Summary
Protein A agarose boncuk dolu sütunlar kullanılarak geleneksel benzeşim kromatografisi ile karşılaştırıldığında, protein A membran adsorberleri antikorların ve diğer Fc parça ifade eden proteinlerin laboratuvar ölçeğinde izolasyonunu önemli ölçüde hızlandırabilir. Uygun analiz ve niceleme yöntemleri protein işlemeyi daha da hızlandırarak izolasyonun/karakterizasyonun 20+ iş saati yerine tek bir iş gününde tamamlanmasını sağlayabilir.
Abstract
Biyomoleküllerin hücre kültüründen endüstriyel ölçekte arındırılması için laboratuvar ölçeğinde süpernatantlar ve lisli hücre çözümleri benzeşim kromatografisi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Gözenekli protein kullanılarak benzeşim kromatografisi Sütunlar halinde paketlenmiş agarose boncukları, IgG'nin Fc parçalarını ifade eden antikorların ve rekombinant proteinlerin laboratuvar ölçeği izolasyonunun tartışmasız en yaygın yöntemi olsa da, zaman alıcı ve pahalı bir süreç olabilir. Zaman ve finansal kısıtlamalar, özellikle seyreltilmiş çözeltilerden yüzlerce mikrogram ila miligram proteini geri kurtarması gereken, ancak yüksek basınçlı sıvı dağıtım sistemlerine ve / veya biyobenzerlik konusunda uzman personele erişimi olmayan küçük temel bilim laboratuvarlarında göz korkutucudur. Ayrıca, ürün nicelemesi ve karakterizasyonu da birkaç iş günü boyunca işlem süresini aşırı uzatabilir ve giderleri (sarf malzemeleri, ücretler vb.)şişirebilir. Bu nedenle, bir Fc parçasına sahip antikorların ve diğer proteinlerin laboratuvar ölçeği izolasyonu ve karakterizasyonu için hızlı, ucuz, ancak etkili bir protokol gereklidir. Bu amaçla, 20' den fazla çalışma saati gerektiren geleneksel yöntemlerin aksine, sınırlı deneyime sahip teknik personel tarafından 9 saatten daha kısa bir sürede (kabaca bir iş günü) ve 4 saat kadar hızlı bir şekilde tamamlanabilen bir protokol tasarladık. Gerekli ekipmanların çoğu standart biyomedikal bilim, biyokimya ve (biyo)kimya mühendisliği laboratuvarlarında mevcuttur ve tüm reaktifler ticari olarak mevcuttur. Bu protokolü göstermek için, hücre kültürü üstnatantından insan Fc'ye (Gal-1hFc) kaynaşmış kimerik murine galectin-1'in A membran adsorber proteini kullanılarak izole edildiği temsili sonuçlar sunulmaktadır. Saflaştırılmış Gal-1hFc hızlandırılmış bir Batı blotting analiz prosedürü kullanılarak ölçüldü ve akış sitometrisi kullanılarak karakterize edildi. Kolaylaştırılmış iş akışı, antikorlar gibi diğer Fc ekspresyel proteinleri için değiştirilebilir ve/veya alternatif niceleme ve karakterizasyon yöntemlerini içerecek şekilde değiştirilebilir.
Introduction
Hücre kültürü süpernatantlarından ve seyreltilmiş lir hücre çözeltilerinden immünoglobulin G (IgG) Fc parçalarını ifade eden antikorların ve rekombinant proteinlerin izolasyonu protein A benzeşim kromatografisi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Temel bilim ve mühendislik laboratuvarlarında ve endüstrisinde, gözenekli protein A kaplı agarose, cam veya polimerik boncuklarla dolu sütunlar, yüksek finansal maliyetlere ve uzun işlem sürelerine rağmen, benzeşim kromatografisi için en yaygın olarak1-3kullanılır. Benzeşim kromatografisinin hem laboratuvar hem de endüstriyel ortamlardaki en büyük gider ve işleme darboğazını temsil ettiği iyi takdir edilir2,4. Sonuç olarak, proses treni1,2,5-7'dengenel ürün geri kazanımından ödün vermeden maliyet ve işlem süresini azaltmak için çok sayıda iyileştirme geliştirilmiştir. Antikorların ve diğer Fc ekspresyon proteinlerinin izolasyonu için özellikle umut verici olan, A membran adsorber2,5,7-10proteini kullanılarak benzeşim kromatografisidir. Kolon kromatografisinde FC yakalaması difüzyon sınırlıyken(yani Fc ekspresyon proteini, protein A'nın çoğunluğuna ulaşmak için iç gözeneklere ve a yoluyla dağılmalı) sütun boyunca yüksek basınç düşüşü ile, membran adsorberlerindeki kütle taşımacılığı toplu konveksiyon ile yönlendirilir ve bu da difüzyon sınırlamalarından kaçınmaya neden olur8,9,11,12. Ek olarak, membran adsorber boyunca basınç düşüşü düşüktür, böylece boncuk dolu sütunlara kıyasla daha hızlı perfüzyon akış hızlarına izin verir8,9,11,12. Böylece laboratuvar ölçeği izolasyonu için membran kromatografinin izolasyon süresini birkaç saat azaltarak kolon kromatografisine göre ürün yakalamayı artıracağı öngörülür. Ayrıca, membran adsorberlerinde IgG adsorpsiyonu için matematiksel modeller önerilmiştir8,9,11,12, böylece son kullanıcıların laboratuvardaki performansı tahmin etmelerini sağlar.
