Summary
Im Vergleich zur traditionellen Affinitätschromatographie mit Protein A Agarose Perlen-verpackten Säulen können Protein-A-Membranadsorber die Isolation von Antikörpern und anderen Fc-Fragment-exemittierenden Proteinen im Labormaßstab erheblich beschleunigen. Geeignete Analyse- und Quantifizierungsmethoden können die Proteinverarbeitung weiter beschleunigen, so dass die Isolierung/Charakterisierung an einem Werktag statt an mehr als 20 Arbeitsstunden abgeschlossen werden kann.
Abstract
Laborwaage numerativ zur industriellen Reinigung von Biomolekülen aus Zellkulturüberstand und Lysed-Zell-Lösungen kann mit Affinitätschromatographie durchgeführt werden. Während die Affinitätschromatographie mit porösem Protein A AgarosePerlen, die in Säulen verpackt sind, wohl die häufigste Methode zur Isolierung von Antikörpern und rekombinanten Proteinen im Labor maßstabsgetreu ist, die Fc-Fragmente von IgG exdrücken, kann es ein zeitaufwändiger und teurer Prozess sein. Zeit- und Finanzzwänge sind besonders beängstigend in kleinen wissenschaftlichen Grundlagenlabors, die Hunderte von Mikrogramm bis Milligramm Proteinmengen aus verdünnten Lösungen zurückgewinnen müssen, aber keinen Zugang zu Hochdruck-Flüssigkeitsabgabesystemen und/oder Personal mit Expertise in Bioseparationen haben. Darüber hinaus kann die Produktquantifizierung und -charakterisierung auch die Bearbeitungszeit über mehrere Arbeitstage hinaus übermäßig verlängern und die Ausgaben (Verbrauchsmaterialien, Löhne usw.)aufblähen. Daher ist ein schnelles, kostengünstiges und dennoch effektives Protokoll für die Isolierung und Charakterisierung von Antikörpern und anderen Proteinen, die ein Fc-Fragment besitzen, erforderlich. Zu diesem Zweck haben wir ein Protokoll entwickelt, das von technischem Personal mit begrenzter Erfahrung in weniger als 9 Stunden (ungefähr einen Arbeitstag) und bis zu 4 Stunden abgeschlossen werden kann, im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden, die mehr als 20 Arbeitsstunden erfordern. Die meisten benötigten Geräte sind in standardbiomedizinischen, biochemischen und (bio-)chemischen Engineering-Labors leicht verfügbar, und alle Reagenzien sind im Handel erhältlich. Um dieses Protokoll zu demonstrieren, werden repräsentative Ergebnisse präsentiert, in denen chimäres murinisches Galant-1 mit dem menschlichen Fc (Gal-1hFc) aus Zellkulturüberstand verschmolzen wurde, mit einem Protein-A-Membranadsorber isoliert wurde. Gereinigte Gal-1hFc wurde mit einem beschleunigten Western Blotting-Analyseverfahren quantifiziert und mit Durchflusszytometrie charakterisiert. Der optimierte Workflow kann für andere Fc-exzessiven Proteine, wie Antikörper, geändert und/oder geändert werden, um alternative Quantifizierungs- und Charakterisierungsmethoden zu integrieren.
Introduction
Die Isolierung von Antikörpern und rekombinanten Proteinen, die Immunglobulin G (IgG) fc-Fragmente aus Zellkulturüberstand und verdünnten lysierten Zelllösungen exemitzenen, kann mit Hilfe der Protein-A-Affinitätschromatographie erreicht werden. In wissenschaftlichen und technischen Grundlagenlaboren und der Industrie werden Säulen, die mit porösem Protein A-beschichteter Agarose, Glas oder Polymerperlen verpackt sind, am häufigsten für die Affinitätschromatographie verwendet, trotz hoher finanzieller Kosten und langer Verarbeitungszeiten1-3. Es ist sehr zu schätzen, dass die Affinitätschromatographie den größten Aufwands- und Verarbeitungsengpass sowohl im Labor als auch in der Industrie darstellt2,4. Als Ergebnis wurden zahlreiche Verbesserungen entwickelt, um Kosten und Verarbeitungszeit zu senken, ohne die gesamte Produktrückgewinnung aus dem Prozesszug1,2,5-7zu opfern. Besonders vielversprechend für die Isolierung von Antikörpern und anderen Fc-exemittierenden Proteinen ist die Affinitätschromatographie mit einem Protein A Membranadsorber2,5,7-10. Während die Fc-Capture in der Säulenchromatographie diffusionsbegrenzt ist(d.h. das Fc-extierende Protein muss in und durch die inneren Poren diffundieren, um den Großteil des Proteins A zu erreichen) mit hohem Druckabfall über die Säule, wird der Massentransport in Membranadsorbern durch Massenkonvektion angetrieben, was zur Vermeidung von Diffusionsbeschränkungen8,9,11,12führt. Darüber hinaus ist der Druckabfall über den Membranadsorber gering, was eine schnellere Durchblutung im Vergleich zu perlenverpackten Säulen8,9,11,12ermöglicht. Daher wird für die Isolierung von Laborskalen prognostiziert, dass die Membranchromatographie die Isolationszeit um mehrere Stunden reduziert und die Produkterfassung im Vergleich zur Säulenchromatographie erhöht. Darüber hinaus wurden mathematische Modelle für die IgG-Adsorption in Membranadsorbern8,9,11,12vorgeschlagen, so dass Endbenutzer die Leistung im Labor vorhersagen können.
