Summary
En comparación con la cromatografía de afinidad tradicional utilizando columnas empaquetadas de cuentas de agarosa de proteína A, los adsorbentes de membrana de proteína A pueden acelerar significativamente el aislamiento a escala de laboratorio de anticuerpos y otras proteínas que expresan fragmentos de Fc. Los métodos apropiados de análisis y cuantificación pueden acelerar aún más el procesamiento de proteínas, lo que permite que el aislamiento / caracterización se complete en un día de trabajo, en lugar de más de 20 horas de trabajo.
Abstract
La purificación a escala de laboratorio a escala industrial de biomoléculas de sobrenadantes de cultivos celulares y soluciones celulares lisadas se puede lograr mediante cromatografía de afinidad. Mientras que la cromatografía de afinidad utilizando perlas de agarosa de proteína A porosa empaquetadas en columnas es posiblemente el método más común de aislamiento a escala de laboratorio de anticuerpos y proteínas recombinantes que expresan fragmentos de Fc de IgG, puede ser un proceso lento y costoso. Las limitaciones de tiempo y financieras son especialmente desalentadoras en pequeños laboratorios de ciencias básicas que deben recuperar cientos de microgramos a cantidades de miligramos de proteína de soluciones diluidas, pero carecen de acceso a sistemas de administración de líquidos de alta presión y / o personal con experiencia en bioseparaciones. Además, la cuantificación y caracterización del producto también puede alargar excesivamente el tiempo de procesamiento durante varios días de trabajo e inflar los gastos (consumibles, salarios, etc.). Por lo tanto, se necesita un protocolo rápido, económico pero efectivo para el aislamiento a escala de laboratorio y la caracterización de anticuerpos y otras proteínas que poseen un fragmento de Fc. Con este fin, hemos ideado un protocolo que puede ser completado por personal técnico de experiencia limitada en menos de 9 horas (aproximadamente un día de trabajo) y tan rápido como 4 horas, en comparación con los métodos tradicionales que exigen más de 20 horas de trabajo. La mayoría del equipo requerido está fácilmente disponible en los laboratorios estándar de ciencia biomédica, bioquímica e ingeniería (bio)química, y todos los reactivos están disponibles comercialmente. Para demostrar este protocolo, los resultados representativos se presentan en los cuales el galectin-1 murine quimérico fundido al Fc humano (Gal-1hFc) del sobrenadante del cultivo celular fue aislado usando un adsorber de la membrana de la proteína A. Gal-1hFc purificado fue cuantificado usando un procedimiento occidental apresurado del análisis que borraba y caracterizado usando cytometry de flujo. El flujo de trabajo optimizado puede modificarse para otras proteínas que expresan Fc, como los anticuerpos, y/o alterarse para incorporar métodos alternativos de cuantificación y caracterización.
Introduction
El aislamiento de anticuerpos y proteínas recombinantes que expresan fragmentos de inmunoglobulina G (IgG) Fc de sobrenadantes de cultivos celulares y soluciones celulares diluidas se puede lograr utilizando cromatografía de afinidad de proteínas A. En los laboratorios de ciencia básica e ingeniería y en la industria, las columnas empaquetadas con agarosa recubierta de proteína A porosa, vidrio o perlas poliméricas se utilizan más comúnmente para la cromatografía de afinidad, a pesar de los altos costos financieros y los largos tiempos de procesamiento1-3. Es muy apreciado que la cromatografía de afinidad representa el mayor gasto y cuello de botella de procesamiento tanto en entornos de laboratorio como industriales2,4. Como resultado, se han desarrollado numerosas mejoras para disminuir el costo y el tiempo de procesamiento sin sacrificar la recuperación general del producto del tren de proceso1,2,5-7. Particularmente prometedor para el aislamiento de anticuerpos y otras proteínas que expresan Fc es la cromatografía de afinidad utilizando un adsorbente de membrana de proteína A2,5,7-10. Mientras que la captura de Fc en cromatografía de columna está limitada por difusión (esdecir, la proteína que expresa Fc debe difundirse dentro y a través de los poros internos para alcanzar la mayoría de la proteína A) con alta caída de presión a través de la columna, el transporte de masa en los adsorbers de membrana es impulsado por la convección a granel, lo que resulta en la evitación de las limitaciones de difusión8,9,11,12. Además, la caída de presión a través del adsorbente de membrana es baja, lo que permite tasas de flujo de perfusión más rápidas en comparación con las columnas empaquetadas con perlas8,9,11,12. Por lo tanto, para el aislamiento a escala de laboratorio, se predice que la cromatografía de membrana reducirá el tiempo de aislamiento en varias horas y aumentará la captura del producto en comparación con la cromatografía de columna. Además, se han propuesto modelos matemáticos para la adsorción de IgG en adsorbentes de membrana8,9,11,12,permitiendo así a los usuarios finales predecir el rendimiento en el laboratorio.