Temel bilim ve mühendislik laboratuvarlarındaki bir diğer darboğaz, Fc ekspresyasyon proteininin karakterizasyonudur. Bununla birlikte, Batı lekeleri gibi karakterizasyon testlerini tamamlamak için uygun yöntemlerin seçilmesi, ürün testlerine harcanan zamanı büyük ölçüde azaltabilir. Örneğin, süreksiz bir tampon sisteminde semidry transferi, sürekli bir tampon sisteminde 1-2 saat tank (ıslak) transferinin aksine, proteinlerin bir SDS-PAGE jelinden polivinil difluoridin (PVDF) membrana elektroforetik transferini birkaç dakika içinde gerçekleştirebilir13.
İnsan IgG'nin fc parçasını ifade eden bir kimerik füzyon proteinini izole etmek ve karakterize etmek için hızlı, ucuz ve etkili bir protokol burada açıklanmıştır. Çoğu ekipman standart temel biyomedikal bilim, biyoloji, kimya ve (biyo)kimya mühendisliği laboratuvarlarında mevcuttur ve tüm reaktifler ticari olarak mevcuttur. Bir murine galektin-1/insan Fc chimeric füzyon proteininin (Gal-1hFc) izolasyonundan ve karakterizasyonundan temsili sonuçlar elde edilmiş olsa da, aerodinamik protokol antikorlar, Fc parçaları veya diğer Fc füzyon proteinleri gibi fc parçasına sahip diğer moleküllerin izolasyonuna uygulanabilir. Geliştirmelerimiz, standart yöntemlere kıyasla benzer veya geliştirilmiş ürün geri kazanımı elde ederken işlem süresini önemli ölçüde azalttı (4 saat kadar az ancak daha tipik olarak ~9 saat, 20+ çalışma saatine kıyasla).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Protein A'nın Benzeşimini Doğrulayın
- Fc ekspresyon proteininin (rekombinant füzyon proteini veya IgG antikoru, heretofore olarak adlandırılan "protein"), A membran adsorber proteinini kullanmadan önce A14-17 proteini için kabul edilebilir bir yakınlığa sahiptir ve proteinin stok çözeltisinde varlığını test edin(örneğin, 5 dakikalık pelet askıya alınmış hücreler için 1.000 x g'da santrifüjleme ile netleştirilmiş hücre kültürü süpernatantı). Akış sitometrisi, Batı şişkinliği, ELISA vb. laboratuvar tercihine göre protein fonksiyonunu ve/veya Fc varlığını tespit etmek. İdeal olarak, protein A membran adsorber kapasitesini aşmamak için hücre kültürü süpernatantındaki proteini ölçün (adım 6). Protein tespit edilirse devam edin.
2. Protein A Membran Adsorber ve Hücre Kültürü Supernatant hazırlayın
- Membran adsorberini hazırlamak için üreticinin talimatlarını izleyin. Havanın membran adsorber'e girmesine asla izin vermeyin. Membran adsorberden perfüzyona uğramış tüm çözeltiler oda sıcaklığında olmalı ve 0,22 μm filtre kullanılarak önceden filtrelenmelidir. 10 ml'lik bir şırınnayı 0,22 μm filtreli Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) veya tercih edilen tampon ve deşarj hava kabarcıkları ile doldurun. Depolama çözeltisini çıkarmak ve kullanımdan hemen önce membran adsorberini aşındırmak için DPBS'yi kullanın.
- Vakumla yönlendirilen 0,22 μm steril filtrasyon ünitesi kullanarak hücre kültürü üstnatantını membran adsorberi aracılığıyla perfüzyondan hemen önce filtreleyin.
3. Protein A Membran Adsorberini Yükleyin
- Hücre kültürünü bir Luer Lock şırındına (30 ml veya daha büyük) apire edin ve hava kabarcıklarını boşaltın.
- Şekil 1'degösterildiği gibi malzeme ve ekipmanları birleştirin. Şırındırı membran adsorberinin girişine bağlayın. Membran adsorber çıkışına esnek boru takın. İsterseniz, şırınna ve membran adsorber arasına 0,22 μm şırınna filtresi yerleştirin. Adsorberden gelen akışı (filtrat olarak da bilinir) yakalamak için bir şişe veya şişe kullanın.