Ein weiterer Engpass in wissenschaftlichen und technischen Grundlagenlaboren ist die Charakterisierung des Fc-exemittigen Proteins. Die Auswahl geeigneter Methoden zum Abschließen von Charakterisierungstests, wie westlichen Flecken, kann jedoch den Zeitaufwand für Produkttests erheblich reduzieren. Zum Beispiel kann die semitrockene Übertragung in einem diskontinuierlichen Puffersystem den elektrophoretischen Transfer von Proteinen von einem SDS-PAGE-Gel auf eine Polyvinyldifluoridin -Membran (PVDF) in wenigen Minuten erreichen, im Gegensatz zu 1-2 Stunden im Tank (Nasstransfer) in einem kontinuierlichen Puffersystem13.
Ein schnelles, kostengünstiges und effektives Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung eines chimerischen Fusionsproteins, das ein Fc-Fragment menschlichen IgG ausdrückt, wird hierin beschrieben. Die meisten Geräte sind in grundlegenden biomedizinischen Grundlagen, Biologie, Chemie und (Bio-)Chemie-Engineering-Labors leicht verfügbar, und alle Reagenzien sind im Handel erhältlich. Obwohl repräsentative Ergebnisse aus der Isolierung und Charakterisierung eines murinen Galectin-1/menschlichen Fc chimeric Fusion Protein (Gal-1hFc) generiert wurden, kann das gestraffte Protokoll auf die Isolierung anderer Moleküle angewendet werden, die ein Fc-Fragment besitzen, wie Antikörper, Fc-Fragmente selbst oder andere Fc-Fusionsproteine. Unsere Verbesserungen verringerten die Verarbeitungszeit drastisch (nur 4 Stunden, aber in der Regel 9 Stunden, im Vergleich zu 20+ Arbeitsstunden) und erreichten gleichzeitig eine ähnliche oder verbesserte Produktwiederherstellung im Vergleich zu Standardmethoden.
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Protocol
1. Überprüfen Sie die Affinität für Protein A
- Stellen Sie sicher, dass das Fc-exporierende Protein (rekombinantes Fusionsprotein oder IgG-Antikörper, bisher als "Protein" bezeichnet) eine akzeptable Affinität zu Protein A14-17 vor der Verwendung des Proteins A Membranadsorber hat, und testen Sie das Vorhandensein des Proteins in der Stammlösung(z. B. Zellkulturüberstand, der durch Zentrifugation bei 1.000 x g für 5 min zu einem). Verwenden Sie Durchflusszytometrie, Western Blotting, ELISA usw. Proteinfunktion und/oder Vorhandensein von Fc auf der Grundlage von Laborpräferenzen zu erkennen. Im Idealfall quantifizieren Sie das Protein in der Zellkultur Überstand (Schritt 6), um eine Überschreitung der Protein-A-Membranadsorberkapazität zu vermeiden. Fahren Sie fort, wenn Protein nachgewiesen wird.
2. Bereiten Protein A Membran Adsorber und Zellkultur Supernatant
- Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers zur Herstellung des Membranadsorbers. Lassen Sie niemals Luft in den Membranadsorber eindringen. Alle Lösungen, die durch den Membranadsorber durchsetzt werden, sollten bei Raumtemperatur sein und mit einem 0,22 m-Filter vorgefiltert werden. Füllen Sie eine 10 ml Spritze mit 0,22 m-gefilterter Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline (DPBS) oder Puffer nach Wahl und entleeren Luftblasen. Durchdringen Sie DPBS, um die Speicherlösung zu entfernen und den Membranadsorber unmittelbar vor der Anwendung auszudemt.
- Filtern Sie den Zellkulturüberstand unmittelbar vor der Perfusion durch den Membranadsorber, indem Sie eine vakuumgesteuerte sterile Filtrationseinheit mit 0,22 m verwenden.
3. Laden Sie das Protein A Membrane Adsorber
- Aspirieren Zellkultur Überstand in eine Luer Lock Spritze (30 ml oder größer), und entladen Alle Luftblasen.
