Summary
Em comparação com a cromatografia de afinidade tradicional usando colunas repletas de proteínas Agarose, os adsorbers de membrana A da proteína A podem acelerar significativamente o isolamento em escala laboratorial de anticorpos e outras proteínas que expressam fragmentos de Fc. Os métodos adequados de análise e quantificação podem acelerar ainda mais o processamento de proteínas, permitindo que o isolamento/caracterização seja concluído em um dia útil, em vez de mais de 20 horas de trabalho.
Abstract
A escala laboratorial para a purificação em escala industrial de biomoléculas de supernacantes de cultura celular e soluções celulares límedas pode ser realizada usando cromatografia de afinidade. Enquanto a cromatografia de afinidade usando proteína porosa As contas de agarose embaladas em colunas é sem dúvida o método mais comum de isolamento em escala laboratorial de anticorpos e proteínas recombinantes expressando fragmentos de Fc de IgG, pode ser um processo demorado e caro. As restrições de tempo e financeiros são especialmente assustadoras em pequenos laboratórios básicos de ciência que devem recuperar centenas de microgramas para quantidades miligramas de proteína de soluções diluídas, mas não têm acesso a sistemas de entrega de líquidos de alta pressão e/ou pessoal com experiência em bioseparações. Além disso, a quantificação e caracterização do produto também podem alongar excessivamente o tempo de processamento ao longo de vários dias úteis e inflar despesas (consumíveis, salários, etc.). Portanto, um protocolo rápido, barato, mas eficaz é necessário para o isolamento em escala laboratorial e caracterização de anticorpos e outras proteínas que possuam um fragmento de Fc. Para isso, elaboramos um protocolo que pode ser preenchido por equipe técnica de experiência limitada em menos de 9 horas (aproximadamente um dia útil) e tão rapidamente quanto 4 horas, em oposição aos métodos tradicionais que exigem mais de 20 horas de trabalho. A maioria dos equipamentos necessários está prontamente disponível em laboratórios de ciência biomédica padrão, bioquímica e (bio)engenharia química, e todos os reagentes estão disponíveis comercialmente. Para demonstrar este protocolo, são apresentados resultados representativos nos quais a galepina quimrica murina-1 fundida ao DFc humano (Gal-1hFc) da cultura celular foi isolada usando um adsorber de membrana A da proteína A. Gal-1hFc purificado foi quantificado por meio de um procedimento acelerado de análise de manchas ocidentais e caracterizado por citometria de fluxo. O fluxo de trabalho simplificado pode ser modificado para outras proteínas que expressam Fc, como anticorpos, e/ou alteradas para incorporar métodos alternativos de quantificação e caracterização.
Introduction
Isolamento de anticorpos e proteínas recombinantes expressando imunoglobulina G (IgG) Fragmentos de fc de supernantes da cultura celular e soluções celulares diluídas podem ser realizados usando cromatografia de afinidade da proteína A. Em laboratórios básicos de ciência e engenharia e indústria, colunas repletas de proteína porosa A-coated agarose, vidro ou contas poliméricas são mais comumente usadas para cromatografia de afinidade, apesar dos altos custos financeiros e dos longos tempos de processamento1-3. É bem apreciado que a cromatografia de afinidade representa o maior gargalo de gastos e processamento em ambientes laboratoriais e industriais2,4. Como resultado, inúmeras melhorias foram desenvolvidas para diminuir o custo e o tempo de processamento sem sacrificar a recuperação geral do produto do trem de processo1,2,5-7. Particularmente promissor para o isolamento de anticorpos e outras proteínas que expressam Fc é a cromatografia de afinidade usando uma proteína A de adsorber de membrana2,5,7-10. Considerando que a captura de Fc na cromatografia da coluna é limitada à difusão (ou seja, a proteína que expressa fc deve difundir dentro e através de poros internos para atingir a maioria da proteína A) com queda de alta pressão através da coluna, o transporte de massa em adsorbers de membrana é impulsionado por convecção a granel, resultando em evitar limitações de difusão8,9,11,12. Além disso, a queda de pressão no adsorber da membrana é baixa, permitindo assim taxas de fluxo de perfusão mais rápidas em comparação com as colunas embaladas por contas8,9,11,12. Assim, para o isolamento em escala laboratorial, prevê-se que a cromatografia da membrana reduza o tempo de isolamento em várias horas e aumente a captura do produto em comparação com a cromatografia da coluna. Além disso, foram propostos modelos matemáticos para adsorção de IgG em adsorbers de membrana8,9,11,12, permitindo assim que os usuários finais prevejam o desempenho em laboratório.