- Şırıng pompasını istediğiniz hacimsel akış hızına ayarlayın, ancak üreticinin önerilen akış hızını(örneğin 10 ml/dk) aşmayın. Hücre kültürünü membran adsorberi ile aşırıya uçurun, bir beherde veya başka bir kapta akış toplayın. Şırınnayı ihtiyaç duyulan süpernatantlarla yeniden yükleyin.
- İsterseniz, akış sitometrisi, Batı şişkinliği, ELISA vb. laboratuvar tercihe göre. Akışı yeniden gözden geçirmek genellikle gereksizdir.
4. Membran Adsorberinden Elute Proteini
- İlişkisiz proteinleri çıkarmak için membran adsorberini 10 ml DPBS ile yıkayın.
- Membran adsorberinden istenen akış hızında(örneğin 1 ml/dk) 10-15 ml elüasyon tamponu(örneğin amin bazlı elüasyon tamponu (pH 2.8)) kullanarak sıvı proteini. Nötralize edici tampon içeren bir tüpte(örneğin, 1 M Tris (pH 9.4)) elüasyon hacminin % 10'unda (1.0-1.5 ml) elüat yakalayın.
- Alternatif olarak, toplam 10-15 ml elüasyon tamponu hacmi kullanarak, bir ml'lik elüte proteini 100 μl nötralizasyon tamponu içeren tüplere indirir. Her kesir protein varlığını test etmek için tercih edilen karakterizasyon yöntemini kullanın.
- Membran adsorberini üreticinin talimatlarına göre yenilenin. 10 ml 0,22 μm filtreli DPBS veya tercih edilen tampon, daha sonra 1 N NaCl'de 10 ml 0,22 μm filtreli 50 mM NaOH ve son olarak 10 ml 0,22 μm filtreli DPBS. 4 ºC'de uzun süreli depolama için MEMB adsorberini DPBS'de% 20 etanol ile doldurun.
5. Konsantre Olun ve Proteini Dialyze
- Tüm eluatları (veya adım 4.3'te belirlenen protein içeren elüasyon fraksiyonlarını) 10 kDa moleküler ağırlık kesme santrifüj filtre ünitesinde biriktirin. Santrifüjleme için üreticinin talimatlarını izleyin.
- Üreticinin talimatlarına uyarak, retentate'i tercih edilen tampona karşı küçük hacimli bir diyaliz ünitesinde (10 kDa moleküler ağırlık kesme) dialyze edin. Protein çökeltme bir endişe ise, diyalze malzemeye tampon eklenmesi gerekebilir. İstenirse, diyalizlenmiş malzeme 6.
6. Hızlandırılmış Batı Blotting Prosedüründe Saflaştırılmış Ürünü Ölçün ve Karakterize Edin
- SDS-PAGE tarafından tercih edilen jeldeki saflaştırılmış protein ve Fc standartlarını, istenen18-20gibi azaltıcı veya tahriş edici olmayan koşullar altında çözün. Çalışma süresini en aza indirmek için midi jel yerine mini jel kullanın.
- Henüz bilinmiyorsa, bant sinyalinin yüklenen miktara göre doğrusal olarak değiştiği Fc standartları aralığını belirleyin(örneğin 0,1-1 mg). Saflaştırılmış proteini ölçmek ve karakterize etmek için kullanılacak aynı jeli, çalışma koşullarını, transfer koşullarını ve reaktifleri kullanın.
- Saflaştırılmış protein bandı sinyallerinin görüntü analizinde Fc standartlarının doğrusal sinyal aralığında olduğundan emin olmak için DPBS ile seyreltilmiş numuneler de dahil olmak üzere birden fazla numune miktarı saflaştırılmış protein yükleyin.
- Proteinleri jelden bir polivinliden florür (PVDF) membranına semidry blotter13kullanarak, leke üreticisinin talimatlarını izleyerek aktarın. Transfer süresi genellikle 5-10 dakikadır. İstenirse, Coomassie transfer verimliliğini doğrulamak için transferden sonra jeli lekeler21.
- Vakum destekli protein algılama sistemi kullanarak laboratuvar tercihine göre alkalin fosfataz (AP) veya at turpu peroksidazına (HRP) konjuge edilmiş anti-Fc veya anti-IgG ile immünblotting gerçekleştirin. İmmünblotting süresi genellikle 1 saatten azdır.
- Substratı ve tercih edilen yöntemi kullanarak immünoblot geliştirin(örneğin AP substratı ve gelişmiş kemimuminesans).
