Summary
בהשוואה לכרומטוגרפיה מסורתית של זיקה באמצעות חלבון עמודים עמוסי חרוזים A, חלבון ספיחה קרום A יכולה להאיץ באופן משמעותי בידוד בקנה מידה מעבדתי של נוגדנים וחלבונים אחרים המבטאים שברי Fc. שיטות ניתוח וכימות מתאימות יכולות להאיץ עוד יותר את עיבוד החלבון, ולאפשר השלמת בידוד/אפיון ביום עבודה אחד, במקום 20+ שעות עבודה.
Abstract
סולם מעבדה לטיהור בקנה מידה תעשייתי של biomolecules מתרבות התא supernatants ופתרונות תאים lysed ניתן להשיג באמצעות כרומטוגרפיה זיקה. בעוד כרומטוגרפיה זיקה באמצעות חלבון נקבובי חרוזי agarose ארוזים בעמודים היא ללא ספק השיטה הנפוצה ביותר של בידוד בקנה מידה מעבדה של נוגדנים וחלבונים רקומביננטיים המבטאים שברי Fc של IgG, זה יכול להיות תהליך זמן רב ויקר. מגבלות זמן ופיננסים מרתיעות במיוחד במעבדות מדע בסיסיות קטנות שחייבות לשחזר מאות מיקרוגרם לכמויות מיליגרם של חלבון מפתרונות מדוללים, אך חסרות גישה למערכות אספקת נוזלים בלחץ גבוה ו/או כוח אדם עם מומחיות בביו-ספרות. יתר על כן, כימות ואפיון המוצר עשוי גם להאריך יתר על המידה את זמן העיבוד על פני מספר ימי עבודה ולנפח הוצאות (חומרים מתכלים, שכר וכו '). לכן, פרוטוקול מהיר, זול, אך יעיל נדרש לבידוד בקנה מידה מעבדה ואפיון של נוגדנים וחלבונים אחרים בעלי שבר FC. למטרה זו, פיתחנו פרוטוקול שניתן להשלים על ידי צוות טכני בעל ניסיון מוגבל בפחות מ 9 שעות (בערך יום עבודה אחד) ובמהירות של 4 שעות, בניגוד לשיטות מסורתיות הדורשות 20 + שעות עבודה. רוב הציוד הנדרש זמין בקלות במעבדות הנדסה ביו-רפואית סטנדרטיות, ביוכימיה ו(ביו), וכל ריאגנטים זמינים מסחרית. כדי להדגים פרוטוקול זה, מוצגות תוצאות מייצגות שבהן כימרי מורין galectin-1 התמזגו Fc האנושי (Gal-1hFc) מתרבות התא supernatant היה מבודד באמצעות חלבון ספיחה קרום A. גל-1hFc מטוהרת כובתה באמצעות הליך ניתוח כתמים מערבי מזורז והתאפיינה באמצעות ציטומטריית זרימה. ניתן לשנות את זרימת העבודה היעילה עבור חלבונים אחרים המבטאים Fc, כגון נוגדנים, ו/או לשנות אותה כך שישלבו שיטות כימות ואפיון חלופיות.
Introduction
בידוד של נוגדנים וחלבונים רקומביננטיים המבטאים שברי אימונוגלובולין G (IgG) Fc מתרבות התאים supernatants ופתרונות תאים מדוללים lysed ניתן להשיג באמצעות חלבון כרומטוגרפיה זיקה. במעבדות ובתעשייה בסיסיות של מדע והנדסה, עמודים עמוסים בחלבון נקבובי A מצופה agarose, זכוכית, או חרוזים פולימריים משמשים בדרך כלל עבור כרומטוגרפיה זיקה, למרות עלויות כספיות גבוהות וזמני עיבוד ארוכים1-3. זה מוערך היטב כי כרומטוגרפיה זיקה מייצגת את ההוצאה הגדולה ביותר ועיבוד צוואר בקבוק הן במעבדה והן בהגדרות תעשייתיות2,4. כתוצאה מכך, שיפורים רבים פותחו כדי להקטין את עלות זמן העיבוד מבלי להקריב את התאוששות המוצר הכוללת מרכבת התהליך1,2,5-7. מבטיח במיוחד לבידוד של נוגדנים וחלבונים אחרים מבטא Fc הוא כרומטוגרפיה זיקה באמצעות חלבון ספיחה קרום2,5,7-10. בעוד לכידת Fc ב chromatography עמודה הוא דיפוזיה מוגבלת(כלומר Fc-expressing חלבון חייב להתפזר לתוך ובאמצעות נקבוביות פנימיות כדי להגיע לרוב החלבון A) עם ירידה בלחץ גבוה על פני העמודה, הסעת המונים ספיחה ממברנה מונעת על ידי הסעה בתפזורת, וכתוצאה מכך הימנעות מגבלות דיפוזיה8,9,11,12. בנוסף, ירידה בלחץ על פני ספיחה ממברנה נמוכה, ובכך מאפשר קצב זרימת זלוף מהיר יותר לעומת עמודים ארוזים חרוזים8,9,11,12. לכן, עבור בידוד בקנה מידה מעבדה, כרומטוגרפיה קרום צפוי להפחית את זמן הבידוד על ידי מספר שעות ולהגדיל את לכידת המוצר לעומת כרומטוגרפיה עמודה. יתר על כן, מודלים מתמטיים עבור ספיחה IgG ספיחה ממברנה הוצעו8,9,11,12, ובכך מאפשר למשתמשי קצה לחזות ביצועים במעבדה.
