Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

مضان doi: 10.3791/51030 Published: February 24, 2014

Summary

نحن هنا وصف بسيط مضان التهجين في الموضع (FISH) طريقة لتوطين الفيروسات والبكتيريا في أنسجة الحشرات والنبات. ويمكن تمديد هذا البروتوكول لتصور مرنا في جبل بأكمله والمقاطع المجهرية.

Abstract

مضان التهجين في الموقع (FISH) في هو الاسم الذي يطلق على مجموعة متنوعة من التقنيات التي تستخدم عادة لتصور النصوص الجينات في الخلايا حقيقية النواة ويمكن تعديل أخرى لتصور المكونات الأخرى في الخلية مثل العدوى الناجمة عن فيروسات والبكتيريا. توطين المكاني والتصور من الفيروسات والبكتيريا أثناء عملية العدوى هو خطوة أساسية أن يكمل التعبير التنميط التجارب مثل ميكروأرس وRNAseq استجابة لمحفزات مختلفة. فهم التهابات الزمانية المكانية مع هذه العوامل تكمل التجارب البيولوجية التي تهدف إلى فهم تفاعلها مع المكونات الخلوية. العديد من التقنيات لتصور الفيروسات والبكتيريا مثل نظم الجين المراسل أو أساليب المناعى هي مضيعة للوقت، وبعض تقتصر على العمل مع الكائنات نموذج وتنطوي منهجيات معقدة. FISH الذي يستهدف الأنواع الحمض النووي الريبي DNA أو في الخلية هو لي سهلة نسبيا وسريعةثود لدراسة توطين الزمانية المكانية من الجينات ولأغراض التشخيص. هذا الأسلوب يمكن أن تكون قوية وسهلة نسبيا لتنفيذ عندما تستخدم البروتوكولات التهجين قصيرة، تحقيقات شراؤها تجاريا، والتي هي ليست مكلفة. هذا هو قوي ولا سيما عندما إعداد العينات، والتثبيت، والتهجين، والتصور المجهرية لا تنطوي الخطوات المعقدة. نحن هنا وصف بروتوكول للتوطين البكتيريا والفيروسات في أنسجة الحشرات والنبات. وتستند هذه الطريقة على إعداد بسيطة، التثبيت، وتهجين يتصاعد كله الحشرات وأجهزة تشريح أو أقسام المصنع المصنوعة يدويا، مع 20 زوجا قاعدة تحقيقات الحمض النووي قصيرة مترافق إلى الأصباغ الفلورية على هم 5 'أو 3' ينتهي. وقد تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح لعدد من أنسجة الحشرات والنباتات، ويمكن استخدامها لتحليل التعبير عن mRNAs وأو الأنواع الحمض النووي الريبي DNA أو أخرى في الخلية.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

عند دراسة التفاعلات بين الفيروسات النباتية ومسببات الأمراض الأخرى مع المضيفين النباتية المصابة، فمن المهم أن تصور مسببات الأمراض والأحماض النووية الخاصة بها في الموقع، بغض النظر عما إذا كانت تتسبب في آثار سلبية على مضيفيهم. وهذا هو الأكثر أهمية عند دراسة حركة الممرض داخل وبين الخلايا النباتية. في توطين الموضع من المنتجات الجينات من مسببات المرض هو الخطوة الأساسية التي يكمل نهج أخرى لدراسة عملية المرضية. العديد من مسببات الأمراض النباتية، وخاصة الفيروسات، وتنتقل عن طريق الحشرات، بعد أن التفاعلات المعقدة والحميمة مع ناقلاتها. توطين هذه الفيروسات في ناقلاتها المهم لدراسة مسار انتقال، ومواقع التفاعل ممكن داخل النواقل. وساعد انتقال بعض الفيروسات النباتية تنقلها الحشرات، عن طريق البكتيريا الموجودة داخل endosymbiotic هذه الحشرات. لدراسة أفضل من انتقال هذه الفيروسات النباتية بذ ناقلات بهم، بل هو أيضا ضروري لتصور البكتيريا endosymbiotic بشكل عام، والذين يشاركون في انتقال الفيروس، على وجه الخصوص. وبالتالي المطلوب Colocalization من الفيروسات والبكتيريا endosymbiotic للتحقيق في العلاقات الممكنة بين هذه الكائنات الحية داخل المضيفة الحشرات. وبصرف النظر عن انتقال الفيروس والبكتيريا endosymbiotic تؤثر عدة جوانب بيولوجيا الحشرات الناقلة للأمراض، وبالتالي توطين المكاني لهذه البكتيريا داخل الحشرات هي من الفائدة المرتفعة وأهميتها.