- Görüntü analizi ile saflaştırılmış proteini ölçün. Fc standartlarından gelen bant sinyallerinde doğrusal bir gerileme gerçekleştirin. R2>0,90 ise, bant sinyallerinden protein miktarını hesaplamak için çizginin denklemini kullanın. Gerekirse örnek seyreltme için hesap. Proteinin nicelemesi Fc temelinde gerçekleştirildiği için, protein ve Fc arasındaki moleküler ağırlık farklılıklarının değerini ayarlayın<.
- Akış sitometrisi, Batı şişkinliği, ELISA, vb. laboratuvar tercihe göre.
- Proteini istenen konsantrasyona seyreltin ve/veya uzun süreli depolama için aliquoting yapmadan önce, dondurulmuş veya başka bir şekilde saflaştırılmış protein çözeltisine istenen koruyucuları veya stabilizatörleri ekleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fc ekspresyon proteinlerinin izolasyonu ve karakterizasyonu için kolaylaştırılmış protokol, insan Fc 'ye (Gal-1hFc) kaynaşmış kimerik murine galektin-1'i seyreltik hücre kültürü süpernatantlarından işlemek için rutin olarak kullanılır. Şekil 2'deki akış çizelgesi, protokoldeki her adım için iş akışını ve zamanı gösterir. Tipik bir 300 ml'lik süpernatant grubu için, elütion fraksiyonlarının isteğe bağlı akış sitometrisi testi gerçekleştirildiğinde toplam işlem süresi yaklaşık 9 saattir. Akış sitometresi veya bireysel laboratuvar tercihi eksikliği nedeniyle tüm akış sitometrisi analizi atlanırsa, toplam işlem süresi 4 saat kadar kısa olabilir. Genel olarak, işlem süresi operatör deneyimine, işlenen süpernatant miktarına ve hangi nicelik ve karakterizasyon yöntemlerinin gerçekleştirildiğine bağlıdır.
Akış sitometrisi, başlangıç hücre kültürü üstnatantında fonksiyonel Gal-1hFc'nin(yani meme kanseri hücrelerinde ligandlarını tespit edebilen Gal-1) varlığını test etmek için kullanılmıştır; taze hücre kültürü ortamı negatif kontrol olarak hizmet etti18,22 . Hücre kültüründe Gal-1hFc süpernatantı doğrulandıktan sonra (Şekil 3A), proteinin yüklenmesi A membran adsorber 10 ml / dk'da süpernatant perfüzyon ile gerçekleştirildi (2 ml membran adsorberde 0,5 cm / dk yüzeysel hız veya hacimsel akı ile sonuçlanır) bir şırınga pompası kullanılarak (Şekil 1). Membran adsorber, Gal-1hFc'yi verimli bir şekilde yakaladı ve korudu, akışı esasen Gal-1hFc'nin tükenmiş olarak bıraktı (atılım eksikliği, Şekil 3A). Gal-1hFc, membran adsorberinden amin bazlı asidik tampon (pH 2.8) kullanılarak 1 ml/dk'da (hacimsel akı = 0.05 cm/dk) bir mililitrelik artışlarla elde edildi ve nötralize elution fraksiyonları daha sonra akış sitometrisi kullanılarak fonksiyonel Gal-1hFc varlığı için test edildi (Şekil 3B). Gal-1hFc sinyali, elution 1'den (yaklaşık olarak negatif kontrole eşittir) 3 elüsyonda maksimuma yükseltildi, daha sonra 9 ve 10'da neredeyse sabit bir seviyeye düştü (Şekil 3B ve 3C). Gal-1hFc'nin bazı adsorber tutulması nedeniyle son elution 10 negatif kontrol sinyaline eşdeğerliğe ulaşmadı (Şekil 3B ve 3C). Ancak bu kayıp kabul edilebilir görülmüştür. Gal-1hFc'nin çeşitli çözeltilerde varlığını test etmek için alternatif bir yöntem olarak, Gal-1hFc'nin protein A polistiren boncuklarına (hFc bölgesinin tanınması yoluyla) bağlanma yeteneğinin akış sitometri analizi kullanılabilir (Şekil 3D).