צוואר בקבוק נוסף במעבדות מדע והנדסה בסיסיות הוא אפיון החלבון המבטא Fc. עם זאת, בחירת שיטות מתאימות להשלמת מבחני אפיון, כגון כתמים מערביים, יכולה להפחית מאוד את הזמן המושקע בבדיקות מוצרים. לדוגמה, העברה חלקית במערכת חיץ רציפה יכולה להשיג העברה אלקטרופורטית של חלבונים מג'ל SDS-PAGE לקרום פוליוויניל דיפלוורידין (PVDF) תוך דקות ספורות, לעומת העברה של שעה-שעתיים במיכל (רטוב) במערכת חיץ רציפה13.
פרוטוקול מהיר, זול ויעיל לבידוד ואפיון של חלבון היתוך כימרי המבטא שבר FC של IgG אנושי מתואר בזאת. רוב הציוד זמין בקלות במעבדות הנדסה ביו-רפואית בסיסיות סטנדרטיות, ביולוגיה, כימיה ו(ביו), וכל ריאגנטים זמינים מסחרית. למרות שתוצאות מייצגות נוצרו מבידוד ואפיון של חלבון היתוך כימרי של Murine galectin-1/Human Fc (Gal-1hFc), ניתן להחיל את הפרוטוקול היעיל על בידוד של מולקולות אחרות בעלות שבר Fc, כגון נוגדנים, שברי Fc עצמם, או חלבוני היתוך Fc אחרים. השיפורים שלנו הפחיתו באופן דרמטי את זמן העיבוד (עד 4 שעות אך בדרך כלל ~ 9 שעות, לעומת 20 + שעות עבודה) תוך השגת התאוששות מוצר דומה או משופרת בהשוואה לשיטות סטנדרטיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. אמת את הזיקה לחלבון A
- ודאו שהחלבון המבטא Fc (חלבון היתוך רקומביננטי או נוגדן IgG, עד כה המכונה "חלבון") יש זיקה מקובלת לחלבון A14-17 לפני השימוש בחלבון ספיחה קרום A, ולבדוק את נוכחות החלבון בתמיסת המלאי (למשל, תרבות התא supernatant הובהר על ידי צנטריפוגה ב 1,000 x g במשך 5 דקות כדי גלולה תאים מושעים). השתמש ציטומטריה זרימה, סופג המערבי, ELISA, וכו '. כדי לזהות תפקוד חלבון ו/או נוכחות של Fc, בהתבסס על העדפת המעבדה. באופן אידיאלי, לכמת את החלבון בתרבית התא supernatant (שלב 6) כדי למנוע חריגה חלבון קיבולת ספיחה קרום. המשך אם מתגלה חלבון.
2. הכן חלבון ספיחה קרום ותרבות תאים Supernatant
- בצע את הוראות היצרן להכנת ספיחה ממברנה. לעולם אל תיתן לאוויר להיכנס לספינת הממברנה. כל הפתרונות perfused דרך ספיחה ממברנה צריך להיות בטמפרטורת החדר מסונן מראש באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. מלא מזרק 10 מ"ל עם 0.22 מיקרומטר מסונן פוספט של פוספט אגירה מלוחים (DPBS) או מאגר של בועות אוויר בחירה ופריקה. לעיין DPBS כדי להסיר את פתרון האחסון כדי לייצב את ספיחה קרום מיד לפני השימוש.
- לסנן את תרבות התא supernatant מיד לפני זלוף דרך ספיחה קרום, באמצעות יחידת סינון סטרילי 0.22 מיקרומטר מונחה ואקום.
3. לטעון את החלבון ספיחה קרום
- לשאוף את תרבות התא supernatant לתוך מזרק לואר לוק (30 מ"ל או יותר), ולפרוק כל בועות אוויר.
- אספו חומרים וציוד כפי שמוצג באיור 1. חבר את המזרק למפרצון של ספיחה ממברנה. חבר צינורות גמישים לשקע ספיחה ממברנה. אם תרצה, למקם מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר בין המזרק לבין ספיחה קרום. השתמש בקבוק או בקבוק כדי לתפוס זרימה דרך (הידוע גם בשם סינון), מן הספייחה.