الطماطم ورقة صفراء حليقة فيروس (TYLCV) (Begomovirus، Geminiviridae) هو مرض فيروسي المعقدة أهم من الطماطم المزروعة في جميع أنحاء العالم 1-4. TYLCV هو فيروس محدودة اللحاء وتنقلها حصريا من قبل الذبابة البيضاء Bemisia الذبابة البيضاء 5،6. وقد تم اقتراح نموذج يصف إزفاء من begomoviruses في ناقلاتها الذبابة البيضاء 6-9. وعبرت حاجزين محددة بنشاط الدرجي هذا الإرسال circulative: المعي المتوسط ​​/ الدملمف والحواجز الغدة الدملمف / اللعابية. هو الافتراض هذه العملية إحالته إلى أن بوساطة مستقبلات مجهولة التي تعترف قفيصة الفيروس. ويعتقد TYLCV لعبور B. يمتص المعي المتوسط ​​6،10 الذبابة البيضاء، وذلك من خلال الغدة اللعابية الابتدائي 6 قبل أن يتم حقنه في المصنع. في الدملمف الذبابة البيضاء، يتفاعل مع بروتين TYLCV GroEL التي تنتجها الحشرات الثانوية endosymbiotic بكتيريا Hamiltonella. يضمن هذا التفاعل النقل الآمن للTYLCV في الدملمف، ويحميها من هجوم من قبل النظام المناعي الحشرات 11. Hamiltonella وPortiera، ومعايش جواني الابتدائي من الذباب الأبيض، ويعيش في bacteriocytes، خلايا الحشرات وجدت في الدملمف وendosymbiotic منزل البكتيريا 11. B. الذبابة البيضاء تؤوي البكتيريا endosymbiotic إضافية بما في ذلك الريكتسية، Arsenophonus، الولبخية، وفريتشعصام، والتي يمكن أن تكون مترجمة داخل bacteriocytes أو خارجها، ولها تأثيرات متنوعة على البيولوجيا الحشرة 12.

وقد حاول العديد من التقارير لدراسة توطين TYLCV في النباتات والذباب الأبيض باستخدام بروتوكولات تستغرق وقتا طويلا ومكلفة مثل نقل المجهر الإلكتروني (TEM)، والأجسام المضادة والحمض النووي الريبي في الموقع في قسم سميكة المجهرية 10،13، وصفت دراسة حديثة للتوطين من الفيروسات النباتية داخل المصنع وناقلات مضيفيهم باستخدام بروتوكول بسيطة 14. نحن هنا وصف بروتوكول بسيطة لتوطين TYLCV في B. تشريح الذبابة البيضاء midguts والغدد اللعابية، وأقسام المحضرة من النباتات TYLCV المصابة. وصفنا كذلك توطين Portiera، ومعايش جواني الرئيسي للB. الذبابة البيضاء، وendosymbionts الثانوية في Hamitonella، الريكتسية وArsenophonus. ويستند هذا البروتوكول على استخدام الحمض النووي تحقيقات قصيرة، أنوfluorescently المسمى على هم 'نهاية 5، وهجن خصيصا لتسلسل تكميلية في تسلسل الجينات الفيروسية أو البكتيرية. تجهيز عينة من السهل نسبيا وإشارة حصلنا عليها محددة للغاية. بروتوكول وصف يمكن استخدامها لتوطين الفيروسات والبكتيريا ومسببات الأمراض الأخرى في المضيفين النبات والحيوان والحشرات، ويمكن وأن تستخدم أيضا للتوطين مرنا في أي نسيج معين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. التحضيرات العامة الذبابة البيضاء، النبات، وفيروسات لتحليل FISH

  1. الخلفية B وس الذباب الأبيض نمط حيوي على شتلات القطن (القطن المكسيكي L. السيرة الذاتية. اكالا) والحفاظ على داخل أقفاص واقية من الحشرات وغرف النمو تحت الظروف القياسية من 25 ± 2 درجة مئوية، والرطوبة النسبية 60٪، وضوء 14 ساعة / 10 ساعة الإضاءة المظلمة.
  2. أداء PCR لاختبار الإصابة بفيروس endosymbionts باستخدام بادئات معايش جواني محددة كما هو موضح سابقا 15-19.
  3. شراء شتلات الطماطم (مغد اسكولينتوم السيرة الذاتية. بفتيك) من الحضانة تجارية أو بذور الطماطم النبات.
  4. المحافظة تحت نفس الظروف المذكورة أعلاه حتى تربية النباتات تصل إلى مرحلة الحقيقية أوراق الأربعة، سن الأكثر ملاءمة لبوساطة الذبابة البيضاء تلقيح TYLCV 15 (انظر القسم 4.1 أدناه).