Otro cuello de botella en los laboratorios de ciencia básica e ingeniería es la caracterización de la proteína que expresa Fc. Sin embargo, la selección de métodos apropiados para completar los ensayos de caracterización, como las manchas occidentales, puede reducir en gran medida el tiempo dedicado a las pruebas de productos. Por ejemplo, la transferencia de semisido en un sistema tampón discontinuo puede lograr la transferencia electroforética de proteínas de un gel SDS-PAGE a una membrana de polivinilo difluoridina (PVDF) en cuestión de minutos, en lugar de 1-2 horas en la transferencia del tanque (húmedo) en un sistema tampón continuo13.
Un protocolo rápido, barato, y eficaz para aislar y para caracterizar una proteína quimérica de la fusión que expresa un fragmento del Fc de IgG humano se describe adjunto. La mayoría de los equipos están fácilmente disponibles en los laboratorios estándar de ciencias biomédicas básicas, biología, química y (bio)ingeniería química, y todos los reactivos están disponibles comercialmente. Aunque se generaron resultados representativos a partir del aislamiento y caracterización de una proteína de fusión quimérica Murina Galectina-1/Humana Fc (Gal-1hFc), el protocolo simplificado se puede aplicar al aislamiento de otras moléculas que poseen un fragmento Fc, como anticuerpos, fragmentos Fc ellos mismos, u otras proteínas de fusión Fc. Nuestras mejoras disminuyeron drásticamente el tiempo de procesamiento (tan solo 4 horas, pero más típicamente ~ 9 horas, en comparación con más de 20 horas de trabajo) mientras lograba una recuperación del producto similar o mejorada en comparación con los métodos estándar.
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Protocol
1. Verificar la afinidad por la proteína A
- Verificar que la proteína que expresa Fc (proteína de fusión recombinante o anticuerpo IgG, hasta ahora denominada "proteína") tiene una afinidad aceptable por la proteína A14-17 antes de usar el adsorbente de membrana de la proteína A, y probar la presencia de la proteína en la solución madre (por ejemplo, sobrenadante de cultivo celular clarificado por centrifugación a 1.000 x g durante 5 min a células suspendidas de pellets). Utilice citometría de flujo, Western blotting, ELISA, etc. para detectar la función de la proteína y/o la presencia de Fc, en función de la preferencia del laboratorio. Idealmente, cuantificar la proteína en el sobrenadante de cultivo celular (paso 6) para evitar exceder la capacidad del adsorbente de membrana de la proteína A. Proceda si se detecta la proteína.
2. Preparar la proteína A adsorbente de membrana y sobrenadante de cultivo celular
- Siga las instrucciones del fabricante para preparar el adsorbente de membrana. Nunca deje que el aire entre en el adsorbente de membrana. Todas las soluciones perfundidas a través del adsorbente de membrana deben estar a temperatura ambiente y prefiltradas utilizando un filtro de 0,22 μm. Llene una jeringa de 10 ml con solución salina tamponada de fosfato (DPBS) de Dulbecco filtrada por 0,22 μm o tampón de burbujas de aire de elección y descarga. Perfundir DPBS para eliminar la solución de almacenamiento y equilibrar el adsorbente de membrana inmediatamente antes de su uso.
- Filtre el sobrenadante de cultivo celular inmediatamente antes de la perfusión a través del adsorbente de membrana, utilizando una unidad de filtración estéril de 0,22 μm impulsada por vacío.
3. Cargue el adsorbente de membrana de la proteína A
- Aspirar el sobrenadante de cultivo celular en una jeringa Luer Lock (30 ml o más) y descargar cualquier burbuja de aire.