- הגדר את משאבת המזרק לקצב הזרימה הנפחי הרצוי, אך אל תחרוג מקצב הזרימה המומלץ של היצרן (למשל 10מ"ל לדקה). לחלחל את תרבות התא supernatant דרך ספיחה קרום, איסוף זרימה דרך בכומתה או מיכל אחר. טען מחדש את המזרק עם supernatants צורך.
- אם תרצה, בדוק את הזרימה דרך נוכחות של חלבון באמצעות cytometry זרימה, סופג מערבי, ELISA, וכו '. בהתבסס על העדפת המעבדה. זה בדרך כלל מיותר כדי reperfuse את הזרימה דרך.
4. חלבון אלוט מסופג הממברנה
- לשטוף את ספיחה ממברנה עם 10 מיליליטר DPBS כדי להסיר כל חלבון שאינו מאוגד.
- חלבון אלוט מספח הממברנה בקצב הזרימה הרצוי (למשל 1מ"ל /min) באמצעות 10-15 מ"ל של מאגר אלוטיון(למשל מאגר אלוציה מבוסס אמין (pH 2.8)). לתפוס eluate בצינור המכיל חיץ נטרול(למשל 1 M Tris (pH 9.4)) ב 10% של נפח elution (1.0-1.5 מ"ל).
- לחלופין, חלבון elute במרווחים מיליליטר אחד לתוך צינורות המכילים 100 μl של חיץ נטרול, באמצעות נפח כולל של 10-15 מיליליטר מאגר elution. השתמש בשיטת האפיון המועדפת כדי לבדוק כל שבר לנוכחות של חלבון.
- לחדש את ספיחה קרום על פי הוראות היצרן. לחלחל 10 מיליליטר של 0.22 מיקרומטר מסונן DPBS או מאגר של בחירה, אז 10 מיליליטר של 0.22 מיקרומטר מסונן 50 מ"מ NaOH ב 1 N NaCl, ולבסוף 10 מיליליטר של 0.22 מיקרומטר מסונן DPBS. מלאו את ספיחה הממברנה ב-20% אתנול ב-DPBS לאחסון ארוך טווח ב-4 מעלות צלזיוס.
5. לרכז ולדיאליז את החלבון
- להפקיד את כל eluate (או שברי elution המכיל חלבון כפי שנקבע בשלב 4.3) ביחידת 10 kDa משקל מולקולרי מנותק צנטריפוגלי מסנן. בצע את הוראות היצרן לצנטריפוגה.
- דיאליזה retentate ביחידת דיאליזה נפח קטן (10 kDa משקל מולקולרי מנותק) נגד המאגר של בחירה, בעקבות הוראות היצרן. ייתכן שיהיה צורך להוסיף מאגר לחומר דיאליזה אם משקעים בחלבון הם דאגה. אם תרצה, ניתן יהיה לשמור בקירור את החומר המחודד עד שניתן יהיה לבצע את שלב 6, אך אחסון לטווח ארוך ללא חומרים משמרים אינו מומלץ.
6. לכמת ולאפיין מוצר מטוהר בהליך בלום מערבי מזורז
- פתור חלבונים מטוהרים ותקני Fc על הג'ל המועדף על ידי SDS-PAGE, בתנאים מפחיתים או לא מרוקנים לפיהצורך 18-20. השתמש ג'ל מיני ולא midi ג'ל כדי למזער את זמן הריצה.
- אם עדיין לא ידוע, קבעו את טווח הסטנדרטים של Fc מעל איזה אות פס משתנה באופן ליניארי ביחס לכמות הטעונים (למשל 0.1-1 מ"ג). השתמש באותו ג'ל, תנאי ריצה, תנאי העברה, ריאגנטים שישמשו לכימות ואפיון חלבון מטוהר.
- טען כמויות מדגם מרובות של חלבון מטוהר, כולל דגימות מדוללות עם DPBS, כדי להבטיח כי אותות רצועת חלבון מטוהרים נמצאים בטווח האותות הליניארי של תקני Fc בניתוח תמונה.
- להעביר חלבונים מהג'ל לקרום פלואוריד פוליווינילידן (PVDF) במערכת חיץ רציפה באמצעות בלוטר חצי13, בעקבות הוראות יצרן הבלוטר. זמן ההעברה הוא בדרך כלל 5-10 דקות. אם תרצה, קומאסי כתם את הג'ל לאחר ההעברה כדי לאמת את יעילות ההעברה21.
- בצע immunoblotting עם אנטי Fc או אנטי IgG מצומד אלקליין phosphatase (AP) או חמצן צנון סוס (HRP), בהתבסס על העדפת המעבדה, באמצעות מערכת לגילוי חלבון בסיוע ואקום. זמן חיסון הוא בדרך כלל פחות משעה.
