंधन में हो सकता है.
- 10 मिनट के लिए 300 XG पर शुद्धि बफर और अपकेंद्रित्र 1-2 ml/10 7 कोशिकाओं जोड़कर कोशिकाओं को धो लें. शुद्धि बफर के 500 μl में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं निकालें. चुंबकीय जुदाई या शुद्धि कदम आगे बढ़ना.
5. पुrification
- एमएसीएस विभाजक के चुंबकीय क्षेत्र में एमएस स्तंभ रखें.
- शुद्धि बफर के 500 μl के साथ स्तंभ कुल्ला.
- स्तंभ पर सेल निलंबन लागू करें. उच्च सेल नंबर स्तंभ रोकना कर सकते के रूप में एमएस स्तंभ के लिए कक्षों की उपयुक्त संख्या लोड. सावधानी: प्रत्येक एमएस स्तंभ अधिक स्तंभों का उपयोग, एक उच्च सेल नंबर के लिए 2 एक्स 10 7 कोशिकाओं की अधिकतम संख्या को समायोजित कर सकते हैं.
- लीजिए और unlabeled कोशिकाओं से युक्त प्रवाह के माध्यम से त्यागें.
- शुद्धि बफर के 500 μl तीन बार के साथ स्तंभ धो लें. धोने के दौरान, स्तंभ जलाशय बाद शुद्धि बफर aliquots जोड़ने से पहले खाली है बनाना.
- एमएसीएस विभाजक से स्तंभ निकालें और एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब पर जगह है.
- एक सवार एमएस स्तंभ के साथ आपूर्ति की है. पिपेट एमएस स्तंभ पर और तुरंत शुद्धि बफर के 1 मिलीलीटर मजबूती स्तंभ में सवार धक्का द्वारा चुंबकीय लेबल कोशिकाओं को बाहर निकलवाने.
- प्लेट सीईएलकोलेजन टाइप 1 के साथ precoated और 95% 2 हे और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस के लिए एक मशीन सेट में ECCM में कोशिकाओं को विकसित एक 35 मिमी संस्कृति डिश पर रास.
- हर चार दिनों मध्यम बदलें. डिश मिला हुआ है, जब 10-12 दिनों के बाद प्रयोगों या उपसंस्कृति के लिए PVECs का प्रयोग करें.
6. पी.वी. ईसीएस की उपसंस्कृति
- ECCM निकालें और बाँझ पीबीएस के 1-2 मिलीलीटर के साथ PVECS के monolayer कुल्ला.
- धीरे सेल monolayer कवर करने के लिए 0.25% trypsin EDTA समाधान के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें.
- इनक्यूबेटर पकवान लौटें. 5-7 मिनट के भीतर, कोशिकाओं पकवान की सतह से अलग होगा.
- कोशिकाओं को अलग कर लेने के बाद, तुरंत trypsin अवरोध करनेवाला के एक बराबर मात्रा जोड़ने और कई बार Triturate.
- एक बाँझ 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण. 5 मिनट के लिए 500 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और prewarmed ECCM के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend.
- संस्कृति, IM के विस्तार के लिए कोशिकाओं बीजउम्र बढ़ने या अन्य assays.
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Representative Results
सुबह 1-12 से PVECs की प्ररूपी लक्षण वर्णन चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी प्रकाश (चित्रा 2) के द्वारा दिखाया गया है. कोशिका विभाजन (2A चित्रा) के दिन 1 शो आकारिकी विशेषता पर पकवान से जुड़ी कोशिकाओं. 5-8 दिनों के बीच, पक्की सड़क पत्थर से PVECs संक्रमण endothelial कोशिकाओं और (आंकड़े 2 बी और 2 सी) ने अपने vivo में राज्य के सदृश के लिए विशिष्ट आकार का आकारिकी धुरी के. सुबह 12 से PVEC संस्कृति पूर्ण संगम (चित्रा 2 डी) प्राप्त होता है. PVECs कॉलोनी (आंकड़े 2 ई जी) का विस्तार करने के लिए आसानी से subcultured किया जा सकता है. Endothelial सेल संस्कृतियों की पवित्रता endothelial सेल मार्कर के साथ स्थापित किया गया था - Isolectin बी 4, CD-31/PECAM-1, वॉन Willebrand कारक (vWF) और VE cadherin और उपसंस्कृति (आंकड़े 2H कश्मीर) के बाद एक सौ प्रतिशत होने के लिए निर्धारित किया गया था.
PVECs के उच्च बढ़ाई छवियों CD1 भ्रूण के रूप में अच्छी तरह से तैयार टाई2-GFP भ्रूण 4 (जिसका endothelial कोशिकाओं व्यक्त GFP) (चित्रा 3) दिखाए जाते हैं. आम पत्थर और धुरी आकार morphologies (आंकड़े 3 ए सी) के अलावा, दुबला प्रक्रियाओं के साथ polygonal morphologies में भी मनाया गया isolectin B4 लेबल और Tie2-GFP + (आंकड़े 3 डी और 3E) PVECs लिया. (Matrigel की अनुपस्थिति में) हमारे कोलेजन लेपित संस्कृति बर्तन में से कुछ में, PVECs में विवो periventricular संवहनी नेटवर्क (चित्रा 3F) की अनूठी विशेषता जैसी जाली पैटर्न का गठन. इस PVECs की उच्च वाहिकाजनक क्षमता को दर्शाता है. एक angiogenesis परख PVECs (2 एक्स 10 4 कोशिकाओं) Matrigel मैट्रिक्स के साथ लेपित संस्कृति व्यंजन के लिए जोड़ा गया, जिसमें प्रदर्शन किया गया था. PVECs 18 घंटा (चित्रा 3 जी) के भीतर मजबूत ट्यूब गठन दिखाया. इन परिणामों से यह प्रणाली एक में इन विट्रो endothelial सेल मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि पुख्ता सबूत प्रदान करते हैं. पृथक PVECsCD1 भ्रूण से तेजी से जीवित कोशिकाओं के cytoplasm में तीव्र स्थिर प्रतिदीप्ति देने और प्रवास, गतिशीलता, आकृति विज्ञान, सेल समारोह assays के रूप में शामिल रहते PVECs के लंबे समय तक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि Qdot nanocrystals (चित्रा 3H) के साथ लेबल किया जा सकता है अच्छी तरह vivo में प्रयोगों के रूप में. PVECs सेल प्रकाश प्लाज्मा झिल्ली-आरएफपी, जीना सेल इमेजिंग प्रयोगों में सेल आकारिकी का स्पष्ट दृश्य के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार BacMam 2.0 (चित्रा 3I) की तरह सेल tracers साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है.
हम ECCM में, लेकिन यह भी चूहे के मस्तिष्क endothelial सेल मध्यम विकास (RBECGM) और DMEM F12 माध्यम में न केवल PVECs सुसंस्कृत. चरण विपरीत (आंकड़े -4 ए, 4C, और 4E) और isolectin B4 दोनों (आंकड़े -4 ए और 4 बी), RBECGM (आंकड़े 4C ECCM में सुसंस्कृत PVECs की (आंकड़े 4 बी, 4D, और 4F) छवियों और लेबल
चित्रा 1. PVEC अलगाव की योजनाबद्ध. अलगाव और पी के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉलभ्रूण telencephalon से PVECs की urification एक स्कीमा में संक्षेप. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. PVECs के प्ररूपी लक्षण वर्णन. (एजी) चढ़ाना के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर PVEC संस्कृति के चरण विपरीत छवियाँ. दिन 1 (क) PVEC संस्कृति. कोशिकाओं संलग्न और विभाजित morphologies दिखा दिया है. (बी) PVEC दिन 5 पर संस्कृति और आकार आकारिकी धुरी के पत्थर से सुबह 8 संक्रमण पर (सी). (डी) PVEC संस्कृति दिन 12 पर संगम प्राप्त कर ली. 1 दिन पर उपसंस्कृति के बाद (ई) PVECs, (एफ) दिन 5 (जी (एच), वॉन Willebrand कारक (आई), CD31/PECAM (जे) और VE-cadherin (कश्मीर): endothelial सेल मार्कर का उपयोग PVECs की (HJ) immunolabeling. स्केल सलाखों: ए, 100 माइक्रोन (बी.जे. लागू होता है), कश्मीर, 50 माइक्रोन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. के PVECs की morphologies. (एई) उच्च बढ़ाई छवियों isolectin B4 लेबल और Tie2-GFP + पतला लंबा एक्सटेंशन (डी, ई) के साथ पत्थर और धुरी आकार आकारिकी (एसी) के साथ ही polygonal आकारिकी दिखा PVECs लिया. (<मजबूत> एफ) PVECs भी Matrigel के अभाव में संस्कृति डिश में उच्च वाहिकाजनक क्षमता दिखा. (जी) PVECs Matrigel पर एक angiogenesis परख में मजबूत ट्यूब गठन दिखा. Qdot nanocrystals के साथ लेबल (एच) PVECs. सेल प्रकाश प्लाज्मा झिल्ली-आरएफपी, BacMam 2.0 के साथ ट्रांसफ़ेक्ट (आई) PVECs. स्केल सलाखों: एक, 50 माइक्रोन, बी, 15 माइक्रोन (सीई लागू होता है), एफ, 100 माइक्रोन (जी, एच लागू होता है), मैं, 50 माइक्रोन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 4. विभिन्न संस्कृति मीडिया शो संस्करण आकारिकी में उगाई PVECs. (
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Discussion
PVEC के अधिक physiologically प्रासंगिक neurovascular बातचीत पर ध्यान केंद्रित अध्ययन के लिए अन्य ऊतक स्रोतों से वयस्क मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं और ईसी की तुलना में कर रहे हैं और यह भी चिकित्सीय क्षमता है. PVEC तैयारी के लिए यह मृत कोशिकाओं CD31 microbeads को nonspecifically बाँध सकता है के बाद से एक अच्छा व्यवहार्यता को प्राप्त करने के लिए तेजी से काम करने के लिए विच्छेदन के साथ महत्वपूर्ण शुरुआत है. एकल कक्ष निलंबन से पहले चुंबकीय लेबलिंग कदम को हासिल नहीं है, तो सेल clumps स्तंभ रोकना होगा, क्योंकि इसके अलावा, इस समस्या निवारण में परिणाम होगा. इस पद्धति का एक लाभ यह चुंबकीय मोतियों से कोशिकाओं को अलग करने के लिए trypsin के साथ ऊष्मायन के लिए कोई ज़रूरत नहीं है, चुनाव आयोग की तैयारी 4,7 के लिए अन्य चुंबकीय मनका आधारित जुदाई तरीकों में प्रयुक्त एक समय लेने वाली और अक्सर कठिन कदम है कि वहाँ है. इसके अलावा, इस अलगाव तकनीक भ्रूण के मस्तिष्क के ऊतकों की बड़ी मात्रा की आवश्यकता नहीं है. PVEC की लगातार appr में एक ही समय पर गर्भवती माउस के उपयोग के साथ तैयार किया जा सकता हैoximately 12 दिन, subcultured, और इन विट्रो की एक विस्तृत विविधता में और vivo प्रयोगों में इस्तेमाल किया.
अलगाव के बाद PVECs की शुद्धता 90% से अधिक है लेकिन उपसंस्कृति के बाद PVECs की पवित्रता 100% है. Endothelial कोशिकाओं के अलावा, PECAM -1 monocytes / मैक्रोफेज की सतह पर पाया जाता है. प्रसव के बाद या वयस्क मस्तिष्क 8 की तुलना में जब microglia, सीएनएस के बृहतभक्षककोशिका आबादी हालांकि भ्रूण माउस मस्तिष्क में बहुत कम है. Monocytes / microglia 10% भ्रूण बछड़ा सीरम और विकसित करने के लिए विशिष्ट वृद्धि कारकों के साथ पूरक मध्यम जरूरत है, वे ECCM में अंततः बाहर मर जाएगा और PVECs की उपसंस्कृति के बाद पिछले नहीं होगा. 100% शुद्ध PVECs तुरंत अलगाव (उदाहरण के लिए, जीन अभिव्यक्ति का परीक्षण करने के बाद) की जरूरत है, हम (FACS) विधि छँटाई प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल का उपयोग करें. PVECs तो Tie2GFP भ्रूण से पृथक (जिसमें केवल endothelial कोशिकाओं व्यक्त GFP) और इसरो दोहरे FACS विश्लेषण के अनुसार क्रमबद्ध हैं. सॉर्ट किया गया endothelia की पवित्रताएल कोशिकाओं GFP और CD31/PECAM-1 6 डबल सकारात्मक रहे हैं कि कोशिकाओं के संग्रह से सुनिश्चित कर रहे हैं.
संस्कृति का भी बारीकी से pericytes जैसे प्रकार की कोशिकाओं contaminating के लिए अलगाव के प्रथम सप्ताह में मनाया जाता है. Pericyte कोशिकाओं अनियमित आकार के हैं और आकार का धुरा या कालोनियों के रूप में विकसित है कि polygonal, से संपर्क कोशिकाओं से मिलकर जो endothelial कोशिकाओं के विपरीत एक मिला हुआ monolayer फार्म कभी नहीं जाएगा, वे अगर वर्तमान पहचान करने के लिए आसान कर रहे हैं. Pericyte संदूषण पाया जाता है, trypsin (0.05%) की एक कम एकाग्रता (2-3 मिनट) PVECs की उपसंस्कृति के लिए प्रयोग किया जाता है एक त्वरित trypsinization प्रक्रिया द्वारा पीछा किया. Pericytes एक विस्तारित trypsinization समय (7-10 मिनट) की आवश्यकता होती है और संलग्न रहेगा. इसके अलावा, trypsinized pericytes की चढ़ाना दक्षता (यदि हो तो) बहुत गरीब है. ये कदम pericyte प्रदूषण को खत्म करने और subcultured PVECs शुद्ध कर रहे हैं कि सुनिश्चित करते हैं.
ECCM मध्यम hydrocortisone युक्त एक कम सीरम माध्यम है,हेपरिन और 2% भ्रूण गोजातीय सीरम और epidermal वृद्धि कारक (EGF) और endothelial सेल ग्रोथ अनुपूरक (ईसीजी) के साथ पूरक है. ECCM में उगाई PVECs लगातार धुरी के आकार आकृति विज्ञान दिखाया. चूहे के मस्तिष्क ECGM 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, वृद्धि कारक है, और VEGF होता है. इस मीडिया में उगाई PVECs बहुत लम्बी morphologies है और confluency प्राप्त करने के लिए लंबे समय तक ले. DMEM-F12 मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, GlutaMAX और endothelial सेल के विकास के पूरक के साथ पूरक और यह अन्य मीडिया की तुलना में अधिक प्रसार को प्रेरित करता है. इस मीडिया में उगाई PVECs 4 दिनों में बहुत तेजी से विकास और प्राप्त कर ली confluency से पता चला हालांकि, उनके morphologies फ्लैट या केवल polygonal थे. हम phenotype और समारोह के नुकसान के बिना अप करने के लिए तीन मार्ग के लिए ECCM में PVECs हो गए हैं. इसलिए, ECCM हम PVEC संस्कृति के लिए पसंद करते हैं कि मध्यम है.
इस प्रोटोकॉल द्वारा neuronal व्यापारियों के साथ cocultured PVECs पिता के लिए न्यूरोजेनेसिस और neuronal प्रवास को प्रोत्साहित करने की संभावना हैआर अधिक से अधिक वयस्क मस्तिष्क से या अन्य स्रोतों से endothelial कोशिकाओं से विस्तार और स्ट्रोक, घाव मस्तिष्क की चोट या neurodegeneration में स्नायविक समारोह की सहायता वसूली के लिए मूल्यवान हो सकता है. वयस्क मस्तिष्क में प्रत्यारोपित neuronal व्यापारियों अक्सर स्टाल और नए न्यूरॉन्स की आवश्यकता होती है क्षेत्रों में विस्थापित करने के लिए विफल करने के लिए सूचित किया गया है. इस समस्या रेडियल glial गाइड 9 तरह neuronal प्रवास की सुविधा है कि substrates के अभाव के लिए जिम्मेदार है. Vasculature तेजी neuronal प्रवास 6,10,11 के लिए substrates के रूप में सराहना की जा रही है. PVECs प्रत्यारोपण स्थलों पर इन ठप neuronal व्यापारियों के लिए एक समाधान की पेशकश कर सकते हैं. क्षतिग्रस्त मस्तिष्क क्षेत्रों में PVECs और न्यूरॉन्स के Coimplantation endothelial कोशिकाओं द्वारा न्यूरॉन्स की निर्देशित प्रवास की सुविधा और कार्यात्मक वसूली प्राप्त करने में मदद हो सकती है. पलायन न्यूरॉन्स के साथ endothelial कोशिकाओं के निकट सहयोग भी वृद्धि कारकों और morphogens सीधे और चुनिंदा में वितरित करने के लिए उन्हें विशिष्ट अनुकूल बनाता हैन्यूरॉन्स पलायन.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम एक प्रकार का पागलपन पर अनुसंधान के लिए नेशनल एलायंस और अवसाद (NARSAD) युवा अन्वेषक पुरस्कार और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान ए वी के लिए R01NS073635 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNase I | Sigma | D-4527 | |
| Collagen, Type 1 solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| DPBS | Quality Biologicals | 114057-131 | |
| EDTA | Fisher Scientific | M4055 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| CD31 microbeads | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| MACS separator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Bioscience | 352350 | |
| Antibiotic and antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| 35 mm Culture dish | BD Bioscience | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352097 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352098 | |
| ECCM kit | BD Bioscience | 355054 | Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF, and Soybean Trypsin Inhibitor |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| RBECGM | Cell Applications | R819-500 | |
| DMEM F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 305050-061 | |
| Tissue culture grade water | Life Technologies | 15230162 | |
| 0.25% Trypsin | Life Technologies | 15050 | |
| Soybean trypsin inhibitor | BD Bioscience | 5425 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Life Technologies | Q25021 | |
| CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| Biotinylated Isolectin B4 antibody | Sigma | L2140 | |
| Anti-Von Willebrand factor | Sigma | F3520 | |
| Anti-CD31/PECAM-1 | BD Pharmingen | 550274 | |
| VECTASHIELD Hardset Mounting Media with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Ketamine | Butler Schein Animal Health Supply | 44028 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 1009 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Inverted microscope | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| Fluorescent microscope | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| Fine forceps | Roboz Surgical Instrument | 7 inox | |
| Fine microtip scissors | Roboz Surgical Instrument | RS5611 |
References
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