- Montar materiales y equipos como se muestra en la Figura 1. Conecte la jeringa a la entrada del adsorbente de membrana. Conecte un tubo flexible a la salida del adsorbente de membrana. Si lo desea, coloque un filtro de jeringa de 0,22 μm entre la jeringa y el adsorbente de membrana. Use un matraz o botella para atrapar el flujo (también conocido como filtrado), del adsorbente.
- Ajuste la bomba de la jeringa a la velocidad de flujo volumétrica deseada, pero no exceda la tasa de flujo recomendada por el fabricante(por ejemplo, 10 ml / min). Perfundir el sobrenadante de cultivo celular a través del adsorbente de membrana, recogiendo el flujo a través de un castor u otro recipiente. Vuelva a cargar la jeringa con los sobrenadantes necesarios.
- Si lo desea, pruebe el flujo a través de la presencia de proteína utilizando citometría de flujo, Western blotting, ELISA, etc. basado en la preferencia del laboratorio. Por lo general, no es necesario volver a dispersar el flujo a través de.
4. Proteína Elute del adsorbente de membrana
- Lave el adsorbente de membrana con 10 ml de DPBS para eliminar cualquier proteína no ligada.
- Proteína elute del adsorbente de membrana al caudal deseado(por ejemplo, 1 ml/min) utilizando 10-15 ml de tampón de elución(por ejemplo, tampón de elución a base de aminas (pH 2.8)). Atrapar eluido en un tubo que contenga tampón neutralizante(por ejemplo, 1 M Tris (pH 9,4)) al 10% del volumen de elución (1,0-1,5 ml).
- Alternativamente, la proteína elute en un ml se incrementa en tubos que contienen 100 μl de tampón de neutralización, utilizando un volumen total de 10-15 ml de tampón de elución. Utilice el método de caracterización preferido para probar cada fracción para la presencia de proteína.
- Regenerar el adsorbente de membrana de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Perfundir 10 ml de DPBS filtrados a 0,22 μm o tampón de su elección, luego 10 ml de NaOH de 0,22 μm filtrados a 50 mM en 1 N NaCl, y finalmente 10 ml de DPBS filtrados a 0,22 μm. Llene el adsorbente de membrana con etanol al 20% en DPBS para su almacenamiento a largo plazo a 4 ºC.
5. Concéntrese y descongele la proteína
- Depositar todos los eluos (o fracciones de elución que contengan proteínas según lo determinado en el paso 4.3) en una unidad de filtro centrífugo de corte de peso molecular de 10 kDa. Siga las instrucciones del fabricante para la centrifugación.
- Dializar el retentado en una unidad de diálisis de pequeño volumen (corte de peso molecular de 10 kDa) contra el tampón de elección, siguiendo las instrucciones del fabricante. Es posible que sea necesario agregar un tampón al material dializado si la precipitación de proteínas es una preocupación. Si se desea, el material dializado se puede refrigerar hasta que se pueda realizar el paso 6, pero no se recomienda el almacenamiento a largo plazo sin conservantes.
6. Cuantificar y caracterizar el producto purificado en un procedimiento de western blotting acelerado
- Resolver los estándares de proteínas purificadas y Fc en el gel de elección por SDS-PAGE, en condiciones reductoras o no reductoras como se desee18-20. Utilice un mini gel en lugar de gel midi para minimizar el tiempo de ejecución.
- Si aún no se conoce, determine el rango de estándares Fc en qué banda la señal varía linealmente con respecto a la cantidad de carga(por ejemplo, 0,1-1 mg). Use el mismo gel, condiciones de funcionamiento, condiciones de transferencia y reactivos que se utilizarán para cuantificar y caracterizar la proteína purificada.
- Cargue múltiples cantidades de muestras de proteína purificada, incluidas las muestras diluidas con DPBS, para asegurarse de que las señales de banda de proteína purificada estén dentro del rango de señal lineal de los estándares Fc en el análisis de imágenes.
- Transfiera proteínas del gel a una membrana de fluoruro de polivinidideno (PVDF) en un sistema tampón discontinuo utilizando un blottersemidry 13,siguiendo las instrucciones del fabricante del blotter. El tiempo de transferencia es típicamente de 5-10 min. Si se desea, Coomassie manchar el gel después de la transferencia para verificar la eficiencia de la transferencia21.
