Summary
Jämfört med traditionell affinitetskromatografi med protein A agarose pärlförpackade kolonner, protein A membran adsorberare kan avsevärt påskynda laboratorieskala isolering av antikroppar och andra Fc fragment-uttrycker proteiner. Lämpliga analys- och kvantifieringsmetoder kan ytterligare påskynda proteinbearbetningen, vilket gör att isolering/karakterisering kan slutföras på en arbetsdag, istället för 20+ arbetstimmar.
Abstract
Laboratorieskala till industriell rening av biomolekyler från cellkulturella supernatanter och lysade celllösningar kan åstadkommas med hjälp av affinitetskromatografi. Medan affinitetskromatografi med poröst protein A agarose pärlor packade i kolumner är utan tvekan den vanligaste metoden för laboratorieskala isolering av antikroppar och rekombinanta proteiner som uttrycker Fc fragment av IgG, det kan vara en tidskrävande och dyr process. Tid och ekonomiska begränsningar är särskilt skrämmande i små grundläggande vetenskapslaboratorier som måste återvinna hundratals mikrogram till milligram mängder protein från utspädda lösningar, men ändå saknar tillgång till vätskeleveranssystem med högt tryck och / eller personal med expertis inom bioseparationer. Dessutom kan produktk kvantifiering och karakterisering också förlänga bearbetningstiden alltför mycket under flera arbetsdagar och blåsa upp utgifter (förbrukningsvaror, löner etc.). Därför behövs ett snabbt, billigt men ändå effektivt protokoll för isolering av laboratorieskala och karakterisering av antikroppar och andra proteiner som har ett Fc-fragment. För detta ändamål har vi utarbetat ett protokoll som kan slutföras av teknisk personal med begränsad erfarenhet på mindre än 9 timmar (ungefär en arbetsdag) och så snabbt som 4 timmar, i motsats till traditionella metoder som kräver 20+ arbetstimmar. De flesta nödvändiga utrustningar är lätt tillgängliga i standard biomedicinsk vetenskap, biokemi och (bio)kemitekniska laboratorier, och alla reagenser är kommersiellt tillgängliga. För att visa detta protokoll presenteras representativa resultat där chimeric murin galectin-1 smält till mänskliga Fc (Gal-1hFc) från cellkulturen supernatant isolerades med hjälp av ett protein A membran adsorber. Renad Gal-1hFc kvantifierades med hjälp av en påskyndad western blotting analys förfarande och kännetecknas med hjälp av flöde cytometri. Det strömlinjeformade arbetsflödet kan ändras för andra Fc-uttrycksproteiner, till exempel antikroppar, och/eller ändras för att införliva alternativa kvantifierings- och karakteriseringsmetoder.
Introduction
Isolering av antikroppar och rekombinanta proteiner som uttrycker immunglobulin G (IgG) Fc fragment från cellkultur supernatants och utspädda lysed celllösningar kan åstadkommas med protein A affinitet kromatografi. I grundläggande vetenskap och ingenjörslaboratorier och industri används kolumner fyllda med poröst protein A-belagd agarosa, glas eller polymera pärlor oftast för affinitetskromatografi, trots höga ekonomiska kostnader och långa bearbetningstider1-3. Det är uppskattat att affinitetskromatografi representerar den största utgifts- och bearbetningsflaskhalsen i både labb- ochindustrimiljöer 2,4. Som ett resultat har många förbättringar utvecklats för att minska kostnaderna och bearbetningstiden utan att offra den totala produktåtervinningen frånprocesståget 1,2,5-7. Särskilt lovande för isolering av antikroppar och andra Fc-uttryckande proteiner är affinitetskromatografi med hjälp av ett protein A membran adsorber2,5,7-10. Medan Fc-fångst i kolumnkromatografi ärdiffusionsbegränsad ( dvs. det Fc-uttrycksproteinet måste spridas till och genom inre porer för att nå majoriteten av proteinet A) med högt tryckfall över kolonnen, drivs masstransporten i membran adsorbatorer av bulkkonvektion, vilket resulterar i undvikande av diffusionsbegränsningar8,9,11,12. Dessutom är tryckfallet över membranets adsorber lågt, vilket möjliggör snabbare perfusionsflöden jämfört med pärlpackadekolumner 8,9,11,12. För isolering av laboratorieskalan förutspås membrankromatografin minska isoleringstiden med flera timmar och öka produktinfångningen jämfört med kolumnkromatografi. Dessutom har matematiska modeller för IgG-adsorption i membran adsorbatorerföreslagits 8,9,11,12, vilket gör det möjligt för slutanvändare att förutsäga prestanda i labbet.