Outro gargalo nos laboratórios básicos de ciência e engenharia é a caracterização da proteína de expressão de Fc. No entanto, a seleção de métodos apropriados para completar ensaios de caracterização, tais manchas ocidentais, pode reduzir muito o tempo gasto em testes de produtos. Por exemplo, a transferência semidária em um sistema tampão descontínuo pode realizar a transferência eletroforética de proteínas de um gel SDS-PAGE para uma membrana de difluoredina polivinina (PVDF) em questão de minutos, em vez de 1-2 horas de transferência de tanque (molhado) em um sistema tampão contínuo13.
Um protocolo rápido, barato e eficaz para isolar e caracterizar uma proteína de fusão quimrica expressando um fragmento fc de IgG humano é descrito aqui. A maioria dos equipamentos está prontamente disponível em laboratórios de ciência biomédica básica padrão, biologia, química e (bio)engenharia química, e todos os reagentes estão disponíveis comercialmente. Embora os resultados representativos tenham sido gerados a partir do isolamento e caracterização de uma proteína de fusão quimrica murina galectin-1/human Fc (Gal-1hFc), o protocolo simplificado pode ser aplicado ao isolamento de outras moléculas que possuem um fragmento de Fc, como anticorpos, fragmentos de Fc ou outras proteínas de fusão fc. Nossas melhorias diminuíram drasticamente o tempo de processamento (apenas 4 horas, mas mais tipicamente ~9 horas, em comparação com mais de 20 horas de trabalho) ao mesmo tempo em que alcançaram recuperação de produtos semelhantes ou melhoradas em comparação com os métodos padrão.
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Protocol
1. Verifique a afinidade pela proteína A
- Verifique se a proteína de expressão de Fc (proteína de fusão recombinante ou anticorpo IgG, até então referido como "proteína") tem afinidade aceitável para a proteína A14-17 antes de usar a proteína A adsorber de membrana, e teste para a presença da proteína na solução de estoque ( porexemplo, cultura celular supernante clarificada por centrifugação a 1.000 x g por 5 min para pelotas células suspensas). Use citometria de fluxo, mancha ocidental, ELISA, etc. para detectar função proteica e/ou presença de Fc, com base na preferência do laboratório. Idealmente, quantifique a proteína na cultura celular supernascida (passo 6) para evitar exceder a capacidade de adsorber de membrana A. Proceda se a proteína for detectada.
2. Prepare proteína Um Adsorber de Membrana e Supernatante da Cultura Celular
- Siga as instruções do fabricante para preparar o adsorber de membrana. Nunca deixe o ar entrar no adsorber da membrana. Todas as soluções perfundidas através do adsorber de membrana devem estar em temperatura ambiente e pré-filtradas usando um filtro de 0,22 μm. Encha uma seringa de 10 ml com 0,22 μm filtrado de soro fisofado de Dulbecco (DPBS) ou tampão de opções e bolhas de ar de descarga. Perfuse DPBS para remover a solução de armazenamento e equilibrar o adsorber de membrana imediatamente antes do uso.
- Filtre a cultura celular sobrenatante imediatamente antes da perfusão através do adsorber de membrana, usando uma unidade de filtragem estéril de 0,22 μm acionada a vácuo.
3. Carregue a proteína A Membrana Adsorber
- Cultura celular aspirada sobrenatante em uma seringa Luer Lock (30 ml ou maior), e descarregar quaisquer bolhas de ar.
- Monte materiais e equipamentos como mostrado na Figura 1. Conecte a seringa à entrada do adsorber da membrana. Conecte tubos flexíveis à saída de adsorber de membrana. Se desejar, coloque um filtro de seringa de 0,22 μm entre a seringa e o adsorber de membrana. Use um frasco ou garrafa para pegar o fluxo (também conhecido como filtrado), a partir do adsorvo.