- Montieren Sie Materialien und Ausrüstungen, wie in Abbildung 1dargestellt. Schließen Sie die Spritze an den Einlass des Membranadsorbers an. Befestigen Sie flexible Schläuche am Membranadsorberauslass. Legen Sie auf Wunsch einen Spritzenfilter von 0,22 m zwischen die Spritze und den Membranadsorber. Verwenden Sie einen Kolben oder eine Flasche, um den Durchfluss (auch als Filtrat bezeichnet) vom Adsorber zu fangen.
- Stellen Sie die Spritzenpumpe auf den gewünschten Volumendurchfluss ein, überschreiten Sie jedoch nicht den vom Hersteller empfohlenen Durchfluss(z. B. 10 ml/min). Durchdringen Sie die Zellkultur, die durch den Membranadsorber durchläuft, und sammeln Sie den Durchfluss in einem Becher oder einem anderen Behälter. Laden Sie die Spritze mit den erforderlichen Überstanden nach.
- Auf Wunsch testen Sie den Durchfluss auf das Vorhandensein von Protein entoverwendend, indem Sie Diedurchflusszytometrie, Western Blotting, ELISA usw.verwenden. basierend auf labor-Präferenz. Es ist in der Regel nicht erforderlich, den Durchfluss durchzuspielen.
4. Elute Protein aus dem Membranadsorber
- Waschen Sie den Membranadsorber mit 10 ml DPBS, um alle nicht gebundenen Proteine zu entfernen.
- Elute-Protein aus dem Membranadsorber bei der gewünschten Durchflussrate(z.B. 1 ml/min) mit 10-15 ml Elutionspuffer(z.B. Amin-basierter Elutionspuffer (pH 2,8)). Fangen Sie eluat in einem Rohr mit Neutralisationspuffer(z. B. 1 M Tris (pH 9.4)) bei 10% des Elutionsvolumens (1,0-1,5 ml).
- Alternativ wird elute Protein in einem ml in Tuben mit einem Neutralisationspuffer von 100 l mit einem Gesamtvolumen von 10-15 ml Elutionspuffer erhöht. Verwenden Sie die bevorzugte Charakterisierungsmethode, um jede Fraktion auf das Vorhandensein von Protein zu testen.
- Regenerieren Sie den Membranadsorber gemäß den Anweisungen des Herstellers. Durchdringen Sie 10 ml 0,22 m-gefilterte DPBS oder Puffer nach Wahl, dann 10 ml 0,22 m-gefilterte 50 mM NaOH in 1 N NaCl und schließlich 10 ml 0,22 m-gefiltertes DPBS. Füllen Sie den Membranadsorber mit 20% Ethanol in DPBS für die Langzeitlagerung bei 4 oC.
5. Konzentrieren und Dialyse das Protein
- Legen Sie alle Eluate (oder Elutionsfraktionen, die Protein enthalten, wie in Schritt 4.3 bestimmt) in einer 10 kDa Molekulargewichts-Trennzentrifugalfiltereinheit abzulegen. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Zentrifugation.
- Dialysieren Sie das Retentat in einer dialysatenkleinen Dialyseeinheit (10 kDa Molekulargewichtsabschaltung) nach den Anweisungen des Herstellers gegen den Puffer der Wahl. Wenn die Proteinfällung anlasse, muss dem Dialysematerial ein Puffer hinzugefügt werden. Auf Wunsch kann das Dialysematerial bis Schritt 6 gekühlt werden, eine Langzeitlagerung ohne Konservierungsstoffe wird jedoch nicht empfohlen.
6. Quantifizieren und Charakterisieren von gereinigtem Produkt in einem beschleunigten Western Blotting-Verfahren
- Lösen Sie gereinigte Protein- und Fc-Standards auf dem Gel der Wahl von SDS-PAGE, unter reduzierenden oder nicht reduzierenden Bedingungen wie gewünscht18-20. Verwenden Sie ein Mini-Gel anstelle von Midi-Gel, um die Laufzeit zu minimieren.
- Wenn nicht bereits bekannt, bestimmen Sie den Fc-Normbereich, über den das Bandsignal in Bezug auf die Menge der geladenen(z. B. 0,1-1 mg) linear variiert. Verwenden Sie das gleiche Gel, Laufbedingungen, Transferbedingungen und Reagenzien, die verwendet werden, um gereinigtes Protein zu quantifizieren und zu charakterisieren.
- Laden Sie mehrere Probenmengen an gereinigtem Protein, einschließlich probenverdünnt mit DPBS, um sicherzustellen, dass die gereinigten Proteinbandsignale innerhalb des linearen Signalbereichs der Fc-Standards in der Bildanalyse liegen.