En annan flaskhals i grundläggande vetenskap och tekniska laboratorier är karakteriseringen av det Fc-uttryckande proteinet. Val av lämpliga metoder för att slutföra karakteriseringsanalyser, såsom västerländska uppblåsthet, kan dock kraftigt minska tiden som spenderas på produkttestning. Till exempel kan halvdry överföring i ett diskontinuerligt buffertsystem åstadkomma elektroforesisk överföring av proteiner från en SDS-PAGE gel till ett polyvinyldifluoridin (PVDF) membran på några minuter, i motsats till 1-2 timmars i tank (våt) överföring i ett kontinuerligt buffertsystem13.
Ett snabbt, billigt och effektivt protokoll för att isolera och karakterisera ett chimeriskt fusionsprotein som uttrycker ett Fc-fragment av mänsklig IgG beskrivs häri. De flesta utrustningar är lätt tillgängliga i grundläggande biomedicinsk standardvetenskap, biologi, kemi och (bio)kemitekniska laboratorier, och alla reagenser är kommersiellt tillgängliga. Även om representativa resultat genererades från isolering och karakterisering av en murin galectin-1/human Fc chimeric fusion protein (Gal-1hFc), kan det strömlinjeformade protokollet tillämpas på isolering av andra molekyler som har ett Fc fragment, såsom antikroppar, Fc fragment själva, eller andra Fc fusion proteiner. Våra förbättringar minskade dramatiskt bearbetningstiden (så få som 4 timmar men mer typiskt ~ 9 timmar, jämfört med 20 + arbetstimmar) samtidigt som vi uppnådde liknande eller förbättrad produktåterställning jämfört med standardmetoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Verifiera affiniteten för protein A
- Kontrollera att fc-uttryckande protein (rekombinant fusionsprotein eller IgG-antikropp, hittills kallat "protein") har godtagbar affinitet för protein A14-17 innan proteinet A-membran adsorber används, och testa för närvaron av proteinet i stamlösningen(t.ex. cellkultur övernaturlig klargjord med centrifugering vid 1 000 x g för 5 min till pellets suspenderade celler). Använd flödescytometri, western blotting, ELISA, etc. för att upptäcka proteinfunktion och/eller närvaro av Fc, baserat på labbpreferenser. Kvantifiera helst proteinet i cellkulturens supernatant (steg 6) för att undvika att överskrida protein A-membran adsorberkapaciteten. Fortsätt om protein upptäcks.
2. Förbered protein A membran adsorber och cellkultur supernatant
- Följ tillverkarens instruktioner för att förbereda membran adsorbern. Låt aldrig luft komma in i membran adsorbern. Alla lösningar som genomsyras genom membran adsorbern ska vara i rumstemperatur och förfiltreras med ett 0,22 μm filter. Fyll en 10 ml spruta med 0,22 μm-filtrerade Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) eller valfri buffert och utsläppsluftbubblor. Läs igenom DPBS för att ta bort lagringslösningen och för att balansera membran adsorbern omedelbart före användning.
- Filtrera cellkulturens supernatant omedelbart före perfusion genom membran adsorbern med hjälp av en vakuumdriven steril filtreringsenhet på 0,22 μm.
3. Ladda proteinet A membran adsorber
- Aspirera cellkulturens supernatant i en Luer Lock-spruta (30 ml eller större) och ladda ur eventuella luftbubblor.
- Montera material och utrustning enligt figur 1. Anslut sprutan till inloppet till membran adsorbern. Fäst flexibla slangar på membran adsorberuttaget. Om så önskas, placera ett 0,22 μm sprutfilter mellan sprutan och membran adsorbern. Använd en kolv eller flaska för att fånga igenom flödet (även kallat filtrate), från adsorbern.