- לפתח immunoblot באמצעות המצע ואת השיטה של בחירה(למשל מצע AP ו chemiluminescence משופרת).
- לכמת חלבון מטוהר על ידי ניתוח תמונה. בצע רגרסיה ליניארית באותות הלהקה מהסטנדרטים של Fc. אם R2>0.90, השתמש במשוואה עבור הקו כדי לחשב כמות חלבון מאותות הרצועה שלו. תסביר דילול לדוגמה במידת הצורך. מאז כימות החלבון מבוצע על בסיס Fc, להתאים את הערך עבור הבדלי משקל מולקולרי בין החלבון Fc. אם R2<0.90, לחזור על שלב 6 בשלמותו.
- לאמת חלבון באמצעות מבחנים פונקציונליים או שיטות כדי לזהות Fc באמצעות cytometry זרימה, סופג מערבי, ELISA, וכו '. בהתבסס על העדפת המעבדה.
- לדלל חלבון לריכוז הרצוי ו/או להוסיף חומרים משמרים או מייצבים רצויים לתמיסת החלבון המטוהר לפני ההזנה לאחסון ארוך טווח, קפוא או אחר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול היעיל לבידוד ואפיון חלבוני Fc-expressing משמש באופן שגרתי לעיבוד גלקטין-1 של מורין כימרי מותך ל- Fc האנושי (Gal-1hFc) מתרבות תאים מדוללת. תרשים הזרימה באיור 2 מדגים את זרימת העבודה והזמן עבור כל שלב בפרוטוקול. עבור אצווה טיפוסית של 300 מ"ל של supernatant, זמן העיבוד הכולל הוא כ 9 שעות כאשר הבדיקה cytometry זרימה אופציונלית של שברי elution מבוצעת. אם כל ניתוח cytometry זרימה מושמט, בשל חוסר סיטומטר זרימה או העדפת מעבדה בודדת, זמן העיבוד הכולל יכול להיות קצר כמו 4 שעות. באופן כללי, זמן העיבוד תלוי בחוויית האופרטור, בכמות העיבוד העל-טבעי ובאיזו שיטות כימות ואפיון מבוצעות.
Cytometry זרימה שימש כדי לבדוק את נוכחותו של Gal-1hFc פונקציונלי(כלומר Gal-1 מסוגל לזהות ligands שלה על תאים סרטניים בשד) בתרבות התא ההתחלתי supernatant; מדיום תרבות התא הטרי שימש כשליטה שלילית18,22 . לאחר ש-Gal-1hFc בתרבית התאים אומת(איור 3A),טעינת החלבון ספיחה קרום A הושגה על ידי זלוף על-טבעי במהירות של 10 מ"ל לדקה (וכתוצאה מכך מהירות שטחית או שטף נפחי של 0.5 ס"מ/דקה בספיחה של 2 מ"ל ממברנה) באמצעות משאבת מזרק(איור 1). ספיחה ממברנה נתפס ביעילות ושמר Gal-1hFc, עוזב את הזרימה דרך מדולדל במהותו של Gal-1hFc (חוסר פריצת דרך, איור 3A). Gal-1hFc הושטף מספסר הממברנה במרווחים של מיליליטר אחד במהירות של 1 מ"ל לדקה (שטף נפחי = 0.05 ס"מ/דקה) באמצעות חיץ חומצי מבוסס אמינים (pH 2.8), ושברי אלוטיון מנוטרלים נבדקו לאחר מכן לנוכחות של Gal-1hFc פונקציונלי באמצעות ציטומטריית זרימה(איור 3B). אות Gal-1hFc עלה ברצף מאלוטיון 1 (בערך שווה לשליטה שלילית) למקסימום ב elution 3, ולאחר מכן ירד לרמה כמעט קבועה ב elutions 9 ו 10 (איורים 3B ו 3C). האלוציה הסופית 10 לא הגיעה לשוויון לאות הבקרה השלילי בשל שימור ספיחה כלשהו של Gal-1hFc(איורים 3B ו-3C). עם זאת, הפסד זה נחשב מקובל. כשיטה חלופית לבדיקת נוכחות, אך לא פונקציה, של Gal-1hFc בפתרונות שונים, ניתן להשתמש בניתוח ציטומטריית זרימה של היכולת של Gal-1hFc להיקשר לחלבון חרוזי פוליסטירן A (באמצעות זיהוי אזור hFc) (איור 3D).