Elution fraksiyon testinin ardından, Gal-1hFc pozitif elutionlar 2 ile 10 arasında yoğunlaştı ve daha sonra istenen tamponda saf gal-1hFc elde etmek için DPBS'ye karşı çaprazlandı. Saflaştırılmış Gal-1hFc'nin nicelleştirilmesi ve karakterizasyonu semidry transferi ve vakum destekli immünobotting ile hızlandırılmış batılı bir blotting prosedüründe gerçekleştirildi. Gal-1hFc sinyali hFc nicelik standartları ile karşılaştırılarak, saflaştırılmış malzemenin hem miktarı hem de kalitesi belirlenmiştir (Şekil 4A-C). hFc standart bantlarının sinyal yoğunlukları (Şekil 4A'daher biri ~25 kDa'da bir bant, şeritler 1-5) doğrusal olarak mevcut hFc miktarıyla ilişkiliydi (Şekil 4C). Gal-1hFc (Şekil 4A'da~40 kDa'da bir bant, şerit 6) ve bozulmuş Gal-1hFc (~40 kDa'da bir bant ve Şekil 4A'da ~25kDa'da bir bant , şerit 7) sinyaller standartlar aralığındaydı(Şekil 4A, şeritler 1-5). Saflaştırılmış Gal-1hFc konsantrasyonu(Şekil 4A, şerit 6) hFc temelinde görüntü işleme ile 450 μg/ml olarak belirlenmiştir (Şekil 4C). Gal-1hFc'nin moleküler ağırlığına göre ayarlanan saflaştırılmış malzemenin konsantrasyonu 720 g/ml idi. Buna karşılık, çok fazla saf gal-1hFc şekil 4BBatı 6 ve 7 şeritlerine yüklendi , bu da hFc standartları aralığını doyuran veya aşan sinyaller üretti, böylece nicelemeyi önledi. Batı şişkinliğine alternatif olarak, Coomassie jel boyama21 hızlı bir kalite kontrol kontrolü ve / veya niceliklendirme yöntemi olarak hizmet edebilir (Şekil 4D). Bozulmuş Gal-1hFc örneğinde ~25 kDa ve ~40 kDa bantlarına ek olarak ~10 kDa bandının bulunduğunu unutmayın(Şekil 4D, şerit 2). Bu bant, Batı lekelerinde kullanılan algılama antikoru ile reaktif olmayan Gal-1hFc bozulur (Şekil 4A ve 4B).
Saflaştırılmış Gal-1hFc'nin ölçülmesi ve son karakterizasyonundan sonra, %0,5'lik son bir BSA konsantrasyonu elde etmek için steril BSA eklendi. Saflaştırılmış malzeme daha sonra aliquoted ve -20 ºC'de depolandı. Gal-1hFc'ye ek olarak, çift mutant Gal-1hFc ve Gal-7hFc'yi izole etmek için bu aerodinamik protokolü kullandık. Ayrıca, bir Fc parçasına sahip olan hemen hemen her moleküle (antikorlar, Fc parçaları, diğer Fc füzyon proteinleri, vb.protein A14-17'yeyakınlık gösteren tür ve izotipler) genişletilebilir.
Şekil 1. Deneysel aparatın şeması. IgG'nin Fc parçalarını ifade eden antikorlar ve rekombinant füzyon proteinleri, A membran adsorber proteini kullanılarak seyreltilmiş çözeltilerden izole edilebilir. Membran adsorber, protein içeren çözeltiyi membran adsorberi aracılığıyla istenen hacimsel akış hızında perfüzyon yapan bir şırınna pompa üzerindeki 30 ml şırınnaya uyan bir Luer kilidinden bağlanır.
Şekil 2. Gal-1hFc'nin hücre kültürü üstndan uzaklığı için işlem iş akışı. Bu akış çizelgesi, hücre kültürü üstnatantından bir kimerik murine galektin-1/insan Fc-ekspresyon füzyon proteininin (Gal-1hFc) izolasyonu ve karakterizasyonu protokolünü göstermektedir. Genel olarak, işlem süresi operatör deneyimine, işlenen süpernatant miktarına ve hangi niceleme ve karakterizasyon yöntemlerinin kullanıldığına bağlı olarak değişir.