- Ställ in sprutpumpen på önskat volymetriskt flöde, men överskrid inte tillverkarens rekommenderade flöde(t.ex. 10 ml/min). Granska cellkulturens supernatant genom membran adsorbern och samla flöde genom i en bägare eller annan behållare. Ladda om sprutan med supernatanter som behövs.
- Om så önskas, testa flödet för förekomst av protein med hjälp av flödescytometri, western blotting, ELISA, etc. baserat på labbpreferenser. Det är vanligtvis onödigt att reperfuse flödet igenom.
4. Elute Protein från membranets adsorber
- Tvätta membran adsorbern med 10 ml DPBS för att avlägsna eventuellt icke-bundet protein.
- Elutprotein från membran adsorber vid önskat flöde(t.ex. 1 ml/min) med 10-15 ml elueringsbuffert(t.ex. aminbaserad elueringsbuffert (pH 2.8)). Fånga eluat i ett rör som innehåller neutraliserande buffert(t.ex. 1 M Tris (pH 9.4)) vid 10% av elueringsvolymen (1,0-1,5 ml).
- Alternativt kan du eluera protein i en ml steg till rör som innehåller 100 μl neutraliseringsbuffert, med en total volym på 10-15 ml elueringsbuffert. Använd önskad karakteriseringsmetod för att testa varje fraktion för förekomst av protein.
- Regenerera membran adsorber enligt tillverkarens instruktioner. Granska 10 ml 0,22 μm-filtrerade DPBS eller valfri buffert, sedan 10 ml 0,22 μm-filtrerade 50 mM NaOH i 1 N NaCl och slutligen 10 ml 0,22 μm-filtrerade DPBS. Fyll membran adsorbern med 20% etanol i DPBS för långtidslagring vid 4 ºC.
5. Koncentrera och dialysera proteinet
- Deponera alla eluater (eller elueringsfraktioner som innehåller protein enligt steg 4.3) i en 10 kDa molekylvikts cut-off centrifugalfilterenhet. Följ tillverkarens instruktioner för centrifugering.
- Dialysera retentatet i en liten volymdialysenhet (10 kDa molekylviktsavskärning) mot valfri buffert, enligt tillverkarens instruktioner. Bufferten kan behöva tillsättas till dialyserat material om proteinutfällning är ett problem. Om så önskas kan det dialyserade materialet kylas tills steg 6 kan utföras, men långtidslagring utan konserveringsmedel rekommenderas inte.
6. Kvantifiera och karakterisera renad produkt i ett påskyndat västerländskt blotting-förfarande
- Lös renade protein- och Fc-standarder på valfri gel av SDS-PAGE, under minskande eller icke-inducerande förhållandensom önskat 18-20. Använd en minigel i stället för midi gel för att minimera körtiden.
- Om det inte redan är känt, bestäm fc-standardintervallet över vilket bandsignalen varierar linjärt med avseende på lastad mängd (t.ex. 0,1-1 mg). Använd samma gel, körförhållanden, överföringsförhållanden och reagenser som kommer att användas för att kvantifiera och karakterisera renat protein.
- Ladda flera provmängder re renat protein, inklusive prover utspädda med DPBS, för att säkerställa att de renade proteinbandssignalerna ligger inom det linjära signalområdet för Fc-standarder i bildanalys.
- Överför proteiner från gelén till ett polyvinylidenfluoridmembran (PVDF) i ett diskontinuerligt buffertsystem med en halvdry blotter13, enligt blottertillverkarens instruktioner. Överföringstiden är vanligtvis 5-10 min. Om så önskas, Coomassie färga gelén efter överföring för att verifieraöverföringseffektivitet 21.
- Utför immunoblotting med anti-Fc eller anti-IgG konjugerad till alkalisk fosfatas (AP) eller hästrädisa peroxidas (HRP), baserat på labb preferenser, med hjälp av ett vakuum-assisterat protein detekteringssystem. Immunoblotting tid är vanligtvis mindre än 1 timme.
- Utveckla immunoblot med hjälp av substratet och valmetoden(t.ex. AP-substrat och förbättrad chemiluminescens).