לאחר בדיקות שבר elution, Gal-1hFc חיובי elutions 2 עד 10 התרכזו ולאחר מכן dialyzed נגד DPBS כדי להשיג גל-1hFc מטוהרים במאגר הרצוי. כימות ואפיון של Gal-1hFc המטוהר בוצע בהליך סופג מערבי מזורז על ידי העברה חלקית ואימונובלוטינג בסיוע ואקום. על ידי השוואת אות Gal-1hFc לתקני כימות hFc, נקבעו הן הכמות והן האיכות של חומר מטוהר (איורים 4A-C). עוצמת האותות של להקות סטנדרטיות hFc (רצועה אחת ב~ 25 kDa כל אחת באיור 4A, נתיבים 1.5) היו קשורות באופן ליניארי לכמות hFc הנוכחית (איור 4C). Gal-1hFc (רצועה אחת ב~ 40 kDa באיור 4A, נתיב 6) ו Gal-1hFc מושפל (להקה אחת ב ~ 40 kDa ולהקה אחת ב ~ 25 kDa באיור 4A, נתיב 7) אותות היו בטווח הסטנדרטים (איור 4A,נתיבים 1-5). הריכוז של Gal-1hFc מטוהר(איור 4A, נתיב 6) על בסיס hFc נקבע להיות 450 מיקרוגרם / מיליליטר על ידי עיבוד תמונה (איור 4C). התאמת המשקל המולקולרי של Gal-1hFc, הריכוז של החומר המטוהר היה 720 גרם / מיליליטר. לעומת זאת, יותר מדי גל-1hFc מטוהר נטען בנתיבים 6 ו-7 של המערב באיור 4B, מה שיצר אותות שרוויו או חרגו מטווח תקני hFc, ובכך מנעו כימות. חלופה לבליטה מערבית, כתמי ג'ל קומאסי21 יכולים לשמש כשיטת בדיקת איכות ו/או כימות מהירה (איור 4D). שים לב כי להקה ~ 10 kDa, בנוסף להקות ~ 25 kDa ו ~ 40 kDa, היה נוכח במדגם Gal-1hFc מושפל(איור 4D,נתיב 2). להקה זו מושפלת Gal-1hFc שלא היה מגיב עם נוגדן הגילוי המשמש כתמים מערביים (איורים 4A ו 4B).
לאחר כימות ואפיון סופי של Gal-1hFc המטוהר, BSA סטרילי נוסף כדי להשיג ריכוז BSA סופי של 0.5%. החומר המטוהר היה אז aliquoted ומאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס. בנוסף לגל-1hFc, השתמשנו בפרוטוקול יעיל זה כדי לבודד מוטנט כפול גל-1hFc וגל-7hFc. זה יכול להיות מורחב כמעט לכל מולקולה בעלת שבר Fc (נוגדנים, שברי Fc עצמם, חלבוני היתוך Fc אחרים, וכו 'שלמינים ואיזוטיפים שיש להם זיקה לחלבון A14-17).
איור 1. סכמטי של המנגנון הניסיוני. נוגדנים וחלבוני היתוך רקומביננטיים המבטאים שברי Fc של IgG יכולים להיות מבודדים מפתרונות מדוללים באמצעות סופחת קרום A חלבון. ספיחה ממברנה מחוברת באמצעות מנעול לואר מתאים מזרק 30 מ"ל על משאבת מזרק, אשר מחלחל הפתרון המכיל חלבון דרך ספיחה קרום בקצב זרימה נפחי הרצוי.
איור 2. עבד זרימת עבודה לבידוד של Gal-1hFc מתרבות התאים. תרשים זרימה זה ממחיש את הפרוטוקול לבידוד ואפיון של חלבון היתוך של מורין גלקטין-1/אדם מבטא Fc (Gal-1hFc) מתרבות התאים. באופן כללי, זמן העיבוד ישתנה בהתאם לחוויית האופרטור, כמות העיבוד העל-טבעית ושיטות הכימות והאפיון בהן נעשה שימוש.