- Übertragen Sie Proteine aus dem Gel auf eine Polyvinylidenfluorid-Membran (PVDF) in einem diskontinuierlichen Puffersystem mit einem semidry blotter13, entsprechend den Anweisungen des Blotterherstellers. Die Transferzeit beträgt in der Regel 5-10 min. Wenn gewünscht, Coomassie Färben sie das Gel nach der Übertragung, um Transfer-Effizienz zu überprüfen21.
- Durchführung von Immunoblotting mit Anti-Fc oder Anti-IgG konjugiert zu alkalischer Phosphatase (AP) oder Pferderettichperoxidase (HRP), basierend auf Laborpräferenz, mit einem vakuumunterstützten Proteinnachweissystem. Immunoblotting Zeit ist in der Regel weniger als 1 Stunde.
- Entwickeln Sie Immunoblot mit dem Substrat und der Methode ihrer Wahl(z. B. AP-Substrat und verbesserte Chemilumineszenz).
- Quantifizieren Sie gereinigtes Protein durch Bildanalyse. Führen Sie eine lineare Regression der Bandsignale von Fc-Standards durch. WennR2>0,90, verwenden Sie die Gleichung für die Linie, um die Proteinmenge aus ihren Bandsignalen zu berechnen. Ggf. Berücksichtigung der Probenverdünnung. Da die Quantifizierung des Proteins auf Basis von Fc erfolgt, passen Sie den Wert für molekulare Gewichtsunterschiede zwischen dem Protein und Fc an. WennR2<0,90, wiederholen Sie Schritt 6 in seiner Gesamtheit.
- Validieren Sie Protein emittiert mit funktionellen Assays oder Methoden, um Fc über Durchflusszytometrie, Western Blotting, ELISA usw.zu erkennen. basierend auf labor-Präferenz.
- Protein auf die gewünschte Konzentration verdünnen und/oder gewünschte Konservierungsstoffe oder Stabilisatoren in die gereinigte Proteinlösung geben, bevor es für eine langfristige Lagerung, gefroren oder auf andere Weise aliquotiert wird.
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Representative Results
Das gestraffte Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung von Fc-exezierenden Proteinen wird routinemäßig verwendet, um charisch-murines Galectin-1 mit dem menschlichen Fc (Gal-1hFc) aus verdünnten Zellkultur-Übertreibmitteln zu verarbeiten. Das Flussdiagramm in Abbildung 2 veranschaulicht den Workflow und die Zeit für jeden Schritt im Protokoll. Bei einer typischen Charge von 300 ml Überstand beträgt die Gesamtverarbeitungszeit ca. 9 Stunden, wenn die optionale Durchflusszytometrieprüfung von Elutionsfraktionen durchgeführt wird. Wenn die gesamte Durchflusszytometrieanalyse aufgrund des Fehlens eines Durchflusszytometers oder einer individuellen Laborpräferenz weggelassen wird, kann die Gesamtverarbeitungszeit bis zu 4 Stunden betragen. Im Allgemeinen hängt die Verarbeitungszeit von der Bedienererfahrung, der Menge der verarbeiteten Überstande und den durchgeführten Quantifizierungs- und Charakterisierungsmethoden ab.
Durchflusszytometrie wurde verwendet, um das Vorhandensein von funktionellem Gal-1hFc(d.h. Gal-1 in der Lage, seine Liganden auf Brustkrebszellen zu erkennen) in der Ausgangszellkultur Überstand zu testen; Frischzellenkulturmedium diente als Negativkontrolle18,22 . Sobald Gal-1hFc in der Zellkultur überstandungsmittel überprüft wurde (Abbildung 3A), wurde die Belastung des Proteins A Membranadsorber durch überstande Perfusion bei 10 ml/min (was zu oberflächlicher Geschwindigkeit oder Volumenfluss von 0,5 cm/min in einem 2 ml Membranadsorber) mit einer Spritzenpumpe durchgeführt(Abbildung 1). Der Membranadsorber erfasste und behielt Gal-1hFc effizient, wodurch der Durchfluss durch Gal-1hFc im Wesentlichen erschöpft blieb (mangels Durchbruch, Abbildung 3A). Gal-1hFc wurde aus dem Membranadsorber in einem Milliliter-Inkrement bei 1 ml/min (Volumenfluss = 0,05 cm/min) mit einem aminbasierten sauren Puffer (pH 2.8) eluiert und anschließend neutralisierte Elutionsfraktionen auf das Vorhandensein einer funktionellen Gal-1hFc mittels Durchflusszytometrie getestet (Abbildung 3B). Das Gal-1hFc-Signal erhöhte sich sequenziell von Elution 1 (ungefähr gleich Negativkontrolle) auf ein Maximum bei Elution 3, verringerte sich dann auf ein nahezu konstantes Niveau bei den Elutionen 9 und 10 (Abbildungen 3B und 3C). Die endgültige Elution 10 erreichte aufgrund einer gewissen Adsorber-Retention von Gal-1hFc(Abbildungen 3B und 3C) keine Äquivalenz zum negativen Kontrollsignal. Dieser Verlust wurde jedoch als akzeptabel erachtet. Als alternative Methode, um das Vorhandensein, aber nicht die Funktion von Gal-1hFc in verschiedenen Lösungen zu testen, kann eine Durchflusszytometrieanalyse der Fähigkeit von Gal-1hFc verwendet werden, sich an Protein A-Polystyrolperlen (durch Erkennung der hFc-Region) zu binden (Abbildung 3D).