Şekil 3. Gal-1hFc içeren çözümlerin akış sitometri analizi. Akış sitometrisi, fonksiyonel Gal-1hFc'nin taze hücre kültürü ortamında, hücre kültürü süpernatantında, membran adsorber akışında ve elüasyon fraksiyonlarında bulunup bulunmadığını değerlendirmek için kullanılır. İkincil antikor olarak APC konjuge F(ab')2 anti-insan Fc kullanıldı. Tüm veriler bir FACS Aria Special Order Research Product flow cytometer/sorter kullanılarak elde edildi ve FlowJo yazılımı kullanılarak analiz edildi. Her histogramdaki belirteçler negatif kontrol popülasyonunun %2'sini temsileder (yani (A) için taze hücre kültürü ortamı ve(B) için hFc izotip). (A) Taze hücre kültürü ortamı (kırmızı), hücre kültürü üstnatantı (mavi) veya membran adsorber akışı (yeşil) ile etiketlenmiş BT-20 meme kanseri hücrelerinin akış sitometri histogramı kaplaması. Hücre kültürü süpernatantı, BT-20 hücrelerinde galektin-1 ligandlarına başarıyla bağlanan düşük bir fonksiyonel Gal-1hFc seviyesi içerirken, taze hücre kültürü ortamı ve membran adsorber beklendiği gibi Gal-1hFc'den yoksundu. (B) Membran adsorberinden elütion fraksiyonları ile etiketlenmiş BT-20 hücrelerinin akış sitometri histogramları. BT-20 hücrelerindeki Gal-1hFc sinyali, arka plan seviyesine (yani taze hücre kültürü ortamına eşdeğer sinyal) olmasa da, elüsyon 4'te sırayla maksimumaartar. (C) (B)kısmındaki örneklerin ortalama floresan yoğunlukları, bir elüp eğrisi oluşturmak için elütion fraksiyonu sayısının bir işlevi olarak da çizilebilir. hFc izotip kontrolü ile etiketlenmiş hücrelerin ortalama floresan yoğunluğu referans çizgisi olarak gösterilir. (D) Alternatif olarak, proteine bağlı Gal-1hFc'nin akış sitometri analizi Çeşitli çözeltilerde protein varlığını test etmek için polistiren boncuklar kullanılabilir, ancak işlev görmez. İkincil antikor olarak APC konjuge F(ab')2 anti-insan Fc kullanıldı. Sol: Akış sitometri histogramı taze hücre kültürü ortamı (kırmızı), hücre kültürü üstnatantı (mavi) ve boş arabellek örneği (yeşil). Orta: hFc izotip kontrolünün histogramı. 10 mg/ml hFc ile inkübasyon, protein A yakalama için pozitif bir kontroldür. Sağ panel: Protein A boncuk histogramı saflaştırılmış Gal-1hFc ile inkübe, temelinde 10 mg hFc/ml. Daha büyük görüntüyü görüntülemek için buraya tıklayın.
Şekil 4. Batı şişkinliği ve görüntü analizi kullanılarak Gal-1hFc'nin nicelleştirilmesi ve karakterizasyonu. (A) Şerit 1-5, 0,1 μg artışlarla 0,1-0,5 μg hFc standartlarıdır ve 6 ve 7 şeritleri Gal-1hFc'yi iki farklı üretim lotundan arındırır. Numuneler SDS-PAGE tarafından %4-15 TGX jel üzerinde azaltıcı koşullar altında çözümlendi, daha sonra süreksiz transfer koşulları kullanılarak PVDF membranlarına aktarıldı. Membran, vakum destekli immünobotting tekniği kullanılarak anti-hIgG-AP ile bloke edildi ve inkübe edildi. Sinyaller ECL reaktifi ile geliştirildi ve Bio-Rad ChemiDoc XRS görüntüleyicide görselleştirildi. 1-5 şeritteki hFc standartlarına ilişkin sinyaller doğrusal olarak değişmektedir((C)olarak çizilmiştir) ve 6 ve 7 numaralı şeritlerdeki iki saflaştırılmış Gal-1hFc numunesinin sinyalleri doğrusal ölçüm aralığındaydı. Lane 7, gal-1hFc ve muhtemelen hFc parçası olmak üzere iki bant gösterir ve bu da proteinin bozulmuş olduğunu gösterir. (B) Çok fazla saflaştırılmış Gal-1hFc yüklenirse, sinyal doğrusal sinyal aralığını doyurabilir veya aşabilir ve nicelemeyi önleyebilir (şerit 6 ve 7). Şeritler, jel ve çalışma koşulları (A) ile aynıdır. (C) Image Lab analiz yazılımı, bir immünoblottan bilinen mutlak miktarda hFc standardının girilmesine izin verir, daha sonra standartların doğrusal regresyonunu (y = 1.36 x 10-7*x + 0.105) göre sinyali aracılığıyla bilinmeyen bantların miktarını belirler; R2 = 0,95). Gösterilen veriler (A) uygulamasındaki immünoblotun analizinden elde edilir. (D) Saflaştırılmış Gal-1hFc kalitesi Coomassie boyama kullanılarak değerlendirilebilir. Lane M moleküler ağırlık işaretleyicidir, şerit 1 Gal-1hFc (şerit 6 in (A) ve (B) ile aynı örnek), şerit 2 bozulmuş Gal-1hFc (şerit 7 in (A) ve (B) ile aynı örnek) ve şerit 3 0.2 mg hFc standardıdır. Jel ve çalışma koşulları (A) ve (B) ile aynıydı. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol, ürün geri kazanımını veya şişirme maliyetini önemli ölçüde tehlikeye atmadan, insan Fc'yi (Gal-1hFc) ifade eden bir kimerik füzyon proteinini hızla izole etmek ve karakterize etmek için geliştirilmiştir. Aerodinamik iş akışının temel bileşenleri, izolasyon için bir protein A membran adsorber ve Batı şişkinliği ile karakterize için semidry transferi ve vakum destekli immünobotting'dir.