- Ajuste a bomba de seringa na taxa de fluxo volumoso desejada, mas não exceda a taxa de fluxo recomendada pelo fabricante (por exemplo, 10 ml/min). Perfunda a cultura celular supernacida através do adsorber de membrana, coletando fluxo através de um béquer ou outro recipiente. Recarregue a seringa com supernacantes necessários.
- Se desejar, teste o fluxo através da presença de proteínas usando citometria de fluxo, mancha ocidental, ELISA, etc. com base na preferência do laboratório. Normalmente é desnecessário reutilizar o fluxo.
4. Proteína elute do Adsorber de Membrana
- Lave o adsorvo de membrana com 10 ml DPBS para remover qualquer proteína não ligada.
- Proteína eluto do adsorber de membrana na taxa de fluxo desejada (por exemplo, 1 ml/min) usando 10-15 ml de tampão de elução(por exemplo, tampão de elução à base de amina (pH 2.8)). Capturar elunato em um tubo contendo tampão neutralizante (por exemplo, 1 M Tris (pH 9.4)) a 10% do volume de elução (1,0-1,5 ml).
- Alternativamente, a proteína eluto em um ml incrementa em tubos contendo 100 μl de tampão de neutralização, usando um volume total de 10-15 ml tampão de eluição. Use o método de caracterização preferido para testar cada fração para a presença de proteína.
- Regenerar o adsorber de membrana de acordo com as instruções do fabricante. Perfuse 10 ml de DPBS filtrado de 0,22 μm ou tampão de escolha, depois 10 ml de 0,22 μm filtrado 50 mM NaOH em 1 N NaCl, e finalmente 10 ml de DPBS filtrados de 0,22 μm. Encha o adsorber de membrana com 20% de etanol em DPBS para armazenamento a longo prazo a 4 ºC.
5. Concentre e digele a proteína
- Deposite todas as frações de elunato (ou frações de elução contendo proteínas conforme determinado na etapa 4.3) em uma unidade de filtro centrífugo de corte de peso molecular de 10 kDa. Siga as instruções do fabricante para centrifugação.
- Dique o retentato em uma pequena unidade de diálise de volume (corte de peso molecular de 10 kDa) contra o tampão de escolha, seguindo as instruções do fabricante. O buffer pode precisar ser adicionado ao material dialisado se a precipitação de proteína for uma preocupação. Se desejar, o material dialisado pode ser refrigerado até que a etapa 6 possa ser realizada, mas o armazenamento a longo prazo sem conservantes não é recomendado.
6. Quantifique e caracterize o produto purificado em um procedimento de mancha ocidental acelerado
- Resolva as normas de proteína purificada e Fc no gel de escolha pela SDS-PAGE, sob condições de redução ou não de18-20. Use um mini gel em vez de gel midi para minimizar o tempo de execução.
- Se ainda não for conhecido, determine a faixa de padrões de Fc sobre qual sinal de banda varia linearmente em relação à quantidade de carga(por exemplo, 0,1-1 mgs). Use o mesmo gel, condições de funcionamento, condições de transferência e reagentes que serão usados para quantificar e caracterizar proteínas purificadas.
- Carregue várias quantidades amostrais de proteína purificada, incluindo amostras diluídas com DPBS, para garantir que os sinais de banda de proteína purificada estejam dentro da faixa de sinal linear dos padrões de Fc na análise de imagens.
- Transfira proteínas do gel para uma membrana de flúor de polivinilidene (PVDF) em um sistema tampão descontínuo usando uma mancha semidry13, seguindo as instruções do fabricante da mancha. O tempo de transferência é tipicamente de 5-10 min. Se desejar, Coomassie manche o gel após a transferência para verificar a eficiência da transferência21.
- Realize a imunoblotação com anti-Fc ou anti-IgG conjugado para fosfattase alcalina (AP) ou peroxidase de rabanete de cavalo (HRP), com base na preferência do laboratório, usando um sistema de detecção de proteína assistida a vácuo. O tempo de imunoblotting é tipicamente inferior a 1 hora.
- Desenvolver imunoblot usando o substrato e o método de escolha (por exemplo, substrato AP e chemiluminescence aprimorada).