- Kvantifiera renat protein genom bildanalys. Utför en linjär regression på bandsignalerna från Fc-standarder. Om R2>0,90 använder du ekvationen för linjen för att beräkna proteinmängden från bandsignalerna. Redovisa provutspädning vid behov. Eftersom kvantifiering av proteinet utförs på grundval av Fc, justera värdet för molekylviktsskillnader mellan proteinet och Fc. Om R2<0.90, upprepa steg 6 i sin helhet.
- Validera protein med hjälp av funktionella analyser eller metoder för att upptäcka Fc via flödescytometri, western blotting, ELISA, etc. baserat på labbpreferenser.
- Späd ut proteinet till önskad koncentration och/eller tillsätt önskade konserveringsmedel eller stabilisatorer till den renade proteinlösningen innan du aliquoterar för långtidslagring, fryst eller på annat sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det strömlinjeformade protokollet för isolering och karakterisering av Fc-uttrycka proteiner används rutinmässigt för att bearbeta chimeric murin galectin-1 smält till mänskliga Fc (Gal-1hFc) från utspädd cell kultur supernatanter. Flödesschemat i figur 2 illustrerar arbetsflödet och tiden för varje steg i protokollet. För ett typiskt parti på 300 ml supernatant är den totala bearbetningstiden cirka 9 timmar när den valfria flödescytometritestningen av elueringsfraktioner utförs. Om all flödescytometrianalys utelämnas, på grund av brist på flödescytometer eller individuella labbpreferenser, kan den totala bearbetningstiden vara så kort som 4 timmar. I allmänhet beror bearbetningstiden på operatörsupplevelsen, mängden supernatant som bearbetas och vilka kvantifierings- och karakteriseringsmetoder som utförs.
Flödescytometri användes för att testa förförekomst av funktionella Gal-1hFc ( dvs. Gal-1 kan upptäcka sina ligands på bröstcancerceller) i startcellskulturens supernatant; nytt cellkulturmedium fungerade som den negativakontrollen 18,22 . När Gal-1hFc i cellkulturens supernatant verifierades (Figur 3A), uppnåddes belastningen av proteinet A-membran adsorber genom övernaturlig perfusion vid 10 ml/min (vilket resulterade i ytlig hastighet eller volymetriskt flöde på 0,5 cm/min i en 2 ml membran adsorber) med hjälp av en sprutpump (Figur 1). Membran adsorber effektivt fångade och behöll Gal-1hFc, lämnar flödet genom i huvudsak utarmat av Gal-1hFc (brist på genombrott, figur 3A). Gal-1hFc eluerades från membran adsorber i en millimeter steg vid 1 ml/min (volymetriskt flöde = 0,05 cm/min) med hjälp av en amine-baserad sur buffert (pH 2,8), och neutraliserade eluering fraktioner testades därefter för förekomsten av funktionell Gal-1hFc med hjälp av flöde cytometri (Figur 3B). Gal-1hFc-signalen ökade sekventiellt från eluering 1 (ungefär lika med negativ kontroll) till ett maximum vid eluering 3, och minskade sedan till en nästan konstant nivå vid eluering 9 och 10 (figurerna 3B och 3C). Den slutliga eluering 10 nådde inte motsvarigheten till den negativa kontrollsignalen på grund av viss adsorberretention av Gal-1hFc (figurerna 3B och 3C). Denna förlust ansågs dock godtagbar. Som en alternativ metod för att testa för närvaro, men inte funktion, av Gal-1hFc i olika lösningar kan flödescytometrianalys av Gal-1hFc:s förmåga att binda till protein A polystyrenpärlor (genom erkännande av hFc-regionen) användas (Figur 3D).