Gal-1hFc'nin 300 ml hücre kültürü süpernatantından (geleneksel bir protokolde 20+ saate kıyasla aerodinamik protokolde yaklaşık 9 saat) izolasyon ve karakterizasyon için işlem süresindeki çarpıcı düşüş, büyük ölçüde yukarıda belirtilen anahtar bileşenlerin, özellikle de membran adsorberinin birleştirilmesine atfedilebilir. 10 ml süpernatant/dk önerilen maksimum akış hızında, membran adsorber yüklemesi 30 dakikada tamamlanabilir. Proteinden Gal-1hFc geri kazanımı A membran adsorberleri tipik olarak laboratuvarlarımızda% 10-30 arasında değişmektedir, hücre kültürü süpernatantındakiGal-1hFc konsantrasyonları 5-10 mg / ml olduğunda deneyimli laboratuvar personeli tarafından rutin olarak elde edilen ~ % 30 iyileşme ile. En fazla , ~% 50 iyileşme sağlanmıştır. Tam ürün geri kazanımı, (a) Fc ekspresyon proteininin membran adsorberinde A proteini ile spesifik olarak tutulması (Şekil 3B ve 3C) ve (b) proteinin izolasyon boyunca spesifik olmayan yüzey adsorpsiyonu nedeniyle doğal kayıplar nedeniyle neredeyse imkansızdır. Bireysel laboratuvarların, membran adsorber ile ürün geri kazanımı ihtiyaçlarına göre kabul edilebilir olup olmadığını belirlemesi önemlidir; yükleme akış hızını veya hammadde içeriğini değiştirmek(örneğin, özellikle zor olabilecek istenen protein hücresi konsantrasyon kültürü süpernatantı) ürün geri kazanımınıartırabilirse 8veya daha yüksek geri kazanım elde etmek için elution protokolünün (adım 4) değiştirilmesi artan zaman, masraf ve çabaya veya protein veya membran adsorberinin kendisine olası zarara değerse (öncelikle elüasyon tamponu pH, tuz konsantrasyonu vb.). Membran adsorberinin kullanılmasının aksine, 1 ml protein A boncuk dolu sütun 18 üzerinden1ml/ dk'lık maksimum tolere edilebilir akış hızında iki perfüzyon döngüsü gerçekleştirmek yaklaşık 10 saat sürer ve tipik olarak sadece% 10-20 Gal-1hFc kurtarılır. Son bir endişe olarak, farklı üreticilerin protein A boncukları için bir maliyet analizi, tek bir membran adsorberine karşı standart bir boncuk dolu sütun kullanma kararını etkileyebilir. Tüm bu faktörler göz önünde bulundurularak, Fc ekspresyon proteinlerinin laboratuvar ölçeği izolasyonu için bir membran adsorber kullanılması, küçük laboratuvarlara kolon kromatografisi2,5,8,10'agöre önemli avantajlar sunabilir.
SDS-PAGE için mini jel kullanımı, proteinlerin jelden PVDF membrana yarı yarıya süreksiz elektroforetik transferi ve vakum destekli immünobraksiyon, Gal-1hFc'nin (2 saate karşı 8 saat) ölçülmesi ve karakterizasyonu için midi jellere, tank (ıslak) transferine ve difüzyon bazlı immünostaining'e kıyasla önemli zaman tasarrufu sağlar. Bireysel laboratuvarlar, hızlandırılmış Batı protokolünün proteinlerinin ölçülmesi ve karakterizasyonu için uygun olup olmadığını belirlemelidir. Avantajlar arasında (a) deneyimsiz laboratuvar personeli tarafından bile tamamlanması için kısa bir süre, (b) proteinin sağlam olup olmadığını veya işleme veya kirlenme nedeniyle bozulup bozulmadığını belirleme yeteneği (Şekil 4B) ve (c) görüntü işleme programları tarafından göreli nicelik kolaylığı (Şekil 4C). Bununla birlikte, (a) artan reaktifler ve sarf malzemeleri maliyetleri, ücretler için zaman uzaklığına rağmen kabul edilemez olabilir, (b) A280, ELISA, Bradford tahlil veya BCA testinin geleneksel protein nicelemesi23-27tercih edilebilir veya (c) laboratuvarların immünobliç için yarı yarıya bir blotter veya vakum destekli protein algılama sistemine erişimi olmayabilir. Bu gibi durumlarda, SDS-PAGE çözülmüş proteinlerin Coomassie lekelenmesi21(Şekil 4D) veya nokta veya yuva şişkinliği28 iyi alternatiflerdir.
Akış sitometrisi, geleneksel işleme18,22ile aynı olan bu aerodinamik protokolde fonksiyonel Gal-1hFc'nin tespiti için üç ayrı 90 dakikalık testlerde kullanılmıştır (Şekil2 ). Batı blotting veya ELISA gibi diğer herhangi bir karakterizasyon yöntemi de kabul edilebilir. Fonksiyonel tahliller optimaldir(örneğin meme kanseri hücrelerinde galektin-1 ligandlarının tespiti, Şekil 3A-C). Alternatif olarak, Fc ünitesinin tespiti kabul edilebilir (Şekil 3D'yebenzer), ancak proteinin spesifik işlevinin tutulması bu şekilde belirlenemez, bu da potansiyel olarak önemli bir dezavantajdır.