- Quantifique a proteína purificada por análise de imagem. Realize uma regressão linear nos sinais de banda dos padrões fc. Se R2>0,90, use a equação para a linha para calcular a quantidade de proteína de seu sinal de banda(s). Conta para diluição amostral, se necessário. Uma vez que a quantificação da proteína é realizada com base em Fc, ajuste o valor para diferenças de peso molecular entre a proteína e Fc. Se R2<0,90, repita o passo 6 em sua totalidade.
- Validar a proteína usando ensaios funcionais ou métodos para detectar Fc via citometria de fluxo, mancha ocidental, ELISA, etc. com base na preferência do laboratório.
- Diluir a proteína à concentração desejada e/ou adicionar quaisquer conservantes ou estabilizadores desejados à solução de proteína purificada antes de aliquotar para armazenamento a longo prazo, congelado ou não.
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Representative Results
O protocolo simplificado para isolamento e caracterização de proteínas que expressam Fc é rotineiramente usado para processar galectina-1 murina quimrica fundida ao Fc humano (Gal-1hFc) de supernantes de cultura celular diluída. O fluxograma na Figura 2 ilustra o fluxo de trabalho e o tempo para cada passo no protocolo. Para um lote típico de 300 ml de supernascimento, o tempo total de processamento é de aproximadamente 9 horas quando o teste opcional de citometria de fluxo de frações de elução é realizado. Se toda a análise de citometria de fluxo for omitida, devido à falta de um citômetro de fluxo ou preferência de laboratório individual, o tempo total de processamento pode ser tão breve quanto 4 horas. Em geral, o tempo de processamento depende da experiência do operador, quantidade de supernascido processado e quais métodos de quantificação e caracterização são realizados.
A citometria de fluxo foi utilizada para testar a presença de Gal-1hFc funcional (ou seja, Gal-1 capaz de detectar seus ligantes em células cancerígenas de mama) na cultura celular inicial sobrenatante; o meio de cultura celular fresca serviu como o controle negativo18,22 . Uma vez verificado gal-1hFc na cultura celular(Figura 3A), o carregamento da proteína A membrana adsorber foi realizada por perfusão sobrenasal a 10 ml/min (resultando em velocidade superficial ou fluxo volumoso de 0,5 cm/min em um adsorber de membrana de 2 ml) usando uma bomba de seringa(Figura 1). O adsorber de membrana capturou e reteve gal-1hFc eficientemente, deixando o fluxo através essencialmente esgotado de Gal-1hFc (falta de avanço, Figura 3A). Gal-1hFc foi elucidado do adsorber de membrana em incrementos de um mililitro a 1 ml/min (fluxo volumoso = 0,05 cm/min) usando um tampão ácido à base de amina (pH 2.8), e frações de elução neutralizadas foram posteriormente testadas para a presença de Gal-1hFc funcional usando citometria de fluxo(Figura 3B). O sinal gal-1hFc aumentou sequencialmente da elução 1 (aproximadamente igual ao controle negativo) para um máximo na elução 3, depois diminuiu para um nível quase constante nas eluções 9 e 10(Figuras 3B e 3C). A elução final 10 não atingiu equivalência ao sinal de controle negativo devido a alguma retenção adsorber de Gal-1hFc (Figuras 3B e 3C). No entanto, essa perda foi considerada aceitável. Como método alternativo para testar para presença, mas não função, de Gal-1hFc em várias soluções, a análise de citometria de fluxo da capacidade de Gal-1hFc de se ligar à proteína A contas de poliestireno (através do reconhecimento da região hFc) pode ser usada(Figura 3D).