Efter elueringsfraktionstestning koncentrerades Gal-1hFc-positiva eluer 2 till 10 och dialyserades sedan mot DPBS för att erhålla renad Gal-1hFc i önskad buffert. Kvantifiering och karakterisering av den renade Gal-1hFc utfördes i en västerländsk blotting förfarande påskyndas av semidry överföring och vakuum-assisted immunoblotting. Genom att jämföra Gal-1hFc-signal med hFc-kvantifieringsstandarder fastställdes både mängden och kvaliteten på renat material (figurerna 4A-C). Signalintensiteterna för hFc-standardband (ett band på ~25 kDa vardera i figur 4A, körfält 1-5) var linjärt relaterade till mängden hFc närvarande (Figur 4C). Gal-1hFc (ett band på ~40 kDa i figur 4A, bana 6) och försämrade Gal-1hFc (ett band på ~40 kDa och ett band på ~25 kDa i figur 4A, körfält 7) signaler låg inom standardområdet (Figur 4A, körfält 1-5). Koncentrationen av renad Gal-1hFc(figur 4A,körfält 6) på grundval av hFc fastställdes till 450 μg/ml genom bildbehandling(figur 4C). Justera för molekylvikten av Gal-1hFc, koncentrationen av det renade materialet var 720 g/ml. Däremot lastades för mycket renad Gal-1hFc i körfälten 6 och 7 i väst i figur 4B, vilket genererade signaler som mättade eller överskred hFc-standardintervallet, vilket förhindrade kvantifiering. Coomassiegelfärgning 21 kan fungera som en snabb kvalitetskontrollkontroll och/eller kvantifieringsmetod (figur 4D). Observera att ett band ~10 kDa, förutom banden ~25 kDa och ~40 kDa, fanns i det försämrade Gal-1hFc-provet(Figur 4D, lane 2). Detta band är degraderat Gal-1hFc som inte var reaktivt med detektionsantikroppen som används i västerländska blots (figurerna 4A och 4B).
Efter kvantifiering och slutlig karakterisering av den renade Gal-1hFc tillsattes steril BSA för att uppnå en slutlig BSA-koncentration på 0,5%. Det renade materialet alikvoterades sedan och lagrades vid -20 ºC. Förutom Gal-1hFc har vi använt detta strömlinjeformade protokoll för att isolera dubbelmuterade Gal-1hFc och Gal-7hFc. Det kan också utvidgas till praktiskt taget alla molekyler som har ett Fc-fragment (antikroppar, Fc-fragment själva, andra Fc fusion proteiner, etc. av arter och isotyper som har affinitet för protein A14-17).
Figur 1. Schematiskt för den experimentella apparaten. Antikroppar och rekombinanta fusionsproteiner som uttrycker Fc-fragment av IgG kan isoleras från utspädda lösningar med hjälp av ett protein A-membran adsorber. Membran adsorbern ansluts genom en Luer låskoppling till en 30 ml spruta på en sprutpump, som genomsyrar den proteininnehållande lösningen genom membranets adsorber vid önskad volymetrisk flödeshastighet.
Figur 2. Bearbeta arbetsflödet för isolering av Gal-1hFc från cellkultur supernatant. Detta flödesschema illustrerar protokollet för isolering och karakterisering av en chimeric murin galectin-1/human Fc-uttrycker fusion protein (Gal-1hFc) från cell kultur supernatant. I allmänhet varierar bearbetningstiden beroende på operatörsupplevelse, mängden supernatant som bearbetas och vilka kvantifierings- och karakteriseringsmetoder som används.