2. التعامل مع الحشرات، تثبيت، دقق تصميم والتهجين، والتصور لإندوالمتكافل FISH

  1. جمع 10 الذباب الأبيض الكبار بحلول تطلع من نباتات القطن، أو اختيار 10 3 أو 4 الثالثة عشر حوريات الطور من أوراق القطن.
  2. تزج فورا في تثبيتي كاروني في (حمض كلوروفورم الايثانول الجليدية الخليك، 06:03:01، المجلد / المجلد) داخل أنابيب إيبندورف. إصلاح لمدة 2 ساعة ليلة وضحاها (ويفضل بين عشية وضحاها).
  3. تماما إزالة تثبيتي، ويزيل اللون في 6٪ H 2 O 2 في الإيثانول لمدة 2 ساعة.
  4. الحفاظ على العينات في الايثانول المطلق لعدة أيام إلى عدة أسابيع في درجة حرارة الغرفة، أو انتقل إلى الخطوة التالية.
  5. تحقيقات تصميم الاشعال الحمض النووي عكس مكملة على أساس الجينات 16S الرنا الريباسي من كل البكتيريا. لتصميم تحقيقات، تأخذ في الحسبان الاعتبارات نفسها لتصميم بادئات PCR. استخدام تحقيقات نيوكليوتيدات دقيقة BTP1 5'-Cy5-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3 '، RB1 5'-CY3-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3'، BTH 5'-CY3-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3 'وArs2 5'-CY3-TCATGACCACAACCTCCAAA-3 'لاستهداف محددة من Portiera، الريكتسية، Hamilonella، وArsenophonus، على التوالي.
  6. هجن عينات بين عشية وضحاها في الظلام في المنطقة العازلة التهجين (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 0.9 M كلوريد الصوديوم، 0.01٪ [بالوزن / المجلد] كبريتات الصوديوم دوديسيل، و 30٪ [المجلد / المجلد] الفورماميد) تحتوي على 10 بمول التحقيق الفلورسنت لكل مل . الجمع بين التحقيق أكثر من واحد مع الأصباغ الفلورية مختلفة إذا لزم الأمر. استخدام الذباب الأبيض غير مصاب ببكتيريا المستهدفة وعينات لا مسبار الضوابط سلبية.
  7. جبل العينات كلها، على شريحة المجهر، في التهجين العازلة الواردة مع مانع السائل، وتغطي مع انزلاق الغطاء، وختم بطلاء الأظافر، وعرض تحت المجهر مضان أو متحد البؤر.