איור 3. ניתוח ציטומטריה זרימה של פתרונות המכילים גל-1hFc. Cytometry זרימה משמש כדי להעריך אם פונקציונלי Gal-1hFc קיים בינוני תרבות התא טרי, תרבות התא supernatant, ספיחה קרום לזרום דרך, שברי elution. APC-מצומד F(ab')2 נגד האדם Fc שימש הנוגדן המשני. כל הנתונים נרכשו באמצעות סימטומטר /ממיין זרימה של מוצר מחקר מסדר מיוחד של FACS Aria ונותחו באמצעות תוכנת FlowJo. סמנים בכל היסטוגרמה מייצגים 2% מאוכלוסיית הבקרה השלילית (כלומר מדיום תרבות תאים טריים עבור (A) ו- hFc isotype עבור (B)). (א) שכבת-על של היסטוגרמה ציטומטרית זרימה של תאי סרטן השד BT-20 המסומנים במדיום תרבית תאים טריים (אדום), תרבות תאים על-טבעית (כחולה) או סופח קרום זורמים דרך (ירוק). תרבות התא supernatant הכיל רמה נמוכה של Gal-1hFc פונקציונלי כי בהצלחה מאוגדים galectin-1 ליגנדים על תאי BT-20, בעוד תרבית התא הטרי בינוני ספיחה קרום לזרום דרך חסר Gal-1hFc, כצפוי. (ב) היסטוגרמות ציטומטריה זרימה של תאי BT-20 המסומנים בשברים של התרוממות רוח מספסר הממברנה. אות Gal-1hFc בתאי BT-20 עולה ברצף למקסימום ב elution 4 ואז יורד, אם כי לא לרמת הרקע (כלומר אות שווה ערך למדיום תרבות תאים טריים). (ג) ניתן גם להתוות את עוצמות הפלואורסצנטיות הממוצעות של הדגימות ב-( B) כפונקציה של מספר שבר elution כדי ליצור עקומת התרוממות רוח. עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של תאים המסומנים בפקד isotype hFc מוצגת כקו הפניה. (ד) לחלופין, ניתוח ציטומטריה זרימה של Gal-1hFc מאוגד חלבון חרוזי פוליסטירן A ניתן להשתמש כדי לבדוק נוכחות חלבון, אבל לא לתפקד, בפתרונות שונים. APC-מצומד F(ab')2 נגד האדם Fc שימש הנוגדן המשני. משמאל: שכבת-על של היסטוגרמה ציטומטרית זרימה של מדיום תרבית תאים טרי (אדום), תרבית תאים על-טבעית (כחולה) ודגימת חיץ ריקה (ירוקה). אמצעי: היסטוגרמה של בקרת isotype hFc. דגירה עם 10 מ"ג / מיליליטר hFc היא שליטה חיובית עבור לכידת חלבון A. פאנל ימני: היסטוגרמה של חלבון חרוזים דגירה עם גל-1hFc מטוהרים, על בסיס 10 מ"ג hFc/ml. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
איור 4. כימות ואפיון של Gal-1hFc באמצעות כתמים מערביים וניתוח תמונה. (A) נתיבים 1-5 הם תקני hFc של 0.1-0.5 מיקרוגרם במרווחים של 0.1 מיקרוגרם, ונתיבים 6 ו -7 מטוהרים Gal-1hFc משני מגרשי ייצור שונים. דגימות נפתרו על ג'ל 4-15% TGX על ידי SDS-PAGE בתנאי צמצום, ולאחר מכן הועברו קרום PVDF באמצעות תנאי העברה רציפים. הממברנה נחסמה והודגרה עם אנטי hIgG-AP באמצעות טכניקה immunoblotting בסיוע ואקום. אותות פותחו עם ריאגנט ECL ו דמיינו על ביו-רד ChemiDoc XRS imager. אותות לתקני hFc בנתיבים 1-5 השתנו באופן ליניארי (התווייתם ב-C),והאותות עבור שתי דגימות Gal-1hFc המטוהרות בנתיבים 6 ו- 7 היו בטווח המדידה הליניארי. ליין 7 מציג שתי להקות, Gal-1hFc וככל הנראה שבר hFc, המציין השפלה של החלבון. (ב) אם נטען יותר מדי Gal-1hFc מטוהר, האות עשוי לרוויה או לחרוג מטווח האות הליניארי, ולמנוע כימות (נתיבים 6 ו-7). נתיבים, ג'ל ותנאי ריצה זהים ל-(A). (ג) תוכנת ניתוח מעבדת תמונות מאפשרת קלט של כמויות מוחלטות ידועות של תקני hFc מכשל חיסוני, ולאחר מכן קובעת את כמות הרצועות הלא ידועות באמצעות האות שלה ביחס לרגרסיה הליניארית של תקנים (y = 1.36 x 10-7* x + 0.105; R2 = 0.95). הנתונים המוצגים הם מניתוח של immunoblot ב (A). (ד) ניתן להעריך את איכות הגל-1hFc המטוהר באמצעות כתמי קומאסי. נתיב M הוא סמן משקל מולקולרי, נתיב 1 מטוהר גל-1hFc (מדגם זהה לנתיב 6 ב(A) ו -( B)), נתיב 2 מושפל Gal-1hFc (מדגם זהה לנתיב 7 ב (A) ו -( B)), ונתיב 3 הוא 0.2 מ"ג hFc רגיל. תנאי הג'ל וההפעלה היו זהים ל-(A)ו-(B). לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר בזאת פותח כדי לבודד במהירות ולאפיין חלבון היתוך כימרי המבטא Fc אנושי (Gal-1hFc), מבלי להתפשר באופן משמעותי על התאוששות המוצר או עלות ניפוח. המרכיבים העיקריים של זרימת העבודה היעילה הם חלבון ספיחה ממברנה לבידוד, והעברה חלקית ואימונובליקה בסיוע ואקום לאפיון על ידי סופג מערבי.