Figur 3. Flödescytometrianalys av Gal-1hFc-innehållande lösningar. Flödescytometri används för att bedöma om funktionell Gal-1hFc finns i färskt cellkulturmedium, cellkultur supernatant, membran adsorberflöde igenom och eluering fraktioner. APC-konjugerade F(ab')2 anti-human Fc användes som sekundära antikroppar. Alla data förvärvades med hjälp av en FACS Aria Special Order Research Product flöde cytometer / sortering och analyserades med FlowJo programvara. Markörer i varje histogram utgör 2 % av den negativakontrollpopulationen (dvs.nytt cellkulturmedium för (A) och hFc isotyp för ( B )). (A) Flöde cytometri histogram överlägg av BT-20 bröstcancer celler märkta med färska cell kultur medium (röd), cell kultur supernatant (blå) eller membran adsorber flöde igenom (grön). Cellkulturens supernatant innehöll en låg nivå av funktionell Gal-1hFc som framgångsrikt bundna till galectin-1 ligands på BT-20-celler, medan det färska cellkulturmediet och membran adsorberflödet genom saknade Gal-1hFc, som förväntat. B) Flödescytometri histogram av BT-20 celler märkta med eluering fraktioner från membranet adsorber. Gal-1hFc-signalen på BT-20-cellerna ökar sekventiellt till ett maximum vid eluering 4 och minskar sedan, men inte till bakgrundsnivå(dvs. signal motsvarande färskt cellkulturmedium). c) Proverna i B:s genomsnittliga fluorescensintensiteter kan också ritas upp som en funktion av elueringsfraktionsnummer för att generera en elueringskurva. Den genomsnittliga fluorescensintensiteten hos celler märkta med hFc isotypkontroll visas som en referenslinje. (D) Alternativt kan flödescytometrianalys av Gal-1hFc som är bundet till protein A polystyrenpärlor användas för att testa för proteinförekomst, men inte funktion, i olika lösningar. APC-konjugerade F(ab')2 anti-human Fc användes som sekundära antikroppar. Vänster: Flöde cytometri histogram överlägg av färsk cell kultur medium (röd), cell kultur supernatant (blå) och tom buffert prov (grön). Mitten: Histogram av hFc isotyp kontroll. Inkubation med 10 mg/ml hFc är en positiv kontroll för protein A capture. Höger panel: Histogram av protein A pärlor inkuberade med renade Gal-1hFc, på grundval av 10 mg hFc/ml. Klicka här för att se större bild.
Figur 4. Kvantifiering och karakterisering av Gal-1hFc med hjälp av västerländsk blotting och bildanalys. (A) Körfält 1-5 är hFc-standarder på 0,1-0,5 μg i steg om 0,1 μg och körfälten 6 och 7 renas Gal-1hFc från två olika produktionstomter. Prover löstes på en 4-15% TGX gel av SDS-PAGE under minskande förhållanden, sedan överförs till PVDF membran med hjälp av diskontinuerliga överföring villkor. Membranet blockerades och inkuberades med anti-hIgG-AP med hjälp av en vakuum-assisterad immunoblotting teknik. Signaler utvecklades med ECL reagens och visualiserades på en Bio-Rad ChemiDoc XRS imager. Signalerna för hFc-standarder i körfält 1-5 varierade linjärt (plottat i (C)), och signalerna för de två renade Gal-1hFc-proverna i körfälten 6 och 7 låg inom det linjära mätområdet. Lane 7 visar två band, Gal-1hFc och förmodligen hFc fragment, vilket indikerar nedbrytning av proteinet. (B) Om för mycket renad Gal-1hFc är laddad kan signalen mätta eller överskrida det linjära signalområdet, vilket förhindrar kvantifiering (körfälten 6 och 7). Körfält, gel och körförhållanden är desamma som i (A). (C) Image Lab analysprogramvara gör det möjligt att mata in kända absoluta mängder hFc-standarder från en immunoblot och bestämmer sedan mängden av det okända bandet/frekvensbandet genom dess signal i förhållande till den linjära regressionen av standarder (y = 1,36 x 10-7* x + 0,105; R2 = 0,95). Data som visas kommer från analysen av immunoblot i (A). (D) Kvaliteten på renade Gal-1hFc kan bedömas med Coomassie färgning. Lane M är en molekylviktsmarkör, körfält 1 renas Gal-1hFc (samma prov som körfält 6 i (A) och (B)), körfält 2 bryts ner Gal-1hFc (samma prov som körfält 7 i (A) och (B)), och körfält 3 är 0,2 mg hFc standard. Gel- och körförhållandena var desamma som i( A) och (B). Klicka här om du vill visa större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs häri utvecklades för att snabbt isolera och karakterisera ett chimeriskt fusionsprotein som uttrycker human Fc (Gal-1hFc), utan att avsevärt äventyra produktåtervinning eller blåsa upp kostnaden. De viktigaste komponenterna i det strömlinjeformade arbetsflödet är ett protein A-membran adsorber för isolering och halvdry överföring och vakuumassisterad immunoblotting för karakterisering av western blotting.