Após o teste de fração de elução, as eluções gal-1hFc-positivas 2 a 10 foram concentradas e, em seguida, dialisadas contra DPBS para obter Gal-1hFc purificado no buffer desejado. A quantificação e caracterização do Gal-1hFc purificado foi realizada em um procedimento de mancha ocidental acelerado por transferência semidária e imunoblotação assistida a vácuo. Comparando o sinal gal-1hFc com as normas de quantificação do HFc, tanto a quantidade quanto a qualidade do material purificado foramdeterminadas (Figuras 4A-C). As intensidades de sinal das bandas padrão hFc (uma banda a ~25 kDa cada na Figura 4A, faixas 1-5) estavam linearmente relacionadas com a quantidade de hFc presente(Figura 4C). Gal-1hFc (uma banda a ~40 kDa na Figura 4A, faixa 6) e gal-1hFc degradada (uma banda a ~40 kDa e uma banda a ~25 kDa na Figura 4A, faixa 7) os sinais estavam dentro da faixa de padrões(Figura 4A, faixas 1-5). A concentração de Gal-1hFc purificada (Figura 4A, faixa 6) com base em hFc foi determinada como 450 μg/ml por processamento de imagem(Figura 4C). Ajustando para o peso molecular de Gal-1hFc, a concentração do material purificado foi de 720 g/ml. Em contraste, muito purificado Gal-1hFc foi carregado nas faixas 6 e 7 do Oeste na Figura 4B,o que gerou sinais que saturaram ou excederam a faixa de padrões de hFc, impedindo assim a quantificação. Alternativa à mancha ocidental, a coloração do gel Coomassie21 pode servir como uma verificação rápida de controle de qualidade e/ou método de quantificação(Figura 4D). Note que uma banda ~10 kDa, além das bandas ~25 kDa e ~40 kDa, estava presente na amostra de Gal-1hFc degradada(Figura 4D, faixa 2). Esta banda é degradada Gal-1hFc que não era reativa com o anticorpo de detecção usado em manchas ocidentais (Figuras 4A e 4B).
Após quantificação e caracterização final da Gal-1hFc purificada, a BSA estéril foi adicionada para alcançar uma concentração final de BSA de 0,5%. O material purificado foi então aliquoado e armazenado a -20 ºC. Além da Gal-1hFc, usamos este protocolo simplificado para isolar o mutante duplo Gal-1hFc e Gal-7hFc. Também pode ser estendido a praticamente qualquer molécula que possua um fragmento de Fc (anticorpos, fragmentos de Fc em si, outras proteínas de fusão fc, etc. de espécies e isótipos que têm afinidade pela proteína A14-17).
Figura 1. Esquema do aparelho experimental. Anticorpos e proteínas de fusão recombinantes expressando fragmentos de Fc de IgG podem ser isolados de soluções diluídoras usando um adsorber de membrana A proteica. O adsorber de membrana é conectado através de um encaixe de bloqueio Luer a uma seringa de 30 ml em uma bomba de seringa, que perfusa a solução contendo proteínas através do adsorber de membrana a uma taxa de fluxo volumoso desejada.
Figura 2. Fluxo de trabalho de processo para o isolamento de Gal-1hFc da cultura celular supernante. Este fluxograma ilustra o protocolo para o isolamento e caracterização de uma galectina quimrica murina-1/proteína de fusão de voz de Fc -expressing humana (Gal-1hFc) da cultura celular supernante. Em geral, o tempo de processamento varia dependendo da experiência do operador, quantidade de supernascido processado e quais métodos de quantificação e caracterização são usados.
Figura 3. Análise de citometria de fluxo de soluções contendo Gal-1hFc. A citometria de fluxo é usada para avaliar se o Gal-1hFc funcional está presente no meio de cultura celular fresca, supernasce da cultura celular, fluxo de adsorber de membrana e frações de elução. F(ab')2 anti-humanos foi usado como anticorpo secundário. Todos os dados foram adquiridos utilizando um citômetro/classificador de fluxo de produto de pesquisa de ordem especial DA FACS Aria e analisados usando o software FlowJo. Os marcadores em cada histograma representam 2% da população de controle negativo (ou seja, meio de cultura celular fresca para (A) e isótipo de hFc para (B).). (A) Sobreposição histograma de citometria de fluxo de células cancerígenas de mama BT-20 rotuladas com cultura celular fresca meio (vermelho), cultura celular supernacido (azul) ou fluxo de adsorber de membrana através (verde). A supernasce da cultura celular continha um baixo nível de Gal-1hFc funcional que se ligava com sucesso aos ligantes de galectina-1 em células BT-20, enquanto o fluxo de adsorber de cultura celular fresca e a membrana fluem através da falta de Gal-1hFc, como esperado. (B) Histogramas de citometria de fluxo de células BT-20 rotuladas com frações de elução do adsorber de membrana. O sinal gal-1hFc nas células BT-20 aumenta sequencialmente para um máximo na eluição 4 e depois diminui, embora não para o nível de fundo (ou seja, sinal equivalente ao meio de cultura celular fresca). (C) As intensidades médias de fluorescência das amostras em (B) também podem ser plotadas em função do número de fração de elução para gerar uma curva de elução. A intensidade média de fluorescência das células rotuladas com controle isótipo de hFc é mostrada como uma linha de referência. (D) Alternativamente, a análise da citometria de fluxo de Gal-1hFc vinculada à proteína As contas de poliestireno podem ser usadas para testar a presença de proteínas, mas não funcionar, em várias soluções. F(ab')2 anti-humanos foi usado como anticorpo secundário. Esquerda: Sobreposição histograma de citometria de fluxo de cultura celular fresca média (vermelho), cultura celular supernadante (azul) e amostra tampão em branco (verde). Meio: Histograma de controle isótipo de hFc. Incubação com 10 mg/ml hFc é um controle positivo para a captura de proteína A. Painel direito: Histograma de proteínaA contas incubadas com Gal-1hFc purificada, com base em 10 mg hFc/ml. Clique aqui para ver imagem maior.