הירידה הדרמטית בזמן העיבוד לבידוד ואפיון של Gal-1hFc מ-300 מ"ל של סופרנאטנט של תרבות התאים (כ-9 שעות בפרוטוקול היעיל בהשוואה ל-20+ שעות בפרוטוקול מסורתי) מיוחסת במידה רבה לשילוב רכיבי המפתח הנ"ל, במיוחד ספיחה של הממברנה. בקצב הזרימה המקסימלי המומלץ של 10 מ"ל supernatant / min, טעינת ספיחה ממברנה ניתן להשלים תוך 30 דקות. Gal-1hFc התאוששות מחלבון ספיחה קרום בדרך כלל נע בין 10-30% במעבדות שלנו, עם ~ 30% התאוששות מושגת באופן שגרתי על ידי אנשי מעבדה מנוסים כאשרGal-1hFc ריכוזים בתרבית התא supernatant הם 5-10 מ"ג / מ"ל. לרוב, ~ 50% התאוששות הושגה. התאוששות מלאה של המוצר היא כמעט בלתי אפשרית בשל הפסדים אינהרנטיים עקב (א) שימור ספציפי של חלבון Fc-expressing על ידי חלבון A על ספיחה קרום (איורים 3B ו 3C)ו (ב) ספיחה משטח לא ספציפי של החלבון לאורך כל הבידוד. חשוב למעבדות בודדות לקבוע אם התאוששות המוצר עם ספיחה ממברנה מקובלת על סמך הצרכים שלהם; אם שינוי קצב זרימת הטעינה או תוכן feedstock(למשל רצוי תרבות ריכוז תאי חלבון supernatant, אשר עשוי להיותקשהבמיוחד) יכול לשפר את התאוששות המוצר 8 , או אם שינוי של פרוטוקול elution (שלב 4) כדי להשיג התאוששות גבוהה יותר שווה את הזמן המוגבר, הוצאות, ומאמץ, או את הפגיעה האפשרית חלבון או ספיחה ממברנה עצמה (בעיקר על ידי pH מאגר elution, ריכוז מלח, וכו '). בניגוד לשימוש בספיחה של הממברנה, לוקח בערך 10 שעות לבצע שני מחזורי זלוף דרך חלבון 1 מ"ל עמודה עמוסת חרוזים18בקצב הזרימה המרבי נסבל של 1 מיליליטר / דקה, ורק 10-20% Gal-1hFc הוא התאושש בדרך כלל. כדאגה סופית, ניתוח עלות עבור חלבון חרוזים מיצרנים שונים עשויים להשפיע על ההחלטה להשתמש בעמודה סטנדרטית עמוסת חרוזים לעומת ספיחה קרום יחיד. אם ניקח בחשבון את כל הגורמים הללו, השימוש בסוברסיחה ממברנה לבידוד בקנה מידה מעבדה של חלבונים Fc-expressing עשוי להציע מעבדות קטנות יתרונות משמעותיים על פני כרומטוגרפיה עמודה2,5,8,10.
שימוש במיני ג'ל עבור SDS-PAGE, העברה אלקטרופורטית חצי-מדוקדקת של חלבונים מהג'ל לקרום PVDF, וחסימות אימונובלוטינג בסיוע ואקום מציעות חיסכון משמעותי בזמן בהשוואה לג'לים בינוניים, העברת מיכל (רטוב) וחיסון מבוסס דיפוזיה לכימות ואפיון של Gal-1hFc (שעתיים לעומת 8 שעות). מעבדות בודדות חייבות לקבוע אם הפרוטוקול המערבי המזורז מתאים לכימות ואפיון החלבון שלהן. היתרונות כוללים (א) זמן קצר עד להשלמתו גם על ידי אנשי מעבדה לא מנוסים, (ב) היכולת לקבוע אם החלבון שלם או שהתדרדר עקב עיבוד או זיהום (איור 4B),ו-(ג) קלות יחסית לכימות על ידי תוכניות עיבוד תמונה (איור 4C). עם זאת, (א) ריאגנטים מוגברים ועלויות מתכלים עשויים להיות בלתי קבילים למרות קיזוז הזמן לשכר, (ב) כימות חלבון מסורתי על ידי A280, ELISA, ברדפורד assay, או BCA assay עשוי להיות מועדף23-27, או (ג) מעבדות לא יכול להיות גישה לגוש סמידרי או מערכת לגילוי חלבון בסיוע ואקום עבור immunoblotting. במקרים כאלה, כתמי קומאסי של חלבונים שנפתרו על ידי SDS-PAGE21(איור 4D) או כתמי נקודה או חריץ28 הם חלופות טובות.