Nach der Elutionsfraktionsprüfung wurden die Gal-1hFc-positiven Elutionen 2 bis 10 konzentriert und dann gegen DPBS dialyziert, um gereinigtes Gal-1hFc im gewünschten Puffer zu erhalten. Die Quantifizierung und Charakterisierung des gereinigten Gal-1hFc erfolgte in einem western blotting Verfahren, das durch semidry transfer und vakuumgestütztes Immunoblotting beschleunigt wurde. Durch den Vergleich des Gal-1hFc-Signals mit hFc-Quantifizierungsstandards wurden sowohl die Menge als auch die Qualität des gereinigten Materials ermittelt (Abbildungen 4A-C). Die Signalintensitäten von hFc-Standardbändern (ein Band bei je 25 kDa in Abbildung 4A, Bahnen 1-5) waren linear mit der vorhandenen Menge an hFc verbunden (Abbildung 4C). Gal-1hFc (ein Band bei 40 kDa in Abbildung 4A, Spur 6) und degradierte Gal-1hFc (ein Band bei 40 kDa und ein Band bei 25 kDa in Abbildung 4A, Spur 7) Signale lagen innerhalb des Normungsbereichs(Abbildung 4A, Bahnen 1-5). Die Konzentration des gereinigten Gal-1hFc (Abbildung 4A, Spur 6) auf der Grundlage von hFc wurde durch Bildverarbeitung auf 450 g/ml festgelegt (Abbildung 4C). Bereinigt um das Molekulargewicht von Gal-1hFc betrug die Konzentration des gereinigten Materials 720 g/ml. Im Gegensatz dazu wurde zu viel gereinigtes Gal-1hFc in die Bahnen 6 und 7 des Westerns in Abbildung 4Bgeladen, die Signale erzeugten, die den hFc-Normbereich sättigten oder übertrafen, wodurch eine Quantifizierung verhindert wurde. Alternativ zur westlichen Fleckenbildung kann Coomassie Gelfärbung21 als schnelle Qualitätskontrolle und/oder Quantifizierungsmethode dienen (Abbildung 4D). Beachten Sie, dass in der degradierten Gal-1hFc-Probe ein Band von 10 kDa vorhanden war (Abbildung 4D, Spur 2). Dieses Band ist degradiert Gal-1hFc, die nicht reaktiv mit dem Nachweis Antikörper in westlichen Flecken verwendet war (Abbildungen 4A und 4B).
Nach der Quantifizierung und endifinierender Charakterisierung des gereinigten Gal-1hFc wurde steriles BSA hinzugefügt, um eine endgültige BSA-Konzentration von 0,5% zu erreichen. Das gereinigte Material wurde dann aliquoted und bei -20 oC gelagert. Zusätzlich zu Gal-1hFc haben wir dieses gestraffte Protokoll verwendet, um Doppelmutanten Gal-1hFc und Gal-7hFc zu isolieren. Es kann auch auf praktisch jedes Molekül erweitert werden, das ein Fc-Fragment besitzt (Antikörper, Fc-Fragmente selbst, andere Fc-Fusionsproteine, etc.von Arten und Isotypen, die Affinität zu Protein A14-17haben).
Abbildung 1. Schemat der Versuchsvorrichtung. Antikörper und rekombinante Fusionsproteine, die Fc-Fragmente von IgG exemitenzieren, können aus verdünnten Lösungen mit einem Protein-A-Membranadsorber isoliert werden. Der Membranadsorber wird über ein Luer-Schloss mit einer 30 ml Spritze auf einer Spritzenpumpe verbunden, das die proteinhaltige Lösung durch das Membranadsorber bei einer gewünschten Volumendurchflussrate durchdringt.
Abbildung 2. Prozessablauf zur Isolierung von Gal-1hFc vom Zellkulturüberstand. Dieses Flussdiagramm veranschaulicht das Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung eines chimermurischen murinen Galektin-1/menschlichen Fc-exzierenden Fusionsproteins (Gal-1hFc) aus Zellkulturüberstand. Im Allgemeinen variiert die Verarbeitungszeit je nach Bedienererfahrung, Menge der verarbeiteten Überstande und der verwendeten Quantifizierungs- und Charakterisierungsmethoden.