3. الذبابة البيضاء تشريح الجهاز، تثبيت، التهجين، والتصور للTYLCV FISH

  1. جمع الذباب الأبيض الكبار تربى بشكل مستمر على نباتات الطماطم TYLCV المصابة بواسطة الطموح وانوsthetize عن التعرض لمنشفة ورقية مشربة مع الأسيتون. فضح الذباب الأبيض فقط لمدة 1-2 دقيقة عن التعرض طويلا لالأسيتون يمكن إصلاح الأنسجة الذباب الأبيض. استخدام الذباب الأبيض nonviruliferous تربى على نباتات الطماطم غير مصاب ولا عينات التحقيق لضوابط محددة لتأكيد التهجين.
  2. الذباب الأبيض على جبل المجهر الاكتئاب الشرائح للتشريح الجهاز باستخدام مجهر ستيريو.
  3. سحب بعيدا الرأس حشرة من قبل الصدر وتشريح الغدد اللعابية في برنامج تلفزيوني 1X تستكمل مع 1٪ طولويدين صمة عار الأزرق لأفضل التصور، نظرا لصغر حجمها. تسمح امتصاص وصمة عار لمدة 2-3 دقيقة.
  4. سحب الحشرات وبصرف النظر في هذا المنعطف بين الصدر والبطن لمراقبة وطرد خارج المعى المتوسط. طرد محتويات البطن عن طريق دفع مع ملقط على الطرف البطن.
  5. بلطف إزالة برنامج تلفزيوني وطولويدين الأزرق من تشريح ناجحة وإضافة بلطف 300 ميكرولتر من تثبيتي كاروني لإصلاح الأجهزة لمدة 5 دقائق.
  6. Aدد تثبيتي من جانب واحد من البئر الاكتئاب وليس من أعلى لمنع حركة غير المنضبط للأجهزة تشريح. مرة واحدة لمس تثبيتي، فإن أجهزة التمسك الزجاج، وطوال العملية فإنها لن تتحرك.
  7. إزالة تثبيتي، وإضافة 500 ميكرولتر من العازلة التهجين تستكمل مع 10 بمول من الحمض النووي التحقيق الفلورسنت Cy5-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 '، التي هي مكملة لسلسلة البروتين في TYLCV معطف الجينات.
  8. هجن بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة في الظلام التي يحتضنها الشريحة مع العينة داخل غرفة رطبة صغيرة تتألف من مربع صغير من البلاستيك مع ورقة منشفة مبللة في القاع.
  9. بعد التهجين، والتقاط أجهزة بأداة تشريح غرامة وبسرعة نقلها إلى شريحة المجهر الطازجة التي تحتوي على 30 ميكرولتر من العازلة التهجين جديدة تستكمل مع دابي (0.1 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني 1X) والواردة مع مانع السائل.
  10. تغطية العينات مع انزلاق الغطاء، وختم الطرافةح البولندية الأظافر وعرض تحت المجهر مضان أو متحد البؤر.

4. التعامل مع النبات، وباليد باجتزاء، التثبيت، وتهجين لTYLCV FISH

  1. تطعيم شتلات الطماطم مع TYLCV باستخدام ناقل الفيروس بوساطة الذبابة البيضاء التلقيح. ويمكن الكشف عن الفيروس باستخدام هذا الأسلوب FISH في محطات بلا أعراض أسبوع واحد بعد التطعيم. أعراض المرض نموذجية مرئية ثلاثة أسابيع بعد التلقيح. استخدام نباتات الطماطم غير مصاب ولا عينات التحقيق لضوابط محددة لتأكيد التهجين.
  2. استخدام شفرة حلاقة حادة النسيجي لإعداد المقاطع الطويلة 2-4 سم قطع اليد الطولي أو العرضي الطماطم السيقان والأوراق.
  3. في أنابيب إيبندورف، وتحديد المقاطع في تثبيتي كاروني ل2 ساعة بين عشية وضحاها لفي درجة حرارة الغرفة.
  4. إزالة تثبيتي، والحفاظ على المقاطع في الايثانول المطلق لعدة أيام إلى عدة أسابيع في درجة حرارة الغرفة، أو انتقل إلى الخطوة التالية.
  5. غسل المقاطعثلاث مرات، 1 دقيقة لكل منهما، في المنطقة العازلة التهجين.
  6. هجن المقاطع مع 500 ميكرولتر من العازلة التهجين تستكمل مع 10 بمول من نيوكليوتيدات دقيقة التحقيق الفلورسنت CY3-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 'التي هي مكملة لسلسلة البروتين في TYLCV معطف الجينات.
  7. غسل أقسام ثلاث مرات، 1 دقيقة لكل منهما، في المنطقة العازلة التهجين.
  8. جبل قطاعات كاملة في المنطقة العازلة التهجين تستكمل مع دابي (0.1 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني 1X) والواردة مع مانع السائل، مع تغطية ساترة، وختم بطلاء الأظافر وعرض تحت المجهر مضان أو متحد البؤر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويرد النظام درس في هذه المخطوطة في الشكل (1) وتشمل مصنع المصابة مع TYLCV، الكبار وحورية من الذبابة البيضاء B. الذبابة البيضاء، والتشريح الداخلي من الذبابة البيضاء التي تبين مسار إزفاء TYLCV في الحشرات. الشكل 2 يوضح FISH مزدوجة في الذبابة البيضاء الكبار لالمتكافل الأولية Portiera والمتكافل الثانوية يظهر Arsenophonus. الشكل 3 FISH مزدوجة لPortiera وHamiltonella، و ويبين الشكل 4 FISH مزدوجة لPortiera والريكتسية، كلا الرقمين في B. الذبابة البيضاء 4 ال الطور حورية. يبين الشكل 5 FISH لTYLCV وتلطيخ دابي في الذبابة البيضاء تشريح المعي المتوسط، ويبين الشكل 6 FISH لTYLCV وتلطيخ دابي في الغدد اللعابية الأساسية الذبابة البيضاء تشريح. الشكل 7 يبين FISH لTYLCV وتلطيخ دابي فيقطع اليد المصابة TYLCV أقسام المصنع.