- Realizar inmunoblotting con anti-Fc o anti-IgG conjugado con fosfatasa alcalina (AP) o peroxidasa de rábano de caballo (HRP), basado en la preferencia de laboratorio, utilizando un sistema de detección de proteínas asistidas por vacío. El tiempo de immunoblotting es típicamente menos de 1 hora.
- Desarrollar immunoblot utilizando el sustrato y el método de elección(por ejemplo, sustrato AP y quimioluminiscencia mejorada).
- Cuantifique la proteína purificada por análisis de imagen. Realice una regresión lineal en las señales de banda de los estándares Fc. SiR2>0,90, utilice la ecuación de la línea para calcular la cantidad de proteínas a partir de sus señales de banda. Tenga en cuenta la dilución de la muestra si es necesario. Dado que la cuantificación de la proteína se realiza sobre la base de Fc, ajuste el valor para las diferencias de peso molecular entre la proteína y Fc. SiR2<0,90, repita el paso 6 en su totalidad.
- Validar la proteína utilizando ensayos funcionales o métodos para detectar Fc a través de citometría de flujo, Western blotting, ELISA, etc. basado en la preferencia del laboratorio.
- Diluya la proteína a la concentración deseada y/o agregue los conservantes o estabilizadores deseados a la solución de proteína purificada antes de alícuota para su almacenamiento a largo plazo, congelado o de otro tipo.
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Representative Results
El protocolo simplificado para el aislamiento y la caracterización de las proteínas que expresan Fc se utiliza rutinariamente para procesar la galectina murina quimérica-1 fusionada a Fc humano (Gal-1hFc) a partir de sobrenadantes de cultivo celular diluidos. El diagrama de flujo de la figura 2 ilustra el flujo de trabajo y la hora de cada paso del protocolo. Para un lote típico de 300 ml de sobrenadante, el tiempo total de procesamiento es de aproximadamente 9 horas cuando se realiza la prueba opcional de citometría de flujo de fracciones de elución. Si se omite todo el análisis de citometría de flujo, debido a la falta de un citómetro de flujo o preferencia de laboratorio individual, el tiempo total de procesamiento puede ser tan breve como 4 horas. En general, el tiempo de procesamiento depende de la experiencia del operador, la cantidad de sobrenadante procesado y los métodos de cuantificación y caracterización que se realizan.
Cytometry de flujo fue utilizado para probar para la presencia de Gal-1hFc funcional(es decir Gal-1 capaz de detectar sus ligands en células del cáncer de seno) en el sobrenadante inicial del cultivo celular; el medio de cultivo celular fresco sirvió como control negativo18,22. Una vez verificado el Gal-1hFc en el sobrenadante del cultivo celular (Figura 3A), la carga del adsorbente de membrana de la proteína A se logró mediante perfusión sobrenadante a 10 ml/min (resultando en velocidad superficial o flujo volumétrico de 0,5 cm/min en un adsorber de membrana de 2 ml) utilizando una bomba de jeringa(Figura 1). El adsorbente de membrana capturó y retuvo eficientemente Gal-1hFc, dejando el flujo a través esencialmente agotado de Gal-1hFc (falta de avance, Figura 3A). Gal-1hFc se elujo del adsorbente de membrana en incrementos de un mililitro a 1 ml/min (flujo volumétrico = 0,05 cm/min) utilizando un tampón ácido a base de aminas (pH 2,8), y posteriormente se probaron fracciones de elución neutralizadas para detectar la presencia de Gal-1hFc funcional mediante citometría de flujo(Figura 3B). La señal de Gal-1hFc aumentó secuencialmente de la elución 1 (aproximadamente igual al control negativo) a un máximo en la elución 3, luego disminuyó a un nivel casi constante en las eluciones 9 y 10 (Figuras 3B y 3C). La elución final 10 no alcanzó equivalencia con la señal de control negativa debido a cierta retención del adsorbente de Gal-1hFc (Figuras 3B y 3C). Sin embargo, esta pérdida se consideró aceptable. Como método alternativo para probar la presencia, pero no la función, de Gal-1hFc en varias soluciones, se puede utilizar el análisis de citometría de flujo de la capacidad de Gal-1hFc para unirse a las perlas de poliestireno de la proteína A (a través del reconocimiento de la región hFc) (Figura 3D).
Después de la prueba de la fracción de elución, Gal-1hFc-positivo eluciones 2 a 10 fueron concentrados y luego dializado contra DPBS para obtener Gal-1hFc purificado en el almacenador intermediario deseado. La cuantificación y la caracterización del Gal-1hFc purificado fueron realizadas en un procedimiento que borraba occidental acelerado por la transferencia del semidry y el immunoblotting vacío-asistido. Al comparar la señal gal-1hFc con los estándares de cuantificación hFc, se determinaron tanto la cantidad como la calidad del material purificado (Figuras 4A-C). Las intensidades de señal de las bandas estándar de hFc (una banda a ~25 kDa cada una en la Figura 4A,carriles 1-5) estaban linealmente relacionadas con la cantidad de hFc presente(Figura 4C). Gal-1hFc (una banda a ~ 40 kDa en la Figura 4A,carril 6) y Gal-1hFc degradado (una banda a ~ 40 kDa y una banda a ~ 25 kDa en la Figura 4A,carril 7) las señales estaban dentro del rango estándar(Figura 4A,carriles 1-5). Se determinó que la concentración de Gal-1hFc purificado(Figura 4A,carril 6) sobre la base de hFc era de 450 μg/ml por procesamiento de imágenes(Figura 4C). Ajustando según el peso molecular de Gal-1hFc, la concentración del material purificado era 720 g/ml. En contraste, se cargó demasiado Gal-1hFc purificado en los carriles 6 y 7 del Western en la Figura 4B,lo que generó señales que saturaron o excedieron el rango de estándares hFc, evitando así la cuantificación. Alternativa a western blotting, Coomassie gel tinción21 puede servir como un control de calidad rápido y / o método de cuantificación (Figura 4D). Tenga en cuenta que una banda ~ 10 kDa, además de las bandas ~ 25 kDa y ~ 40 kDa, estaba presente en la muestra de Gal-1hFc degradada(Figura 4D,carril 2). Esta banda de Gal-1hFc está degradada y que no fue reactiva con el anticuerpo de detección utilizado en las manchas occidentales(Figuras 4A y 4B).
Después de la cuantificación y caracterización final de la Gal-1hFc purificada, se añadió BSA estéril para lograr una concentración final de BSA de 0.5%. El material purificado se alícuota y se almacena a -20 ºC. Además de Gal-1hFc, hemos utilizado este protocolo simplificado para aislar el doble mutante Gal-1hFc y Gal-7hFc. También se puede extender a prácticamente cualquier molécula que posea un fragmento fc (anticuerpos, fragmentos Fc propios, otras proteínas de fusión Fc, etc.de especies e isotipos que tengan afinidad por la proteína A14-17).
Figura 1. Esquema del aparato experimental. Los anticuerpos y las proteínas de fusión recombinantes que expresan fragmentos fc de IgG se pueden aislar de soluciones diluidas utilizando un adsorbente de membrana de proteína A. El adsorbente de membrana se conecta a través de un accesorio de bloqueo Luer a una jeringa de 30 ml en una bomba de jeringa, que perfunde la solución que contiene proteínas a través del adsorbente de membrana a una velocidad de flujo volumétrica deseada.
Figura 2. Flujo de trabajo de proceso para el aislamiento de Gal-1hFc del sobrenadante de cultivo celular. Este diagrama de flujo ilustra el protocolo para el aislamiento y la caracterización de una proteína de fusión murina quimérica galectina-1/humana que expresa Fc (Gal-1hFc) del sobrenadante del cultivo celular. En general, el tiempo de procesamiento variará dependiendo de la experiencia del operador, la cantidad de sobrenadante procesado y los métodos de cuantificación y caracterización que se utilicen.
Figura 3. Análisis de citometría de flujo de soluciones que contienen Gal-1hFc. Cytometry de flujo se utiliza para evaluar si Gal-1hFc funcional está presente en medio de cultivo celular fresco, sobrenadante de cultivo celular, flujo de adsorbente de membrana a través de, y fracciones de elución. F APC-conjugado (ab') 2 Fc anti-humano fue utilizado como el anticuerpo secundario. Todos los datos se adquirieron utilizando un citómetro/clasificador de flujo de productos de investigación de pedidos especiales facs Aria y se analizaron utilizando el software FlowJo. Los marcadores en cada histograma representan el 2% de la población de control negativo(es decir, el medio de cultivo celular fresco para (A) y el isotipo hFc para (B)). (A) Superposición del histograma de citometría de flujo de las células de cáncer de mama BT-20 etiquetadas con medio de cultivo celular fresco (rojo), sobrenadante de cultivo celular (azul) o flujo de adsorbente de membrana (verde). El sobrenadante del cultivo celular contuvo un de bajo nivel de Gal-1hFc funcional que atado con éxito a los ligands galectin-1 en las células BT-20, mientras que el medio fresco del cultivo celular y el flujo del adsorbente de la membrana a través de gal-1hFc careció, como se esperaba. (B) Histogramas de citometría de flujo de células BT-20 etiquetadas con fracciones de elución del adsorbente de membrana. La señal de Gal-1hFc en las células BT-20 aumenta secuencialmente a un máximo en la elución 4 y luego disminuye, aunque no al nivel de fondo(es decir, señal equivalente al medio de cultivo celular fresco). (C) Las intensidades medias de fluorescencia de las muestras en (B) también se pueden trazar en función del número de fracción de elución para generar una curva de elución. La intensidad media de fluorescencia de las células etiquetadas con el control de isotipo hFc se muestra como una línea de referencia. (D) Alternativamente, el análisis de citometría de flujo de Gal-1hFc unido a las perlas de poliestireno de la proteína A se puede utilizar para probar la presencia de proteínas, pero no la función, en varias soluciones. F APC-conjugado (ab') 2 Fc anti-humano fue utilizado como el anticuerpo secundario. Izquierda: Superposición de histograma de citometría de flujo de medio de cultivo celular fresco (rojo), sobrenadante de cultivo celular (azul) y muestra de búfer en blanco (verde). Medio: Histograma del control de isotipo hFc. La incubación con 10 mg/ml de hFc es un control positivo para la captura de la proteína A. Panel derecho: Histograma de perlas de proteína A incubadas con Gal-1hFc purificado, sobre la base de 10 mg hFc/ml. Haga clic aquí para ver una imagen más grande.
Figura 4. Cuantificación y caracterización de Gal-1hFc utilizando Western blotting y análisis de imágenes. (A) Los carriles 1-5 son estándares hFc de 0.1-0.5 μg en incrementos de 0.1 μg, y los carriles 6 y 7 son Gal-1hFc purificados de dos lotes de producción diferentes. Las muestras se resolvieron en un gel TGX al 4-15% por SDS-PAGE en condiciones de reducción, luego se transfirieron a la membrana de PVDF utilizando condiciones de transferencia discontinuas. La membrana fue bloqueada e incubada con anti-hIgG-AP usando una técnica immunoblotting vacío-asistida. Las señales se desarrollaron con reactivo ECL y se visualizaron en un captador de imágenes Bio-Rad ChemiDoc XRS. Las señales para los estándares hFc en los carriles 1-5 variaron linealmente (graficadas en (C)), y las señales para las dos muestras purificadas de Gal-1hFc en los carriles 6 y 7 estaban dentro del rango de medición lineal. El carril 7 muestra dos bandas, Gal-1hFc y presumiblemente el fragmento de hFc, lo que indica la degradación de la proteína. (B) Si se carga demasiado Gal-1hFc purificado, la señal puede saturar o exceder el rango de señal lineal, evitando la cuantificación (carriles 6 y 7). Los carriles, el gel y las condiciones de funcionamiento son los mismos que en (A). (C) El software de análisis Image Lab permite la entrada de cantidades absolutas conocidas de estándares hFc de un immunoblot, luego determina la cantidad de la(s) banda(s) desconocida(s) a través de su señal en relación con la regresión lineal de los estándares (y = 1.36 x10 -7*x + 0.105; R2 = 0,95). Los datos mostrados son del análisis del immunoblot en (A). (D) La calidad del Gal-1hFc purificado se puede evaluar utilizando la tinción de Coomassie. El carril M es un marcador de peso molecular, el carril 1 es gal-1hFc purificado (misma muestra que el carril 6 en (A) y (B)), el carril 2 se degrada Gal-1hFc (misma muestra que el carril 7 en (A) y (B)), y el carril 3 es 0.2 mg hFc estándar. El gel y las condiciones de funcionamiento eran los mismos que en (A) y (B). Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
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Discussion
El protocolo descrito en este documento fue desarrollado para aislar y caracterizar rápidamente una proteína quimérica de fusión que expresa fc humano (Gal-1hFc), sin comprometer significativamente la recuperación del producto o inflar el costo. Los componentes clave del flujo de trabajo optimizado son un adsorbente de membrana de proteína A para el aislamiento, y la transferencia de semisel y el inmunoblotting asistido por vacío para la caracterización por western blotting.