Abbildung 3. Durchflusszytometrieanalyse von Gal-1hFc-haltigen Lösungen. Die Durchflusszytometrie wird verwendet, um zu beurteilen, ob funktionelles Gal-1hFc in dem Medium der Frischzellkultur, dem Zellkulturüberstand, dem Membranadsorberdurchfluss und den Elutionsfraktionen vorhanden ist. APC-konjugierte F(ab')2 antihuman fc wurde als sekundärer Antikörper verwendet. Alle Daten wurden mit einem FACS Aria Special Order Research Product Flow Cytometer/Sorter erfasst und mit der FlowJo-Software analysiert. Marker in jedem Histogramm stellen 2% der negativkontrollischen Population dar(d. h. Das Medium der Frischzellenkultur für (A) und der hFc-Isotyp für (B)). (A) Durchflusszytometrie-Histogramm-Overlay von BT-20-Brustkrebszellen, die mit frischem Zellkulturmedium (rot), Zellkulturüberstand (blau) oder Membranadsorber gekennzeichnet sind (grün). Zellkultur-Überstand enthielt ein niedriges Niveau der funktionellen Gal-1hFc, die erfolgreich an Galectin-1 Liganden auf BT-20-Zellen gebunden, während die frische Zellkultur Medium und Membran Adsorber durch fehlte Gal-1hFc, wie erwartet. (B) Durchflusszytometrie Histogramme von BT-20-Zellen, die mit Elutionsfraktionen aus dem Membranadsorber gekennzeichnet sind. Das Gal-1hFc-Signal an den BT-20-Zellen steigt bei Elution 4 sequenziell auf ein Maximum an, verringert sich dann, wenn auch nicht auf Hintergrundniveau(d. h. Signaläquivalent zu Frischzellenkulturmedium). (C) Die mittleren Fluoreszenzintensitäten der Proben in (B) können auch als Funktion der Elutionsfraktionszahl dargestellt werden, um eine Elutionskurve zu erzeugen. Die mittlere Fluoreszenzintensität von Zellen, die mit der hFc-Isotypsteuerung beschriftet sind, wird als Referenzlinie dargestellt. (D) Alternativ kann die Strömungszytometrieanalyse von Gal-1hFc, die an Protein A-Polystyrolperlen gebunden ist, verwendet werden, um die Proteinpräsenz, aber nicht die Funktion in verschiedenen Lösungen zu testen. APC-konjugierte F(ab')2 antihuman fc wurde als sekundärer Antikörper verwendet. Links: Flow Cytometry Histogramm-Overlay des Frischzellenkulturmediums (rot), Zellkulturüberstand (blau) und Leere Pufferprobe (grün). Mitte: Histogramm der hFc-Isotypkontrolle. Inkubation mit 10 mg/ml hFc ist eine positive Kontrolle für den Protein-A-Capture. Rechtes Panel: Histogramm des Proteins A Perlen mit gereinigtem Gal-1hFc inkubiert, auf der Grundlage von 10 mg hFc/ml. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.
Abbildung 4. Quantifizierung und Charakterisierung von Gal-1hFc mit Western Blotting und Bildanalyse. (A) Die Bahnen 1-5 sind hFc-Normen von 0,1-0,5 g in Schritten von 0,1 g, und die Bahnen 6 und 7 sind gal-1hFc aus zwei verschiedenen Produktionspartien gereinigt. Die Proben wurden von SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen auf einem 4-15% TGX-Gel gelöst und dann unter diskontinuierlichen Übertragungsbedingungen auf die PVDF-Membran übertragen. Die Membran wurde mit Anti-hIgG-AP mit einer vakuumunterstützten Immunoblotting-Technik blockiert und inkubiert. Signale wurden mit ECL-Reagenz entwickelt und auf einem Bio-Rad ChemiDoc XRS-Imager visualisiert. Die Signale für hFc-Standards in den Bahnen 1-5 variierten linear (in (C)) geplottet), und die Signale für die beiden gereinigten Gal-1hFc-Proben in den Bahnen 6 und 7 lagen innerhalb des linearen Messbereichs. Lane 7 zeigt zwei Bänder, Gal-1hFc und vermutlich hFc-Fragment, was auf eine Verschlechterung des Proteins hindeutet. (B) Wenn zu viel gereinigtes Gal-1hFc geladen wird, kann das Signal den linearen Signalbereich sättigen oder überschreiten, wodurch eine Quantifizierung verhindert wird (Bahnen 6 und 7). Lanes, Gel und Laufbedingungen sind die gleichen wie in (A). (C) Die Image Lab-Analysesoftware ermöglicht die Eingabe bekannter absoluter Mengen von hFc-Standards aus einem Immunoblot und bestimmt dann die Menge des unbekannten Bandes durch sein Signal relativ zur linearen Regression von Standards (y = 1,36 x 10-7*x + 0,105; R2 = 0,95). Die gezeigten Daten stammen aus der Analyse des Immunoblots in (A). (D) Die Qualität der gereinigten Gal-1hFc kann mit Coomassie-Färbung beurteilt werden. Spur M ist ein Molekulargewicht Marker, Spur 1 ist gereinigt Gal-1hFc (gleiche Probe wie Spur 6 in (A) und (B)), Spur 2 ist gradriert Gal-1hFc (gleiche Probe wie Spur 7 in (A) und (B)), und Spur 3 ist 0,2 mg hFc Standard. Gel- und Laufbedingungen waren die gleichen wie in (A) und (B). Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.