Den dramatiska minskningen av bearbetningstiden för isolering och karakterisering av Gal-1hFc från 300 ml cellkultur supernatant (cirka 9 timmar i det strömlinjeformade protokollet jämfört med 20+ timmar i ett traditionellt protokoll) beror till stor del på införlivandet av ovannämnda nyckelkomponenter, särskilt membranet adsorber. Vid den maximala rekommenderade flödeshastigheten på 10 ml supernatant/min kan membran adsorberbelastning slutföras på 30 minuter. Gal-1hFc återhämtning från protein A membran adsorbatorer varierar vanligtvis från 10-30% i våra laboratorier, med ~ 30% återhämtning rutinmässigt uppnås av erfaren labbpersonal närGal-1hFc koncentrationer i cellkultur supernatant är 5-10 mg/ml. Som mest har ~ 50% återhämtning uppnåtts. Fullständig produktåtervinning är praktiskt taget omöjlig på grund av inneboende förluster på grund av a) specifik retention av Fc-uttrycksprotein med protein A på membran adsorber (figurerna 3B och 3C) och (b) ospecificerad ytannonsering av proteinet under hela isoleringen. Det är viktigt för enskilda labb att avgöra om produktåterställning med ett membran adsorber är acceptabelt baserat på deras behov; Om ändring av belastningsflödet eller råmaterialhalten(t.ex. önskat proteincellskoncentrationskultur supernatant, vilket kan vara särskilt svårt) kan förbättraproduktåtervinningen 8,eller om modifiering av elueringsprotokollet (steg 4) för att få högre återhämtning är värt den ökade tiden, kostnaden och ansträngningen, eller den eventuella skadan på själva proteinet eller membranets adsorber (främst genom elueringsbuffert pH, saltkoncentration etc.). I motsats till att använda membran adsorber, det tar cirka 10 timmar att utföra två perfusion cykler genom en 1 ml protein A pärla-förpackadekolumn 18vid maximal tolerabel flödeshastighet på 1 ml/min, och endast 10-20% Gal-1hFc återvinns vanligtvis. Som ett sista problem kan en kostnadsanalys för protein A-pärlor från olika tillverkare påverka beslutet att använda en standardpläderad kolumn jämfört med en enda membran adsorber. Med hänsyn till alla dessa faktorer kan användningen av ett membran adsorber för laboratorieskala isolering av Fc-uttryckande proteiner erbjuda små laboratorier betydande fördelar jämfört med kolumnkromatografi2,5,8,10.
Användning av en minigel för SDS-PAGE, semidry discontinuous elektroforesisk överföring av proteiner från gelén till PVDF membran och vakuum-assisterad immunoblotting erbjuder betydande tidsbesparingar jämfört med midi geler, tank (våt) överföring och diffusion-baserade immunostaining för kvantifiering och karakterisering av Gal-1hFc (2 timmar kontra 8 timmar). Enskilda laboratorier måste avgöra om det påskyndade västerländska protokollet är lämpligt för kvantifiering och karakterisering av deras protein. Fördelarna inkluderar a) kort tid till slutförande även av oerfaren labbpersonal, b) förmåga att avgöra om proteinet är intakt eller har försämrats på grund av bearbetning eller kontaminering (figur 4B) och c) relativ lätt kvantifiering genom bildbehandlingsprogram (figur 4C). A) Ökade reagenser och kostnader för förbrukningsvaror kan dock vara oacceptabla trots tidskompensation för löner, b) traditionell proteink kvantifiering av A280, ELISA, Bradford assay eller BCA-analys kan föredras23-27, eller (c) laboratorier kanske inte har tillgång till en halvdry blotter eller ett vakuumassisterat proteindetekteringssystem för immunblottning. I sådana fall är Coomassie färgning av SDS-PAGE löstproteiner 21(Figur 4D) eller punkt eller slot blotting28 bra alternativ.
Flödescytometri användes i tre separata 90-minuterstester för detektion av funktionell Gal-1hFc i detta strömlinjeformade protokoll (figur 2), vilket är detsamma som vid traditionell bearbetning18,22. Alla andra karakteriseringsmetoder som western blotting eller ELISA skulle också vara acceptabla. Funktionella analyser är optimala (t.ex. påvisande av galectin-1 ligands på bröstcancerceller, figur 3A-C). Alternativt skulle detektion av Fc-enheten vara godtagbart (liknande figur 3D), men bibehållande av proteints specifika funktion kan inte fastställas på detta sätt, vilket är en potentiellt betydande nackdel.