الشكل 1
الشكل 1. نظرة عامة لنظام درس في هذه المخطوطة. أ) أعراض المرض النموذجية ناجم عن الإصابة بعدوى الطماطم الصفراء فيروس تجعد أوراق (TYLCV). B) عرض خارجية من الذبابة البيضاء الكبار. C) عرض خارجية من ال 4 مرحلة الحوريات في دورة حياة الذبابة البيضاء التنموية. مراحل الحوريات أخرى متشابهة في وجهة النظر الخارجية العامة ولكن أصغر في الحجم. D) عرض تخطيطي للتشريح الداخلية لB. الكبار الذبابة البيضاء التي تبين مسار اكتساب TYLCV من العناصر النباتية غربال وتداولها ونقلها (الأسهم السوداء). جزيئات الحمراء تشير إلى virions TYLCV. ع: اللحاء، ق: ق tylet؛ البريد: المريء، FC: غرفة التصفية؛ DM: تنازلي المعي المتوسط؛ أنا: تصاعدي المعي المتوسط؛ كاليفورنيا: الجبل؛ الزئبق: المعى المؤخر؛ ق: bacteriocytes؛ باريس سان جيرمان: الغدة اللعابية الابتدائي اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 2
الشكل 2. FISH مزدوجة من Portiera وArsenphonus على B. الذبابة البيضاء س نمط حيوي الكبار (A) والتكبير على المنطقة المسماة (B) على حد سواء تحت قناة حقل مشرق والمقاطع البصرية مجتمعة الكشف عن إشارات الفلورسنت المنبعثة من كل التحقيق. التحقيق Portiera محددة (الحمراء) مترافق إلى Cy5 والتحقيق Arsenphonus محددة ( واستخدمت الصفراء) مترافق إلى CY3. البريد: البيض.خريج "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 3
الرقم 3. FISH مزدوجة من Portiera وHamiltonella على B. واستخدمت الذبابة البيضاء حورية. Portiera التحقيق الخاصة (الحمراء) مترافق إلى Cy5 والتحقيق Hamiltonella محددة (الأخضر) مترافق إلى CY3. A) Hamiltonella إشارة التهجين تم الحصول عليها من المقاطع البصرية مجتمعة وينظر تحت الساحة المظلمة. B) Portiera إشارة التهجين تم الحصول عليها من الجمع بين المقاطع البصرية وينظر تحت الساحة المظلمة. C) Portiera وHamiltonella دمج إشارات تحت حقل مشرق. D) Portiera وHamiltonella إشارات مجتمعة ينظر تحت دامجال كايزرسلوترن. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 4
الشكل 4. FISH مزدوجة من Portiera والريكتسية على B. واستخدمت الذبابة البيضاء حورية. Portiera التحقيق الخاصة (الحمراء) مترافق إلى Cy5 والتحقيق الريكتسية محددة (الازرق) مترافق إلى CY3. A) إشارة التهجين الريكتسية تم الحصول عليها من المقاطع البصرية مجتمعة وينظر تحت الساحة المظلمة. B) Portiera إشارة التهجين تم الحصول عليها من إشارات مجتمعة المقاطع البصرية وينظر تحت الساحة المظلمة. C) Portiera والريكتسية مجتمعة تحت حقل مشرق. D) والريكتسية إشارات مجتمعة تحت الساحة المظلمة. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 5
الرقم 5. FISH من TYLCV على المعي المتوسط ​​تشريح لB. الكبار وقد استخدم الذبابة البيضاء الإناث التي حصلت على الفيروس لمدة 48 ساعة من نبات الطماطم المصابة. TYLCV التحقيق الخاصة (الحمراء) مترافق إلى CY3، وكانت ملطخة المعى المتوسط ​​مع دابي قبل التركيب والتصور. A) والمعي المتوسط ​​تشريح كما يرى من الجمع المقاطع البصرية تحت حقل مشرق. B) TYLCV إشارة FISH (الحمراء) ودابي ملطخة النوى (الأزرق) كما يرى من المقاطع البصرية مجتمعة تحت الساحة المظلمة. FC: غرفة التصفية؛ DM: descendi نانوغرام المعي المتوسط؛ أنا: المعي المتوسط ​​تصاعدي؛ كاليفورنيا: الجبل؛ الزئبق: المعى المؤخر. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 6
الرقم 6. FISH من TYLCV على تشريح الغدة اللعابية الأساسية لB. الكبار وقد استخدم الذبابة البيضاء الإناث التي حصلت على الفيروس لمدة 48 ساعة من نبات الطماطم المصابة. TYLCV التحقيق الخاصة (الحمراء) مترافق إلى CY3، والغدة اللعابية ملطخة دابي قبل التركيب والتصور. أ) اللعابية الابتدائي تشريح وملطخة دابي الغدة كما يرى من المقاطع مجتمعة تحت حقل مشرق. B) إشارة TYLCV FISH (الحمراء) ونوى دابي الملون (الأزرق) كما يرى من المقاطع مجتمعة تحت الساحة المظلمة.ق :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51030/51030fig6highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 7
الرقم 7. FISH من TYLCV على المقطع الطولي قطع اليد من خلال الجذعية النباتية TYLCV المصابة. كان يستخدم مسبار TYLCV محددة (الحمراء) مترافق إلى CY3 وجنبا إلى جنب مع تلوين دابي قبل التركيب والتصور. A) واحدة القسم تظهر مع الأحمر إشارة TYLCV في عنصر غربال اللحاء، ونوى دابي الملون يرى من المقاطع مجتمعة تحت الساحة المظلمة. ب) المقاطع مجتمعة نفسه هو مبين في (أ) تحت حقل مشرق لتحديد اتجاهاتها. فتاه: اللحاء؛ س ص: الخشب انقر هنا لعرض أكبر ايمالعمر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