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Discussion
Das hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um ein chimäres Fusionsprotein, das den menschlichen Fc (Gal-1hFc) exzeichnet, schnell zu isolieren und zu charakterisieren, ohne die Produktrückgewinnung oder die Aufblähungskosten erheblich zu beeinträchtigen. Die wichtigsten Komponenten des optimierten Workflows sind ein Protein-A-Membranadsorber für die Isolierung sowie semidry transfer und vakuumunterstütztes Immunoblotting zur Charakterisierung durch Western Blotting.
Die dramatische Verkürzung der Verarbeitungszeit für die Isolierung und Charakterisierung von Gal-1hFc von 300 ml Zellkulturüberstand (ca. 9 Stunden im gestrafften Protokoll im Vergleich zu 20+ Stunden in einem herkömmlichen Protokoll) ist weitgehend auf die Einbeziehung der oben genannten Schlüsselkomponenten, insbesondere des Membranadsorbers, zurückzuführen. Bei der maximal empfohlenen Durchflussrate von 10 ml Überstand/min kann die Membranadsorberbelastung in 30 min abgeschlossen werden. Gal-1hFc-Recovery von Protein A Membranadsorber reichen in der Regel von 10-30% in unseren Laboren, mit 30% Erholung routinemäßig von erfahrenen Laborpersonal erreicht, wennGal-1hFc-Konzentrationen in Zellkultur Überstand sind 5-10 mg/ml. Höchstens eine Erholung von 50 % wurde erreicht. Eine vollständige Produktrückgewinnung ist aufgrund von inhärenten Verlusten aufgrund (a) spezifischer Retention des Fc-exemittierenden Proteins durch Protein A auf dem Membranadsorber(Abbildungen 3B und 3C) und (b) unspezifischer Oberflächenadsorption des Proteins während der gesamten Isolierung praktisch unmöglich. Es ist wichtig, dass einzelne Labore feststellen, ob die Produktwiederherstellung mit einem Membranadsorber je nach Bedarf akzeptabel ist. wenn eine Änderung der Ladedurchflussrate oder des Rohstoffgehalts(z. B. gewünschter Proteinzellkonzentrationskulturüberstand, der besonders schwierig sein kann) die Produktrückgewinnung verbessern kann8, oder wenn eine Änderung des Elutionsprotokolls (Schritt 4) zur Erzielung einer höheren Rückgewinnung die erhöhte Zeit, den Aufwand und den Aufwand oder den möglichen Schaden für den Protein- oder Membranadsorber selbst wert ist (hauptsächlich durch Elutionspuffer pH, Salzkonzentration usw.). Im Gegensatz zur Verwendung des Membranadsorbers dauert es etwa 10 Stunden, um zwei Perfusionszyklen durch eine 1 ml-Protein-A-Perlensäule18bei einer maximal tolerierbaren Durchflussrate von 1 ml/min durchzuführen, und nur 10-20% Gal-1hFc wird in der Regel zurückgewonnen. Als letztes Problem kann eine Kostenanalyse für Protein-A-Perlen verschiedener Hersteller die Entscheidung beeinflussen, eine Standard-Perlensäule im Vergleich zu einem einzelnen Membranadsorber zu verwenden. Unter Berücksichtigung all dieser Faktoren kann die Verwendung eines Membranadsorbers zur Isolierung von Fc-exemittierenden Proteinen im Labormaßstab kleine Vorteile gegenüber der Säulenchromatographie2,5,8,10bieten.