Burada açıklanan yöntemler, insan Fc'yi (Gal-1hFc) ifade eden bir kimerik füzyon proteininin hızlı laboratuvar ölçeği izolasyonu ve karakterizasyonu için kullanılmıştır. Bu aerodinamik iş akışı, bir Fc parçasına (IgG antikorları, diğer Fc füzyon proteinleri, Fc parçalarının kendileri vb.)sahip olan hemen hemen her molekülün izolasyonu için uygulanabilir ve bireysel laboratuvar tercihlerine göre kolayca değiştirilebilir. Buna ek olarak, bu protokol sınırlı deneyime sahip veya tamamen deneyimsiz laboratuvar personeli için bile nispeten hızlı ve kolaydır, bu da onu protein izolasyonu ve karakterizasyonu ilkelerini kapsayan lise veya kolej biyolojisi, kimya ve (biyo)kimya mühendisliği derslerinde kullanıma uygun hale getirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Açıklayacak bir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar, uzman teknik yardım için Bay Luis F. Delgadillo'ya (Ohio Üniversitesi Kimya ve Biyomoleküler Mühendislik Bölümü), Bay Matthew H. Williams'a (Ohio Üniversitesi Kimya ve Biyomoleküler Mühendislik Bölümü) ve Dr. Filiberto Cedeno-Laurent'e (Brigham ve Kadın Hastanesi ve Harvard Tıp Fakültesi) teşekkür etmek istiyor. Yazarlar ayrıca 2011 Kış 2011 CHE 404/BME 504 ve Sonbahar 2012 CHE 4830/BME 5830 öğrencilerine (Ohio Üniversitesi Kimya ve Biyomoleküler Mühendislik ve Biyomedikal Mühendisliği Programı Bölümü) teknik tavsiye ve tartışma için teşekkür etmek istemeleridir. Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı (NSF) Büyük Araştırma Araçları hibesi CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Dermatoloji Vakfı Araştırma Hibesi A050422 (SRB), Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) NCI hibesi 1R15CA1618 tarafından desteklendi.30-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Doktora Sonrası Burs F32CA144219-01A1 (SRB), NIH/NCI R01CA173610 (CJD) ve NIH NCCAM hibe R01AT004628 (CJD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml) | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12--A | |
| Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml | Millipore | UFC801008 | Use 15 ml volume if needed |
| Sterile vacuum filter unit, 0.22 µm, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| 10 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 301604 | |
| 30 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 309650 | |
| Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft) | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
| Snap i.d. antibody collection tray | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap i.d. single well blot holder | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| Elution buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris, ultra pure | Fisher Scientific | 819623 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS with Ca2+/Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Human Fc | Bethyl Research Laboratories | P80-104 | |
| Anti-human Fc-APC | Jackson Immunoresearch | 109136170 | |
| Anti-human Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| Alkaline phosphatase substrate | Promega | S3841 | |
| Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene) | BD | 352054 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 55-2226 | A peristaltic pump is also acceptable |
| Protein gel electrophoresis system | Bio-Rad Laboratories | 552BR094876 | Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest |
| Semidry blotter | Bio-Rad Laboratories | 690BR006163 | Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest |
| SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system | EMD Millipore | WBAVDBASE | An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well |
References
- Gagnon, P. Technology trends in antibody purification. J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).
- Gottschalk, U. Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly. Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).
- Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. MAbs. 2, 480-499 (2010).
- Low, D., O'Leary, R., Pujar, N. S. Future of antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, 48-63 (2007).
- Boi, C. Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).
- Cuatrecasas, P. Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads. J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends Biotechnol. 31, 147-154 (2013).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies. Biotechnol Prog. 24, 640-647 (2008).
- Dancette, O. P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography. J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).
- Thommes, J., Etzel, M. Alternatives to chromatographic separations. Biotechnol. Prog. 23, 42-45 (2007).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Modelling and simulation of affinity membrane adsorption. J. Chromatogr. A. 1162, 24-33 (2007).
- van Beijeren, P., et al. Computer-aided process design of affinity membrane adsorbers: A case study on antibodies capturing. Chem. Pap. 62, 458-463 (2008).
- Lauriere, M. A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page. Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).
- Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O'Kennedy, R. Purification of antibodies using affinity chromatography. Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).
- Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins. FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein a chromatography for antibody purification. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).
- Kronvall, G. A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g. J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation. J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
- Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity. J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), (2009).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. J. Vis. Exp. (38), (2010).
- Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays. J. Vis. Exp. (50), (2011).