Figura 4. Quantificação e caracterização de Gal-1hFc usando manchas ocidentais e análise de imagem. (A) As faixas 1-5 são padrões hFc de 0,1-0,5 μg em incrementos de 0,1 μg, e as faixas 6 e 7 são purificadas Gal-1hFc de dois lotes de produção diferentes. As amostras foram resolvidas em um gel TGX de 4-15% pela SDS-PAGE em condições de redução e, em seguida, transferidas para a membrana PVDF utilizando condições de transferência descontínuas. A membrana foi bloqueada e incubada com anti-hIgG-AP usando uma técnica de imunoblotting assistida a vácuo. Os sinais foram desenvolvidos com reagente ECL e visualizados em um imager Bio-Rad ChemiDoc XRS. Os sinais para os padrões de hFc nas faixas 1-5 variaram linearmente (plotados em (C)), e os sinais para as duas amostras de Gal-1hFc purificadas nas faixas 6 e 7 estavam dentro da faixa de medição linear. A pista 7 mostra duas bandas, Gal-1hFc e presumivelmente hFc fragmento, indicando degradação da proteína. (B) Se estiver carregada a Gal-1hFc muito purificada, o sinal pode saturar ou exceder a faixa de sinal linear, impedindo a quantificação (faixas 6 e 7). As pistas, o gel e as condições de funcionamento são os mesmos de em (A). (C) O software de análise do Image Lab permite a entrada de quantidades absolutas conhecidas de padrões de hFc a partir de um imunoblot, e então determina a quantidade da banda desconhecida através de seu sinal em relação à regressão linear dos padrões (y = 1,36 x 10-7*x + 0,105; R2 = 0,95). Os dados apresentados são da análise do imunoblot em (A). (D) A qualidade do Gal-1hFc purificado pode ser avaliada utilizando-se de coloração Coomassie. Lane M é um marcador de peso molecular, a faixa 1 é purificada Gal-1hFc (mesma amostra da faixa 6 em (A) e (B)), a faixa 2 é degradada Gal-1hFc (mesma amostra da pista 7 em (A) e(B)), e a pista 3 é de 0,2 mg hFc padrão. As condições de gel e de corrida eram as mesmas de (A) e(B). Clique aqui para ver imagem maior.
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Discussion
O protocolo aqui descrito foi desenvolvido para isolar rapidamente e caracterizar uma proteína de fusão quimrica expressando Fc humano (Gal-1hFc), sem comprometer significativamente a recuperação do produto ou o custo inflacionário. Os principais componentes do fluxo de trabalho simplificado são um adsorber de membrana A para isolamento, e transferência semidária e imunoblotação assistida a vácuo para caracterização por manchas ocidentais.