Die Verwendung eines Minigels für SDS-PAGE, die semidry diskontinuierliche elektrophoretische Übertragung von Proteinen vom Gel auf die PVDF-Membran und die vakuumunterstützte Immunoblotting bieten erhebliche Zeitersparnis im Vergleich zu Midi-Gelen, Tank-(Nass-)Transfer und diffusionsbasierter Immunfärbung zur Quantifizierung und Charakterisierung von Gal-1hFc (2 Std. versus 8 Stunden). Einzelne Labore müssen feststellen, ob das beschleunigte western-Protokoll für die Quantifizierung und Charakterisierung ihres Proteins geeignet ist. Zu den Vorteilen gehören (a) kurze Zeit bis zur Fertigstellung auch von unerfahrenem Laborpersonal, (b) die Fähigkeit, festzustellen, ob das Protein intakt ist oder aufgrund von Verarbeitung oder Kontamination abgebaut wurde (Abbildung 4B), und (c) relative Leichtigkeit der Quantifizierung durch Bildverarbeitungsprogramme (Abbildung 4C). (a) erhöhte Reagenzien- und Verbrauchsmaterialkosten können jedoch trotz des Zeitversatzes für Löhne nicht akzeptabel sein, (b) die traditionelle Proteinquantifizierung durch A280, ELISA, Bradford-Assay oder BCA-Assay kann bevorzugt werden23-27, oder (c) Labore haben möglicherweise keinen Zugang zu einem semitrockenen Blotter oder einem vakuumunterstützten Proteinnachweissystem für Immunoblotting. In solchen Fällen sind Coomassie-Färbungen von SDS-PAGE gelösten Proteinen21(Abbildung 4D) oder Dot- oder Slot-Blotting28 gute Alternativen.
Die Durchflusszytometrie wurde in drei separaten 90-min-Tests zum Nachweis von funktionellem Gal-1hFc in diesem gestrafften Protokoll (Abbildung 2) verwendet, was der gleichen ist wie bei der herkömmlichen Verarbeitung18,22. Jede andere Charakterisierungsmethode wie Western Blotting oder ELISA wäre ebenfalls akzeptabel. Funktionelle Assays sind optimal(z.B. Nachweis von Galectin-1-Liganden an Brustkrebszellen, Abbildungen 3A-C). Alternativ wäre die Detektion der Fc-Einheit akzeptabel (ähnlich wie in Abbildung 3D), aber die Beibehaltung der spezifischen Funktion des Proteins kann nicht auf diese Weise bestimmt werden, was einen potenziell erheblichen Nachteil darstellt.
Die hier beschriebenen Methoden wurden zur schnellen Isolierung und Charakterisierung eines chimerFusionsproteins verwendet, das den menschlichen Fc (Gal-1hFc) exzessient. Dieser optimierte Workflow kann auf die Isolierung praktisch jedes Moleküls angewendet werden, das ein Fc-Fragment besitzt (IgG-Antikörper, andere Fc-Fusionsproteine, Fc-Fragmente selbst, etc.)und kann leicht auf der Grundlage individueller Laborpräferenzen modifiziert werden. Darüber hinaus ist dieses Protokoll relativ schnell und einfach, selbst für begrenzte Erfahrung oder völlig unerfahrenes Laborpersonal, so dass es für den Einsatz in High School oder College Biologie, Chemie und (Bio-)Chemie-Engineering-Kurse geeignet ist, die Prinzipien der Proteinisolation und Charakterisierung abdecken.
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Disclosures
Es gibt nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Herrn Luis F. Delgadillo (Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Ohio University), Herrn Matthew H. Williams (Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Ohio University) und Dr. Filiberto Cedeno-Laurent (Brigham and Women es Hospital und Harvard Medical School) für die technische Unterstützung von Experten. Die Autoren danken auch den Studenten des Winter 2011 CHE 404/BME 504 und des Herbst 2012 CHE 4830/BME 5830 (Department of Chemical and Biomolecular Engineering and Biomedical Engineering Program, Ohio University) für technische Beratung und Diskussion. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Major Research Instrumentation Grant CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Dermatology Foundation Research Grant A050422 (SRB), National Institutes of Health (NIH) NCI Grant 1R15CA1 61830-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Postdoktorandenstipendium F32CA144219-01A1 (SRB), NIH/NCI R01CA173610 (CJD) und NIH NCCAM-Stipendium R01AT004628 (CJD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml) | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12--A | |
| Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml | Millipore | UFC801008 | Use 15 ml volume if needed |
| Sterile vacuum filter unit, 0.22 µm, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| 10 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 301604 | |
| 30 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 309650 | |
| Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft) | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
| Snap i.d. antibody collection tray | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap i.d. single well blot holder | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| Elution buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris, ultra pure | Fisher Scientific | 819623 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS with Ca2+/Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Human Fc | Bethyl Research Laboratories | P80-104 | |
| Anti-human Fc-APC | Jackson Immunoresearch | 109136170 | |
| Anti-human Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| Alkaline phosphatase substrate | Promega | S3841 | |
| Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene) | BD | 352054 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 55-2226 | A peristaltic pump is also acceptable |
| Protein gel electrophoresis system | Bio-Rad Laboratories | 552BR094876 | Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest |
| Semidry blotter | Bio-Rad Laboratories | 690BR006163 | Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest |
| SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system | EMD Millipore | WBAVDBASE | An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well |
References
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