بروتوكول الموصوفة هنا لتوطين فيروس مصنع في مصنعها المضيف وناقلات الامراض والحشرات، والبكتيريا endosymbiotic في المضيف الذبابة البيضاء محددة، ويمكن تكييفها لتوطين الفيروسات الأخرى في النباتات وحتى في الأنسجة الحيوانية. وعلاوة على ذلك، فإن بروتوكول يمكن استخدامها لتوطين البكتيريا المسببة للأمراض وendosymbiotic والكائنات الدقيقة الأخرى في النظم النباتية والحيوانية. الأساليب المذكورة تعتمد على مفهوم بسيط من التهجين بين قصيرة، fluorescently المسمى DNA-نيوكليوتيدات دقيقة التحقيق والحمض النووي الهدف أو جزيء RNA في الخلية. والنتيجة هي التهجين محددة، مع الحد الأدنى من الخلفية، وإشارة الكشف عن مضان باستخدام المجاهر أو متحد البؤر. عدة تحقيقات مع الأصباغ الفلورية مختلفة، التي تستهدف الجين أكثر من واحد، ويمكن استخدامها في وقت واحد. وهذا يتيح تصور أكثر من هدف واحد في خلية واحدة أو الأنسجة. الإجراءات الموضحة في هذه البروتوكولات هي بسيطة ووقت المعالجة وعينةهو الحد الأدنى. المشاكل المرتبطة البروتوكولات الأخرى مثل إشارة الخلفية عالية، زمن طويل لعينات واستخدام العديد من المواد ومكلفة للتحليل، ليست القيود في بروتوكول الموصوفة هنا.

ب وس biotypes من B. واستخدمت الذباب الأبيض الذبابة البيضاء لوصف البروتوكولات في هذه المخطوطة، ولكن تربية تطبيق الشروط على أي نمط حيوي الذبابة البيضاء، مع النبات العائل كل منهما. والذبابة البيضاء يكمل دورة حياته في ثلاثة أسابيع في ظل الظروف المشار إليها. أصيب كل فرد من السكان استخدام نمط حيوي B مع معايش جواني الأولية Portiera، والبكتيريا endosymbiotic الثانوية Hamiltonella والريكتسية. أصيب الأفراد نمط حيوي س مع Portiera وArsenophonus. عرضت السكان الذبابة البيضاء أخرى في جميع أنحاء العالم لتكون مصابة أو هذه الأنواع البكتيرية endosymbiotic أخرى، ومع localizati المكانية المختلفةعلى أنماط في 16-20 الجسم.