De metoder som beskrivs häri har använts för snabb laboratorieskala isolering och karakterisering av en chimeric fusion protein uttrycker mänskliga Fc (Gal-1hFc). Detta strömlinjeformade arbetsflöde kan tillämpas på isolering av praktiskt taget alla molekyler som har ett Fc-fragment (IgG-antikroppar, andra Fc-fusionsproteiner, Fc-fragment själva etc.)och kan enkelt modifieras baserat på individuella labbpreferenser. Dessutom är detta protokoll relativt snabbt och enkelt, även för begränsad erfarenhet eller helt oerfaren labbpersonal, vilket gör det lämpligt för användning i gymnasie- eller högskolebiologi, kemi och (bio)kemitekniska kurser som täcker principer om proteinisolering och karakterisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det finns inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Luis F. Delgadillo (Institutionen för kemi och biomolekylär teknik, Ohio University), Matthew H. Williams (Institutionen för kemisk och biomolekylär teknik, Ohio University) och Dr. Filiberto Cedeno-Laurent (Brigham and Women's Hospital och Harvard Medical School) för expert teknisk hjälp. Författarna vill också tacka che 404/BME 504 och hösten 2012 CHE 4830/BME 5830 studenter (Institutionen för kemisk och biomolekylär teknik och biomedicinsk teknik, Ohio University) för teknisk rådgivning och diskussion. Detta arbete stöddes av National Science Foundation (NSF) Major Research Instrumentation grant CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Dermatology Foundation Research Grant A050422 (SRB), National Institutes of Health (NIH) NCI grant 1R15CA161830-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Postdoktorsstipendium F32CA144219-01A1 (SRB), NIH/NCI R01CA173610 (CJS) och NIH NCCAM grant R01AT004628 (CJS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml) | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12--A | |
| Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml | Millipore | UFC801008 | Use 15 ml volume if needed |
| Sterile vacuum filter unit, 0.22 µm, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| 10 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 301604 | |
| 30 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 309650 | |
| Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft) | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
| Snap i.d. antibody collection tray | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap i.d. single well blot holder | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| Elution buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris, ultra pure | Fisher Scientific | 819623 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS with Ca2+/Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Human Fc | Bethyl Research Laboratories | P80-104 | |
| Anti-human Fc-APC | Jackson Immunoresearch | 109136170 | |
| Anti-human Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| Alkaline phosphatase substrate | Promega | S3841 | |
| Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene) | BD | 352054 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 55-2226 | A peristaltic pump is also acceptable |
| Protein gel electrophoresis system | Bio-Rad Laboratories | 552BR094876 | Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest |
| Semidry blotter | Bio-Rad Laboratories | 690BR006163 | Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest |
| SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system | EMD Millipore | WBAVDBASE | An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well |
References
- Gagnon, P. Technology trends in antibody purification. J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).
- Gottschalk, U. Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly. Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).
- Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. MAbs. 2, 480-499 (2010).
- Low, D., O'Leary, R., Pujar, N. S. Future of antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, 48-63 (2007).
- Boi, C. Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).
- Cuatrecasas, P. Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads. J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends Biotechnol. 31, 147-154 (2013).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies. Biotechnol Prog. 24, 640-647 (2008).
- Dancette, O. P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography. J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).
- Thommes, J., Etzel, M. Alternatives to chromatographic separations. Biotechnol. Prog. 23, 42-45 (2007).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Modelling and simulation of affinity membrane adsorption. J. Chromatogr. A. 1162, 24-33 (2007).
- van Beijeren, P., et al. Computer-aided process design of affinity membrane adsorbers: A case study on antibodies capturing. Chem. Pap. 62, 458-463 (2008).
- Lauriere, M. A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page. Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).
- Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O'Kennedy, R. Purification of antibodies using affinity chromatography. Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).
- Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins. FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein a chromatography for antibody purification. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).
- Kronvall, G. A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g. J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation. J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
- Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity. J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), (2009).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. J. Vis. Exp. (38), (2010).
- Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays. J. Vis. Exp. (50), (2011).