A dramática diminuição do tempo de processamento para isolamento e caracterização de Gal-1hFc de 300 ml de supernascimento da cultura celular (aproximadamente 9 horas no protocolo simplificado em comparação com mais de 20 horas em um protocolo tradicional) é em grande parte atribuível à incorporação dos componentes-chave acima mencionados, particularmente o adsorber de membrana. Na taxa máxima recomendada de fluxo de 10 ml sobrenante/min, o carregamento de adsorber de membrana pode ser concluído em 30 minutos. Recuperação gal-1hFc da proteína A os adsorbers de membrana tipicamente variam de 10 a 30% em nossos laboratórios, com ~30% de recuperação rotineiramente alcançada por pessoal de laboratório experiente quando as concentrações deGal-1hFc na cultura celular supernante são de 5-10 mg/ml. No máximo, ~50% de recuperação foi alcançada. A recuperação completa do produto é praticamente impossível devido a perdas inerentes devido à (a) retenção específica da proteína de expressão de Fc por proteína A no adsorvo de membrana (Figuras 3B e 3C) e (b) adsorção superficial inespecífica da proteína durante todo o isolamento. É importante que os laboratórios individuais determinem se a recuperação do produto com um adsorber de membrana é aceitável com base em suas necessidades; se alterar a taxa de fluxo de carga ou o conteúdo da matéria-prima (por exemplo, a cultura de concentração de células proteicas desejada, que pode ser particularmente difícil) pode melhorar a recuperação do produto8, ou se a modificação do protocolo de elução (etapa 4) para obter maior recuperação vale o aumento do tempo, despesa e esforço, ou o possível dano ao próprio adsortor de proteína ou membrana (principalmente por pH tampão de eluição, concentração de sal, etc.). Em contraste com o uso do adsorber de membrana, leva aproximadamente 10 horas para realizar dois ciclos de perfusão através de uma proteína de 1 ml Uma coluna18embalada com contas à taxa máxima de fluxo tolerável de 1 ml/min, e apenas 10-20% Gal-1hFc é tipicamente recuperada. Como preocupação final, uma análise de custos para contas de proteína A de diferentes fabricantes pode afetar a decisão de usar uma coluna padrão embalada por contas versus um único adsorber de membrana. Levando em consideração todos esses fatores, o uso de um adsorber de membrana para o isolamento em escala laboratorial de proteínas de voz de Fc pode oferecer a pequenos laboratórios vantagens significativas sobre a cromatografia da coluna2,5,8,10.
O uso de um mini gel para SDS-PAGE, transferência eletroforética semidória de proteínas do gel para a membrana PVDF, e imunoblotting assistido a vácuo oferecem economias significativas de tempo em comparação com géis midi, transferência de tanque (molhado) e imunostaining à base de difusão para quantificação e caracterização de Gal-1hFc (2 horas versus 8 horas). Os laboratórios individuais devem determinar se o protocolo ocidental acelerado é apropriado para quantificação e caracterização de sua proteína. Os benefícios incluem (a) pouco tempo para conclusão, mesmo por pessoal de laboratório inexperiente, (b) capacidade de determinar se a proteína está intacta ou degradada devido ao processamento ou contaminação(Figura 4B),e (c) relativa facilidade de quantificação por programas de processamento de imagem(Figura 4C). No entanto, (a) o aumento dos custos de reagentes e consumíveis pode ser inaceitável, apesar da compensação de tempo para os salários, (b) quantificação tradicional de proteínas por A280, ELISA, ensaio de Bradford ou ensaio BCA pode ser preferido23-27, ou (c) laboratórios podem não ter acesso a uma mancha semidítara ou um sistema de detecção de proteína assistida a vácuo para imunoblotting. Nesses casos, a coloração coomassie de proteínas resolvidas SDS-PAGE21(Figura 4D) ou ponto ou mancha de ranhura28 são boas alternativas.
A citometria de fluxo foi utilizada em três testes separados de 90 min para detecção de Gal-1hFc funcional neste protocolo simplificado(Figura 2),que é o mesmo do processamento tradicional18,22. Qualquer outro método de caracterização, como mancha ocidental ou ELISA, também seria aceitável. Os ensaios funcionais são ótimos (por exemplo, detecção de ligantes de galectina-1 em células cancerígenas de mama, Figuras 3A-C). Alternativamente, a detecção da unidade Fc seria aceitável (semelhante à Figura 3D), mas a retenção da função específica da proteína não pode ser determinada dessa forma, o que é uma desvantagem potencialmente significativa.
Os métodos aqui descritos têm sido utilizados para o rápido isolamento em escala laboratorial e caracterização de uma proteína de fusão quimrica expressando Fc humano (Gal-1hFc). Este fluxo de trabalho simplificado pode ser aplicado ao isolamento de praticamente qualquer molécula que possua um fragmento de Fc (anticorpos IgG, outras proteínas de fusão fc, fragmentos de Fc em si, etc.) e pode ser facilmente modificado com base em preferências individuais de laboratório. Além disso, este protocolo é relativamente rápido e fácil, mesmo para experiência limitada ou pessoal de laboratório completamente inexperiente, tornando-o adequado para uso nos cursos de biologia, química e (bio)química que abrangem princípios de isolamento e caracterização de proteínas.
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Disclosures
Não há nada para revelar.
Acknowledgments
Os autores desejam agradecer ao Sr. Luis F. Delgadillo (Departamento de Engenharia Química e Biomolecular da Universidade de Ohio), Ao Sr. Matthew H. Williams (Departamento de Engenharia Química e Biomolecular da Universidade de Ohio) e ao Dr. Filiberto Cedeno-Laurent (Brigham and Women's Hospital e Harvard Medical School) pela assistência técnica especializada. Os autores também desejam agradecer aos alunos do Winter 2011 CHE 404/BME 504 e Outono 2012 CHE 4830/BME 5830 (Departamento de Engenharia Química e Biomolecular e Programa de Engenharia Biomédica da Universidade de Ohio) por aconselhamento técnico e discussão. Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation (NSF) Major Research Instrumentation grant CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Dermatology Foundation Research Grant A050422 (SRB), National Institutes of Health (NIH) NCI grant 1R15CA16 1830-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Pós-Doutorado F32CA144219-01A1 (SRB), NIH/NCI R01CA173610 (CJD) e NIH NCCAM grant R01AT004628 (CJD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml) | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12--A | |
| Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml | Millipore | UFC801008 | Use 15 ml volume if needed |
| Sterile vacuum filter unit, 0.22 µm, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| 10 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 301604 | |
| 30 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 309650 | |
| Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft) | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
| Snap i.d. antibody collection tray | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap i.d. single well blot holder | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| Elution buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris, ultra pure | Fisher Scientific | 819623 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS with Ca2+/Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Human Fc | Bethyl Research Laboratories | P80-104 | |
| Anti-human Fc-APC | Jackson Immunoresearch | 109136170 | |
| Anti-human Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| Alkaline phosphatase substrate | Promega | S3841 | |
| Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene) | BD | 352054 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 55-2226 | A peristaltic pump is also acceptable |
| Protein gel electrophoresis system | Bio-Rad Laboratories | 552BR094876 | Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest |
| Semidry blotter | Bio-Rad Laboratories | 690BR006163 | Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest |
| SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system | EMD Millipore | WBAVDBASE | An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well |
References
- Gagnon, P. Technology trends in antibody purification. J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).
- Gottschalk, U. Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly. Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).
- Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. MAbs. 2, 480-499 (2010).
- Low, D., O'Leary, R., Pujar, N. S. Future of antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, 48-63 (2007).
- Boi, C. Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).
- Cuatrecasas, P. Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads. J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends Biotechnol. 31, 147-154 (2013).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies. Biotechnol Prog. 24, 640-647 (2008).
- Dancette, O. P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography. J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).
- Thommes, J., Etzel, M. Alternatives to chromatographic separations. Biotechnol. Prog. 23, 42-45 (2007).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Modelling and simulation of affinity membrane adsorption. J. Chromatogr. A. 1162, 24-33 (2007).
- van Beijeren, P., et al. Computer-aided process design of affinity membrane adsorbers: A case study on antibodies capturing. Chem. Pap. 62, 458-463 (2008).
- Lauriere, M. A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page. Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).
- Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O'Kennedy, R. Purification of antibodies using affinity chromatography. Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).
- Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins. FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein a chromatography for antibody purification. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).
- Kronvall, G. A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g. J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation. J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
- Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity. J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), (2009).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. J. Vis. Exp. (38), (2010).
- Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays. J. Vis. Exp. (50), (2011).