Cytometry זרימה שימש בשלוש בדיקות נפרדות של 90 דקות לגילוי של Gal-1hFc פונקציונלי בפרוטוקול יעיל זה (איור 2), אשר זהה לעיבוד המסורתי18,22. כל שיטת אפיון אחרת כגון סופג מערבי או ELISA יהיה גם מקובל. מבחנים פונקציונליים הם אופטימליים (למשל זיהוי של ליגנדים galectin-1 על תאים סרטניים בשד, איורים 3A-C). לחלופין, זיהוי יחידת Fc יהיה מקובל (בדומה לאיור 3D), אך לא ניתן לקבוע באופן זה את שימור תפקידו הספציפי של החלבון, המהווה חיסרון בעל פוטנציאל משמעותי.
השיטות המתוארות בזאת שימשו לבידוד ואפיון מהירים בקנה מידה מעבדתי של חלבון היתוך כימרי המבטא FC אנושי (Gal-1hFc). זרימת עבודה יעילה זו יכולה להיות מיושמת על הבידוד של כמעט כל מולקולה בעלת שבר Fc (נוגדני IgG, חלבוני היתוך Fc אחרים, שברי Fc עצמם, וכו ')והוא יכול להיות שונה בקלות על סמך העדפות מעבדה בודדות. בנוסף, פרוטוקול זה הוא מהיר וקל יחסית, אפילו עבור אנשי מעבדה מוגבלים או לא מנוסים לחלוטין, מה שהופך אותו מתאים לשימוש בביולוגיה בתיכון או במכללה, כימיה, ו (ביו) קורסי הנדסה כימית המכסים עקרונות של בידוד חלבון ואפיון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות למר לואיס פ. דלגאדיו (המחלקה להנדסה כימית וביומולקולרית, אוניברסיטת אוהיו), למר מתיו ויליאמס (המחלקה להנדסה כימית וביומולקולרית, אוניברסיטת אוהיו), ולד"ר פיליברטו סדנו-לורן (בית החולים בריגהם ונשים ובית הספר לרפואה של הרווארד) על סיוע טכני מומחה. המחברים גם מבקשים להודות חורף 2011 CHE 404/BME 504 וסתיו 2012 CHE 4830/BME 5830 סטודנטים (המחלקה להנדסה כימית וביומולקולרית ותכנית הנדסה ביו רפואית, אוניברסיטת אוהיו) עבור ייעוץ טכני ודיון. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (NSF) מענק מכשור מחקר גדול CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), מענק מחקר קרן דרמטולוגיה A050422 (SRB), המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מענק NCI 1R15CA161 830-01 (MMB), NIH קירששטיין-NRSA פוסט דוקטורט מלגת F32CA144219-01A1 (SRB), NIH / NCI R01CA173610 (CJD), ו NIH NCCAM מענק R01AT004628 (CJD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml) | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12--A | |
| Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml | Millipore | UFC801008 | Use 15 ml volume if needed |
| Sterile vacuum filter unit, 0.22 µm, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| 10 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 301604 | |
| 30 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 309650 | |
| Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft) | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
| Snap i.d. antibody collection tray | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap i.d. single well blot holder | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| Elution buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris, ultra pure | Fisher Scientific | 819623 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS with Ca2+/Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Human Fc | Bethyl Research Laboratories | P80-104 | |
| Anti-human Fc-APC | Jackson Immunoresearch | 109136170 | |
| Anti-human Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| Alkaline phosphatase substrate | Promega | S3841 | |
| Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene) | BD | 352054 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 55-2226 | A peristaltic pump is also acceptable |
| Protein gel electrophoresis system | Bio-Rad Laboratories | 552BR094876 | Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest |
| Semidry blotter | Bio-Rad Laboratories | 690BR006163 | Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest |
| SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system | EMD Millipore | WBAVDBASE | An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well |
References
- Gagnon, P. Technology trends in antibody purification. J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).
- Gottschalk, U. Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly. Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).
- Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. MAbs. 2, 480-499 (2010).
- Low, D., O'Leary, R., Pujar, N. S. Future of antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, 48-63 (2007).
- Boi, C. Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).
- Cuatrecasas, P. Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads. J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends Biotechnol. 31, 147-154 (2013).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies. Biotechnol Prog. 24, 640-647 (2008).
- Dancette, O. P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography. J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).
- Thommes, J., Etzel, M. Alternatives to chromatographic separations. Biotechnol. Prog. 23, 42-45 (2007).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Modelling and simulation of affinity membrane adsorption. J. Chromatogr. A. 1162, 24-33 (2007).
- van Beijeren, P., et al. Computer-aided process design of affinity membrane adsorbers: A case study on antibodies capturing. Chem. Pap. 62, 458-463 (2008).
- Lauriere, M. A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page. Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).
- Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O'Kennedy, R. Purification of antibodies using affinity chromatography. Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).
- Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins. FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein a chromatography for antibody purification. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).
- Kronvall, G. A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g. J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation. J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
- Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity. J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), (2009).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. J. Vis. Exp. (38), (2010).
- Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays. J. Vis. Exp. (50), (2011).