La disminución dramática en el tiempo de procesamiento para el aislamiento y la caracterización de Gal-1hFc a partir de 300 ml de sobrenadante de cultivo celular (aproximadamente 9 horas en el protocolo simplificado en comparación con más de 20 horas en un protocolo tradicional) es en gran parte atribuible a la incorporación de los componentes clave antes mencionados, particularmente el adsorbente de membrana. Con el caudal máximo recomendado de 10 ml sobrenadante/min, la carga del adsorbente de membrana se puede completar en 30 min. La recuperación de Gal-1hFc de los adsorbentes de la membrana de la proteína A se extiende típicamente a partir de la 10-30% en nuestros laboratorios, con la recuperación del ~30% alcanzada rutinario por el personal experimentado del laboratorio cuando las concentraciones deGal-1hFc en el sobrenadante del cultivo celular son 5-10 mg/ml. A lo sumo, se ha logrado una recuperación de ~ 50%. La recuperación completa del producto es prácticamente imposible debido a las pérdidas inherentes debido a (a) la retención específica de la proteína que expresa Fc por la proteína A en el adsorbente de membrana(Figuras 3B y 3C)y (b) la adsorción superficial inespecífica de la proteína durante todo el aislamiento. Es importante que los laboratorios individuales determinen si la recuperación del producto con un adsorbente de membrana es aceptable en función de sus necesidades; si alterar el caudal de carga o el contenido de materia prima(por ejemplo, el sobrenadante de cultivo de células proteicas deseadas, que puede ser particularmente difícil) puede mejorar la recuperación del producto8,o si la modificación del protocolo de elución (paso 4) para obtener una mayor recuperación vale la pena el aumento del tiempo, el gasto y el esfuerzo, o el posible daño al propio adsorbente de proteína o membrana (principalmente por el pH del tampón de elución, la concentración de sal, etc.). En contraste con el uso del adsorbente de membrana, se tarda aproximadamente 10 horas en realizar dos ciclos de perfusión a través de una columna18llena de perlas de proteína A de 1 ml al caudal máximo tolerable de 1 ml/min, y solo se recupera típicamente 10-20% gal-1hFc. Como preocupación final, un análisis de costos para las perlas de proteína A de diferentes fabricantes puede afectar la decisión de utilizar una columna estándar empaquetada en cuentas frente a un adsorber de membrana única. Teniendo en cuenta todos estos factores, el uso de un adsorbente de membrana para el aislamiento a escala de laboratorio de proteínas que expresan Fc puede ofrecer a los laboratorios pequeños ventajas significativas sobre la cromatografía de columna2,5,8,10.
El uso de un mini gel para SDS-PAGE, la transferencia electroforética discontinua de semisel de proteínas del gel a la membrana de PVDF y el inmunoblotting asistido por vacío ofrecen ahorros de tiempo significativos en comparación con los geles midi, la transferencia de tanques (húmedos) y la inmunotensión basada en difusión para la cuantificación y caracterización de Gal-1hFc (2 horas frente a 8 horas). Los laboratorios individuales deben determinar si el protocolo occidental acelerado es apropiado para la cuantificación y caracterización de su proteína. Los beneficios incluyen (a) poco tiempo hasta su finalización incluso por personal de laboratorio sin experiencia, (b) capacidad para determinar si la proteína está intacta o se ha degradado debido al procesamiento o la contaminación(Figura 4B),y (c) facilidad relativa de cuantificación por programas de procesamiento de imágenes(Figura 4C). Sin embargo, (a) el aumento de los costos de reactivos y consumibles puede ser inaceptable a pesar de la compensación de tiempo para los salarios, (b) la cuantificación tradicional de proteínas por A280, ELISA, el ensayo de Bradford o el ensayo de BCA puede ser preferible23-27,o (c) los laboratorios pueden no tener acceso a un blotter de semidry o un sistema de detección de proteínas asistidas por vacío para immunoblotting. En tales casos, la tinción de Coomassie de sds-page resueltas proteínas21(Figura 4D) o punto o ranura de borrado28 son buenas alternativas.