النباتات المصابة تظهر أعراض المرض TYLCV نموذجية ثلاثة أسابيع بعد التلقيح. لTYLCV التعريب والنباتات أعراض يمكن استخدامها لاكتساب الفيروس عن طريق الذباب الأبيض لمدة 24 ساعة، ويمكن الكشف عن الفيروس في النباتات المصابة والحشرات باستخدام بروتوكول FISH المذكورة أعلاه. بينما في الحشرات تحقيقات المستخدمة يمكن مترافق مع العديد من fluorophore التي يمكن استئصاله مع أطوال موجية مختلفة، بما في ذلك CY3 وCy5، في محطات CY3 هو الأكثر مناسبة ولا يتألق في موجات مشابهة لالبلاستيدات الخضراء، العضيات الأكثر وفرة في الخلايا النباتية.

يعتمد النجاح في تنفيذ البروتوكولات وصفها لتوطين البكتيريا والفيروسات في النباتات والحشرات على تثبيت جيدة من العينات لتحسين التصور والاختراق التحقيق، وتصميم جيد لخصوصية التحقيق والمقاصة مع H 2 O 2 في حالة الحشرات كله ل بالتصور إشارة إيتر. في حالة FISH في النباتات، ويجب أن تكون المقاطع من صنع يدوي رقيقة قدر الإمكان لاختراق التحقيق جيدة وأفضل تصور للإشارة. هذا يمكن تحسين وضع ورقة بين قطعتين الستايروفوم للمساعدة في القطع وباستخدام شفرات الحلاقة المهنية التي يمكن شراؤها لهذا الغرض من عدة بائعين.

بروتوكول ليست مناسبة لتوطين التحت خلوية من الأهداف، ومع ذلك فإنه لديه القدرة على وضعها، وذلك باستخدام تنسيق التحقيق تصف هنا، في طريقة مناسبة لتوطين التحت خلوية. على سبيل المثال، تحقيقات قصيرة وصفها هنا يمكن لجزيئات مترافق مثل البيوتين والجزيئات لا الفلورسنت، والتي بدورها يمكن أن تكون مستهدفة باستخدام جزيئات الذهب مترافق إلى streptavidin التي يمكن تصور تحت TEM. هذا التعديل في وقت لاحق يمكن أن تكون مناسبة لتوطين التحت خلوية من عدة أهداف بما في ذلك النصوص الجينات والكائنات الحية الدقيقة. أخيرا، وبروتوكول وصفو هي مناسبة للتهجين مع الأحماض النووية مثل DNA و RNA ولكن ليس البروتينات.

للحصول على أفضل النتائج في البروتوكولات FISH وصفها هنا، فمن الأفضل لاستخدام الحشرات والمواد النباتية الطازجة، فضلا عن تثبيتي، والتهجين مخازن جديدة. وينبغي دائما أن تبقى تحقيقات في -20 درجة مئوية في مأخوذة صغيرة لتجنب تكرار تجميد والذوبان. كان الوقت لتجهيز كل خطوة وصفها يمكن معايرة اعتمادا على الكائنات التي شملتها الدراسة. كما ورد في البروتوكول، وبعد تثبيت وإزالة اللون، يمكن الحفاظ على عينات الذبابة البيضاء والنبات لفترة طويلة في الايثانول المطلق في درجة حرارة الغرفة. هذه الخطوة هي مفيدة بشكل خاص عند إرسال عينات للتجهيز من موقع إلى آخر، أو عند تنفيذ التجارب بالطبع فترة طويلة. ولم تتأثر نوعية إشارة التهجين التالية هذه المحافظة منذ وقت طويل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد البحوث في المختبر بواسطة غانم منحة بحثية لا. 908-42.12/2006 من المؤسسة الألمانية الإسرائيلية (GIF)، منح لا. IS-4062-07 من إسرائيل، الولايات المتحدة الثنائية للصندوق للبحوث الزراعية والتنمية (BARD)، ومنحة بحثية لا. 884/07 من مؤسسة العلوم اسرائيل (ISF) إلى MG

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluorescently labeled  Probes Metabion 20 bp HPLC purified Sequence designed by customer
Toluidine blue Sigma-Aldrich 89640
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771 Molecular Biology Grade
Formamide Sigma-Aldrich F9037 Molecular Biology Grade
Tris-HCl Sigma-Aldrich T5941 Molecular Biology Grade
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Molecular Biology Grade
Liquid Blocker Ted Pella Inc. 22309