La citometría de flujo se utilizó en tres pruebas separadas de 90 min para la detección de Gal-1hFc funcional en este protocolo simplificado(Figura 2),que es el mismo que en el procesamiento tradicional18,22. Cualquier otro método de caracterización como Western blotting o ELISA también sería aceptable. Los ensayos funcionales son óptimos(por ejemplo, detección de ligandos de galectina-1 en células de cáncer de mama, Figuras 3A-C). Alternativamente, la detección de la unidad Fc sería aceptable (similar a la Figura 3D),pero la retención de la función específica de la proteína no se puede determinar de esta manera, lo que es un inconveniente potencialmente significativo.
Los métodos descritos en este documento se han utilizado para el aislamiento rápido a escala de laboratorio y la caracterización de una proteína de fusión quimérica que expresa Fc humano (Gal-1hFc). Este flujo de trabajo optimizado se puede aplicar al aislamiento de prácticamente cualquier molécula que posea un fragmento fc (anticuerpos IgG, otras proteínas de fusión Fc, fragmentos Fc en sí mismos, etc.)y se puede modificar fácilmente en función de las preferencias individuales del laboratorio. Además, este protocolo es relativamente rápido y fácil, incluso para personal de laboratorio con experiencia limitada o completamente inexperto, lo que lo hace adecuado para su uso en biología, química y cursos de ingeniería (bio)química de la escuela secundaria o la universidad que cubren los principios de aislamiento y caracterización de proteínas.
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Disclosures
No hay nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean dar las gracias al Sr. Luis F. Delgadillo (Departamento de Ingeniería Química y Biomolecular, Universidad de Ohio), al Sr. Matthew H. Williams (Departamento de Ingeniería Química y Biomolecular, Universidad de Ohio) y al Dr. Filiberto Cedeno-Laurent (Brigham and Women's Hospital y Harvard Medical School) por su asistencia técnica experta. Los autores también desean agradecer a los estudiantes de invierno de 2011 CHE 404/BME 504 y otoño de 2012 CHE 4830/BME 5830 (Departamento de Ingeniería Química y Biomolecular y Programa de Ingeniería Biomédica, Universidad de Ohio) por su asesoramiento técnico y discusión. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias (NSF) Mayor Instrumentación de Investigación CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Dermatology Foundation Research Grant A050422 (SRB), Institutos Nacionales de Salud (NIH) NCI subvención 1R15CA161830-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Beca Postdoctoral F32CA144219-01A1 (SRB), NIH / NCI R01CA173610 (CJD), y NIH NCCAM subvención R01AT004628 (CJD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml) | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12--A | |
| Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml | Millipore | UFC801008 | Use 15 ml volume if needed |
| Sterile vacuum filter unit, 0.22 µm, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| 10 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 301604 | |
| 30 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 309650 | |
| Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft) | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
| Snap i.d. antibody collection tray | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap i.d. single well blot holder | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| Elution buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris, ultra pure | Fisher Scientific | 819623 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS with Ca2+/Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Human Fc | Bethyl Research Laboratories | P80-104 | |
| Anti-human Fc-APC | Jackson Immunoresearch | 109136170 | |
| Anti-human Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| Alkaline phosphatase substrate | Promega | S3841 | |
| Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene) | BD | 352054 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 55-2226 | A peristaltic pump is also acceptable |
| Protein gel electrophoresis system | Bio-Rad Laboratories | 552BR094876 | Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest |
| Semidry blotter | Bio-Rad Laboratories | 690BR006163 | Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest |
| SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system | EMD Millipore | WBAVDBASE | An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well |
References
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