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Czosnek, H., Laterrot, H. A worldwide survey of Tomato yellow leaf curl viruses. Arch. Virol. 142, 1391-1406 (1997).
  2. Ling, K. S., Simmons, A. M., Hassell, R. L., Keinath, A. P., Polston, J. E. First report of Tomato Yellow Leaf Curl Virus in South Carolina. Plant Dis. 90, 379 (2006).
  3. Polston, J. E., McGovern, R. J., Brown, L. G. Introduction of Tomato yellow leaf curl virus in Florida and implications for the spread of this and other geminiviruses of tomato. Plant Dis. 83, 984-988 (1999).
  4. Polston, J. E., Rosebrock, T. R., Sherwood, T., Creswell, T., Shoemaker, P. J. Appearance of Tomato yellow leaf curl virus in North Carolina. Plant Dis. 86, 73 (2002).
  5. Frohlich, D. R., Torres-Jerez, I., Bedford, I. D., Markham, P. G., Brown, J. K. A phylogeographical analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrial DNA markers. Mol. Ecol. 8, 1683-1691 (2002).
  6. Ghanim, M., Morin, S., Czosnek, H. Rate of Tomato yellow leaf curl virus translocation in the circulative transmission pathway of its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Phytopathology. 91, 188-196 (2001).
  7. Ghanim, M., Rosell, R. C., Campbell, L. R., Czosnek, H., Brown, J. K., Ullman, D. E. Digestive salivary and reproductive organs of Bemisia tabaci (Gennadius) Hemiptera: Aleyrodidae) B type. J. Morphol. 248, 22-40 (2001).
  8. Hunter, W. B., Hiebert, E., Webb, S. E., Tsai, J. K., Polston, J. E. Location of geminiviruses in the whitefly Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae). Plant Dis. 82, 1147-1151 (1998).
  9. Rosell, R. C., Torres-Jerez, I., Brown, J. K. Temporal pathway of geminivirus in whitefly extracts, saliva, hemolymph and honeydew. Phytopathology. 89, 239-246 (1999).
  10. Czosnek, H., Ghanim, M., Ghanim, M. The circulative pathway of begomoviruses in the whitefly vector Bemisia tabaci—insights from studies with Tomato yellow leaf curl virus. Ann. Appl. Biol. 140, 215-231 (2002).
  11. Gottlieb, Y., et al. The transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virusby the whitefly Bemisiatabaciis correlated with the presence of aspecificsymbiotic bacterium species. J. Virol. 84, 9310-9317 (2010).
  12. Brumin, M., Levy, M., Ghanim, M. Transovarial transmission of Rickettsia spp. and organ-specific infection of the whitefly Bemisia tabaci. Appl. Environ. Microbiol. 78, 5565-5574 (2012).
  13. Ghanim, M., Medina, V. Localization of Tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector Bemisia tabaci. In Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease, Management, Molecular Biology, Breeding for Resistance. Czosnek, H. Springer. New York. 175-187 (2007).
  14. Ghanim, M., Brumin, M., Popovski, S. A simple, rapid and inexpensive method for localization of Tomato yellow leaf curl virus and Potato leafroll virus in plant and insect vectors. J. Virol. Methods. 159, 311-314 (2009).
  15. Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. J. Virol. 86, 13241-13252 (2012).
  16. Nirgianaki, A., et al. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47, 93-101 (2003).
  17. Baumann, P. Biology of bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking insects. Ann. Rev. Microbiol. 59, 155-189 (2005).
  18. Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (Homoptera) Aleyrodidae). App. Environ. Microbiol. 72, 3646-3652 (2006).
  19. Li, Z. X., Lin, H. Z., Guo, X. P. Prevalence of Wolbachia infection in Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 54, 467-471 (2007).
  20. Skaljac, M., Zanic, K., Hrncic, S., Radonjic, S., Perovic, T., Ghanim, M. Diversity and localization of bacterial symbionts in three whitefly species (Hemiptera: Aleyrodidae) from the east coast of the Adriatic. Bull. Entomol. Res. 103, 48-59 (2013).
مضان<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH) لتوطين الفيروسات والبكتيريا Endosymbiotic في النبات والحشرات مناديل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kliot, A., Kontsedalov, S., Lebedev, G., Brumin, M., Cathrin, P. B., Marubayashi, J. M., Skaljac, M., Belausov, E., Czosnek, H., Ghanim, M. Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030, doi:10.3791/51030 (2014).More

Kliot, A., Kontsedalov, S., Lebedev, G., Brumin, M., Cathrin, P. B., Marubayashi, J. M., Skaljac, M., Belausov, E., Czosnek, H., Ghanim, M. Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030, doi:10.3791/51030 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter