Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

פלואורסצנציה Published: February 24, 2014 doi: 10.3791/51030
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1,3, 4, 2, 1
1Department of Entomology, Volcani Center, 2Institute of Plant Sciences and Genetics in Agriculture, Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Hebrew University of Jerusalem, 3Department of Applied Sciences, Institute for Adriatic Crops and Karst Reclamation, 4The Institute of Plant Sciences, Volcani Center

Summary

אנו מתארים כאן הקרינה פשוטה בשיטת הכלאה באתר (FISH) ללוקליזציה של וירוסים וחיידקים ברקמות חרקים וצמחים. פרוטוקול זה יכול להתארך להדמיה של ה-mRNA בהר שלם וחתכים מיקרוסקופיים.

Abstract

הקרינה הכלאה באתרו (FISH) היא שם שניתן למגוון רחב של טכניקות המשמשות בדרך כלל להמחשת תעתיקי גנים בתאי אוקריוטים ויכול להיות שונה יותר לדמיין רכיבים אחרים בתא, כגון הידבקות בוירוסים וחיידקים. לוקליזציה ויזואליזציה של וירוסים וחיידקים, במהלך תהליך ההדבקה המרחבי היא צעד חיוני שמשלים ניסויי פרופיל ביטוי כגון microarrays וRNAseq בתגובה לגירויים שונים. הבנת זיהומי spatiotemporal עם סוכנים אלה משלים ניסויים ביולוגיים להבנת האינטראקציה שלהם עם מרכיבים תאיים. כמה טכניקות להדמית וירוסים וחיידקים כגון מערכות גן כתב או שיטות immunohistochemical הן זמן רב, וחלקם מוגבלים לעבודה עם אורגניזמים מודל וכרוכים במתודולוגיות מורכבות. FISH, כי מטרות מיני RNA או DNA בתא הוא לי קל ומהיר יחסיתthod ללימוד לוקליזציה spatiotemporal של גנים ולמטרות אבחון. שיטה זו יכולה להיות חזקה וקלה יחסית ליישום, כאשר הפרוטוקולים להעסיק הכלאה קצרה, חלליות מסחריות שנרכשו, שאינן יקרים. זה חזק במיוחד כאשר הכנת מדגם, קיבעון, הכלאה, ולהדמיה מיקרוסקופית אינן כרוך בפעולות מורכבות. כאן אנו מתארים פרוטוקול ללוקליזציה של חיידקים ונגיפים ברקמות חרקים וצמחים. השיטה מבוססת על הכנה פשוטה, קיבעון, והכלאה של mounts כל חרקים ואיברים מבותרים או חלקי צמח בעבודת יד, עם 20 זוגות בסיסי בדיקות דנ"א קצרים מצומדת לצבעי ניאון על 5 'או 3' שלהם מסתיימת. פרוטוקול זה יושם בהצלחה במספר רקמות חרקים וצמחים, והוא יכול לשמש כדי לנתח את הביטוי של mRNAs או מיני RNA או DNA אחרים בתא.

Introduction

כאשר לומדים את יחסי הגומלין בין וירוסי צמח ופתוגנים אחרים עם המארחים הצמח הנגועים שלהם, זה חשוב כדי להמחיש את גורמי המחלה וחומצות הגרעין שלהם באתר, ללא קשר אם הם גורמים להשפעות שליליות על מארחיהם. זה חשוב ביותר כאשר לומד תנועת הפתוגן בתוך ובין תאי צמח. בלוקליזציה באתרו של תוצרי גנים של הפתוגן הוא צעד חיוני שמשלים את גישות אחרות ללימוד תהליך פתוגניות. פתוגנים צמח רבים, בעיקר וירוסים, המועברים על ידי חרקים, שיש יחסי גומלין מורכבים ואינטימיים עם הווקטורים שלהם. לוקליזציה של וירוסים אלו בווקטורים שלהם היא חשובה ללימוד בדרך לשידור, ואתרי אינטראקציה האפשריים בתוך הווקטור. העברת של וירוסים מסוימים צמחים וקטורי חרקים נעזרת בחיידקי endosymbiotic הנמצאים בתוך חרקים אלה. כדי לחקור את העברת וירוסי צמח ב האלה טובים יותרy הווקטורים שלהם, הוא גם חיוני כדי להמחיש את חיידקי endosymbiotic באופן כללי, ואלה שהיו מעורבים בהעברת נגיף, בפרט. Colocalization של חיידקי הווירוסים וendosymbiotic וכך רצוי לחוקר את הקשרים האפשריים בין אורגניזמים אלה בתוך מארח החרק שלהם. מלבד העברת נגיף, חיידקי endosymbiotic להשפיע על מספר היבטים של הביולוגיה של וקטורי חרקים, לוקליזציה וכך המרחבי של חיידקים אלה בחרקים היא של ריבית גבוהה וחשיבות.

וירוס סלסול עלים צהובים עגבניות (ירליות) (Begomovirus, Geminiviridae) הוא מורכב החשובה ביותר נגיפית המחלה של עגבניות מעובדות בעולם 1-4. ירליות היא וירוס מוגבל השיפה והווקטורים באופן בלעדי על ידי Bemisia tabaci כנימות 5,6. מודל המתאר את טרנסלוקציה של begomoviruses בוקטורי כנימותיהם הוצע 6-9. שני מחסומים ספציפיים הם חצו באופן פעיל during שידור circulative זה: midgut / hemolymph ומחסומי בלוטת hemolymph / רוק. תהליך העברת זה השערה הוא שמתווך על ידי קולטנים ידועים אשר מזהים את הקופסית הווירוס. הוא חשב ירליות לחצות ב ' midgut tabaci 6,10, והוא נספג דרך בלוטת הרוק העיקרית 6 לפני שהוא מוזרק לתוך הצמח. בhemolymph הכנימות, ירליות אינטראקציה עם חלבון GroEL מיוצר על ידי חיידק endosymbiotic המשני החרקים Hamiltonella. אינטראקציה זו מבטיחה הובלה בטוחה של ירליות בhemolymph, ומגנה עליו מפני התקפה של המערכת החיסונית החרקים 11. Hamiltonella וPortiera, endosymbiont העיקרי של כנימות עש, הם שוכנו בbacteriocytes, חרק תאים הנמצאים בחיידקי hemolymph וendosymbiotic בית 11. B. tabaci נמלי חיידקי endosymbiotic נוספים כולל Rickettsia, Arsenophonus, Wolbachia, ופריטשEA, אשר יכול להיות מקומי בתוך או מחוץ לbacteriocytes, ויש להם השפעות מגוונות על הביולוגיה של החרקים 12.

מספר דיווחים, ניסו ללמוד את הלוקליזציה של ירליות בצמחים וכנימות עש באמצעות פרוטוקולים זמן רב ויקרים, כגון הילוכים מיקרוסקופית אלקטרונים (TEM), נוגדנים ו-RNA באתרם על סעיף בעובי מיקרוסקופי 10,13, מחקר שנערך לאחרונה תאר את הלוקליזציה של וירוסי צמח בתוך המארחים הצמח ווקטור שלהם על ידי שימוש בפרוטוקול פשוט 14. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט ללוקליזציה של ירליות בB. tabaci גזור midguts ובלוטות רוק, ובסעיפים שהוכן מצמחים נגועים ב-ירליות. בנוסף, אנו מתארים את הלוקליזציה של Portiera, endosymbiont העיקרי של B. tabaci, וendosymbionts המשני שלה Hamitonella, Rickettsia וArsenophonus. פרוטוקול זה מבוסס על שימוש בבדיקות דנ"א קצרים, כישכותרתו fluorescently ב -5 בסופו של הדבר 'שלהם, ובאופן ספציפי להכליא רצפים משלימים ברצפי גנים נגיפיים או חיידקים. עיבוד הדגימה הוא קל יחסית ואת האות המתקבלת היא מאוד ספציפית. הפרוטוקול המתואר יכול לשמש כדי למקם וירוסים, חיידקים ומזיקים אחרים במארחי צמחים, בעלי החיים וחרקיהם, והוא יכול עוד לשמש בתרגום ה-mRNA בכל רקמה נתון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנות כלליות כנימות, צמח, ווירוס לניתוח FISH

  1. כנימות עש האחורי B ו-Q biotype על שתילי גפן (Gossypium hirsutum ל קורות חיים. Acala) ולשמור בתוך כלובי חרקים הוכחה וחדרי צמיחה בתנאים סטנדרטיים של 25 ± 2 מעלות צלזיוס, 60% לחות יחסית, ואור 14-HR / photoperiod הכהה 10-HR.
  2. לבצע PCR לבדיקת זיהום עם endosymbionts באמצעות פריימרים endosymbiont ספציפי כמו 15-19 שתואר קודם לכן.
  3. לרכוש שתילי עגבניות (Solanum esculentum קורות חיים. אומצה) ממשתלה מסחרית או זרעי עגבניות צמח.
  4. לשמור באותם תנאי הגידול שתוארו לעיל, עד הצמחים מגיעים לשלב אמיתי עלה ארבעה, הגיל המתאים ביותר עבור חיסון בתיווך כנימות של 15 ירליות (ראה סעיף 4.1 בהמשך).

2. טיפול בחרקים, קיבוע, Probe עיצוב, הכלאה, ויזואליזציה לאנדוFISH סימביונט

  1. לאסוף 10 כנימות עש בוגר על ידי שאיפה מצמחי כותנה, או לבחור 10 -3 או 4 נימפות instar ה מעלי גפן.
  2. מייד לטבול במקבע של Carnoy (חומצת כלורופורם אתנול-אצטית קרחונית, 06:03:01, כרך / כרך) בתוך צינורות Eppendorf. תקן עבור 2 שעות ללילה (רצוי למשך לילה).
  3. להסיר לחלוטין את מקבע והדהות ב6% H 2 O 2 באתנול במשך שעה 2.
  4. לשמר את הדגימות באתנול מוחלט במשך כמה ימים עד מספר שבועות בטמפרטורת חדר, או להמשיך לשלב הבא.
  5. בדיקות עיצוב פריימרים DNA הפוך משלימים המבוססים על גנים RNA ריבוזומלי 16s של כל חיידק. לעיצוב הבדיקות, לקחת בחשבון אותם השיקולים לעיצוב primers PCR. השתמש בבדיקות oligonucleotide BTP1 5'-Cy5-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3 ', RB1 5'-Cy3-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3', BTH 5'-Cy3-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3 "וars2 5'-Cy3-TCATGACCACAACCTCCAAA-3 "למיקוד ספציפי של Portiera, Rickettsia, Hamilonella, וArsenophonus, בהתאמה.
  6. בדיקה ניאון להכליא דגימות לילה בחושך במאגר הכלאה (20 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0, 0.9 M NaCl, 0.01% [wt / כרך] נתרן גופרתי dodecyl, [כרך / כרך] פוראמיד 30%) המכיל 10 pmol לכל מיליליטר . שלב את הבדיקה יותר מפעם אחת עם צבעי ניאון שונים במידת צורך. השתמש whiteflies noninfected עם החיידק הממוקד ודגימות ללא בדיקה בקרות שליליות.
  7. הר את הדגימות כולה, בשקופית מיקרוסקופ, בחיץ ההכלאה הכיל עם חוסם נוזלי, מכסים בפיסת כיסוי, חותמים עם לק, ולהציג תחת הקרינה או מיקרוסקופ confocal.

3. כנימות האיברים Dissection, קיבוע, הכלאה, ויזואליזציה לדגי ירליות

  1. לאסוף כנימות עש בוגרים שגדלו ברציפות על צמחי עגבנייה נגועות ב-ירליות על ידי שאיפה וanesthetize על ידי חשיפה למגבת נייר ספוגה באצטון. לחשוף whiteflies רק 1-2 דקות כמו חשיפה ארוכה מדי לאצטון יכולה לתקן רקמות כנימות עש. השתמש whiteflies nonviruliferous גדל על שיחי עגבניות noninfected ולא דגימות בדיקה עבור פקדים כדי לאשר הכלאה ספציפית.
  2. כנימות עש ההר במיקרוסקופ הדיכאון מחליק לנתיחה איברים באמצעות מיקרוסקופ סטריאו.
  3. משכו ממנו את הראש החרק מprothorax ולנתח בלוטות רוק ב1x PBS בתוספת כתם כחול toluidine 1% להדמיה טובה יותר, בשל גודלם הקטן. לאפשר ספיגת הכתם במשך 2-3 דקות.
  4. משוך את החרקים לגזרים בצומת שבין בית החזה והבטן להתבונן ולגרש את midgut. לגרש את התוכן של הבטן על ידי דחיפה עם מלקחיים בקצה הבטן.
  5. בעדינות להסיר את PBS וtoluidine כחול ומניתוחים מוצלחים ובעדינות להוסיף 300 μl של המקבע של Carnoy לתקן האיברים למשך 5 דקות.
  6. dd מקבע מצד אחד של גם בדיכאון ולא מהחלק העליון כדי למנוע תנועה בלתי מבוקרת של האיברים גזורים. ברגע שנוגע במקבע, האיברים ידבק הזכוכית, וכל התהליך שהם לא יזוזו.
  7. הסר מקבע ולהוסיף 500 μl של חיץ הכלאה בתוספת 10 pmol של חללית ניאון DNA Cy5-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 ", אשר משלים רצף בגן חלבון מעיל ירליות.
  8. להכליא לילה בטמפרטורת חדר בחושך על ידי דוגרים השקופית עם הדגימה בתוך תא לח קטן מורכב מקופסא פלסטיק הקטנה עם נייר מגבת רטוב בתחתית.
  9. בעקבות ההכלאה, להרים את האיברים עם כלי לנתיחה קנס ומהירות להעביר אותם לשקופית מיקרוסקופ טרי המכילה 30 μl של חיץ הכלאה חדש בתוספת DAPI (0.1 מ"ג / מיליליטר ב 1x PBS) והכיל עם חוסם נוזלי.
  10. לכסות את הדגימות עם תלוש כיסוי, לאטום שנינותמסמר h פולני ולהציג תחת הקרינה או מיקרוסקופ confocal.

4. טיפול בצמח, יד חתך, קיבוע, וכלאה לדגי ירליות

  1. לחסן שתילי עגבניות עם ירליות באמצעות חיסון בתיווך כנימות viruliferous. ניתן לאתר את הנגיף בשיטת FISH זה בצמחי symptomless שבוע לאחר חיסון. תסמיני מחלה אופייניים הם לאחר חיסון שלושה שבועות נראה לעין. השתמש בצמחי עגבניות noninfected ולא דגימות בדיקה עבור פקדים כדי לאשר הכלאה ספציפית.
  2. השתמש בסכין גילוח חד היסטולוגית להכנת 2-4 סעיפי יד לחתוך סנטימטר אורך או רוחב של עגבניות גבעולים ועלים.
  3. בצינורות Eppendorf, לתקן את הסעיפים במקבע של Carnoy לשעה 2 בלילה בטמפרטורת חדר.
  4. הסר מקבע ולשמר את החלקים באתנול מוחלט במשך כמה ימים עד מספר שבועות בטמפרטורת חדר, או להמשיך לשלב הבא.
  5. שטוף את החלקיםשלוש פעמים, 1 דקות כל אחד, בחיץ הכלאה.
  6. להכליא חלקים עם 500 μl של חיץ הכלאה בתוספת 10 pmol של חללית ניאון oligonucleotide Cy3-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 "אשר משלים רצף בגן חלבון מעיל ירליות.
  7. שטוף את החלקים שלוש פעמים, 1 דקות כל אחד, בחיץ הכלאה.
  8. סעיפי הר שלם בחיץ הכלאה בתוספת DAPI (0.1 מ"ג / מיליליטר ב 1x PBS) והכילו עם חוסם נוזלי, לכסות עם coverslip, חותמים עם לק ולהציג תחת הקרינה או מיקרוסקופ confocal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המערכת למדה בכתב היד הזה מוצגת באיור 1 וכוללת צמח נגוע עם ירליות, מבוגרים ונימפה של B. הכנימות tabaci, והתמונות של האנטומיה הפנימית של הכנימות המראות את הדרך לטרנסלוקציה ירליות בחרקים. איור 2 מראה דגים כפולים בכנימות בוגרות לסימביונט העיקרי Portiera וסימביונט המשני Arsenophonus. איור 3 מציג FISH הכפול עבור Portiera וHamiltonella, ו איור 4 מראה FISH הכפול עבור Portiera וRickettsia, שני הדמויות בB. נימפה instar 4 ה tabaci. איור 5 מראה דגים לירליות ומכתים DAPI בmidgut כנימות גזורים, ואיור 6 מראה דגים לירליות ומכתים DAPI בבלוטות רוק עיקריות גזור כנימות. איור 7 מראה דגים לירליות ומכתים DAPI בחלקי צמח יד לחתוך נגוע ירליות.

איור 1
איור 1. סקירה כללית של מערכת למדה בכתב היד הזה.) תסמיני מחלה אופייניים הנגרמים על ידי זיהום בנגיף עגבניות עלה צהוב תלתל (ירליות). ב) להציג חיצוני של כנימות בוגרות מבט חיצוני. C) של שלב nymphal 4 ה במחזור החיים התפתחותיים הכנימות. שלבי nymphal אחרים דומים במבט החיצוני הכללי, אך קטנים יותר בגודלם. ד ') בתצוגה סכמטית של האנטומיה הפנימית של ב' למבוגרים tabaci המראה את הדרך של רכישת ירליות מהאלמנטים המפעל המסננת, זרימת וההולכה (חיצים שחורים). חלקיקים אדומים מתייחסים לויריונים ירליות. p: השיפה; s: s tylet; דואר:; fc וושט: תא סינון; dm: midgut יורד; הנני: עולה midgut; ca: caeca; hg: המעי האחורי; לפנה"ס: bacteriocytes; PSG:. בלוטת רוק העיקרית לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2
איור 2. FISH הכפול של Portiera וArsenphonus על B. המבוגרים tabaci Q biotype () ולהתמקד באזור שכותרתו (ב ') שני תחת ערוץ שדה בהיר וחתכים אופטיים משולבים גילוי אותות ניאון הנפלטים על ידי כל חללית. בדיקה Portiera הספציפית (אדום) מצומד לCy5 ובדיקת Arsenphonus הספציפית ( צהוב) מצומדת לCy3 היו בשימוש. דואר: ביצה."Target =" _blank pg "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3
איור 3. דגים זוגי של Portiera וHamiltonella על B. נימפה tabaci. הבדיקה Portiera ספציפית (אדום) מצומד לCy5 ובדיקת Hamiltonella הספציפית (ירוק) מצומדת לCy3 היו בשימוש. אות הכלאה) Hamiltonella מתקבלת מסעיפים אופטיים משולבים ומוצגת תחת שדה חשוך. ב ') אות הכלאת Portiera מתקבלת בשילוב קטעים אופטיים ומוצג תחת שדה חשוך. C) Portiera וHamiltonella התמזגו אותות תחת שדה בהיר. שנצפו אותות משולבים D) Portiera וHamiltonella תחת daשדה RK. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 4
איור 4. דגים זוגי של Portiera וRickettsia על B. נימפה tabaci. הבדיקה Portiera ספציפית (אדום) מצומד לCy5 ובדיקת Rickettsia ספציפי (כחולה) מצומדת לCy3 היו בשימוש.) אות הכלאת Rickettsia מתקבלת מסעיפים אופטיים משולבים ומוצגת תחת שדה חשוך. ב ') אות הכלאת Portiera מתקבלת אותות בשילוב קטעים אופטיים ומוצג תחת שדה חשוך. C) Portiera וRickettsia משולבים תחת שדה בהיר. D) וRickettsia לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 5
איור 5. דגים של ירליות על midgut גזור של ב 'למבוגרים נקבת tabaci שרכשה את הווירוס ל48 שעות מצמח עגבנייה נגועה. בדיקה ירליות ספציפיות (אדום) מצומד לCy3 הייתה בשימוש, וmidgut הייתה מוכתמת עם DAPI לפני ההרכבה וויזואליזציה.) midgut גזור כפי שניתן לראות משילוב סעיפים אופטיים תחת שדה בהיר. ב ') אות ירליות דגים (אדום) וגרעיני DAPI מוכתמים (כחול) כפי שניתן לראות מסעיפים אופטיים משולבים תחת שדה חשוך. fc: תא סינון; dm: descendi midgut ng; הנני: midgut עולה; ca: caeca; hg: המעי האחורי. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 6
איור 6. דגים של ירליות בבלוטת רוק העיקרית גזור של ב 'למבוגרים נקבת tabaci שרכשה את הווירוס ל48 שעות מצמח עגבנייה נגועה. בדיקה ירליות ספציפיות (אדום) מצומד לCy3 הייתה בשימוש, ובלוטת הרוק מוכתמת עם DAPI לפני ההרכבה וויזואליזציה.) הרוק העיקרי גזור וDAPI מוכתם בלוטה כפי שניתן לראות מסעיפים בשילוב תחת שדה בהיר. אות FISH ירליות (אדום) B) וגרעינים DAPI מוכתמים (כחולה) כפי שניתן לראות מסעיפים בשילוב מתחת לשדה חשוך.ים :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51030/51030fig6highres.jpg "= היעד" _blank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 7
איור 7. דגים של ירליות בסעיף אורך יד לחתוך דרך גזע של צמח נגוע ירליות. בדיקה ירליות ספציפית (אדום) מצומד לCy3 שימשה ושילוב עם מכתים DAPI לפני ההרכבה וויזואליזציה.) קטע אחד שמוצג באדום אות ירליות באלמנט מסננת השיפה, וגרעיני DAPI מוכתמים ראו מסעיפים בשילוב מתחת לשדה חשוך. ב ') את הסעיפים משולבים מוצגים ב() תחת שדה בהיר להתמצאות. ph: השיפה; XY:. עצה לחץ כאן לצפייה im הגדול יותרגיל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן ללוקליזציה של וירוס צמח במארח מפעלה ווקטור חרקים, חיידקים וendosymbiotic במארח הכנימות הספציפיים שלהם, יכול להיות מותאם ללוקליזציה של וירוסים אחרים בצמחים ואפילו ברקמות של בעלי חיים. יתר על כן, הפרוטוקול יכול לשמש כדי למקם חיידקים פתוגניים endosymbiotic ומיקרואורגניזמים אחרים במערכות צמחים ובעלי חיים. השיטות שתוארו מסתמכות על רעיון פשוט של הכלאה בין בדיקה קצרה, fluorescently שכותרתו oligonucleotide DNA וה-DNA היעד או מולקולת RNA בתא. התוצאה היא הכלאה ספציפית, עם רקע מינימאלי, ואות שאותרה באמצעות מיקרוסקופים הקרינה או confocal. כמה בדיקות עם צבעי ניאון שונים, המתמקדות בגן אחד או יותר, ניתן להשתמש בו זמנית. זה מאפשר לדמיין יעד אחד או יותר בתא או רקמה אחת. ההליכים מתוארים בפרוטוקולים אלה הם פשוטים וזמן עיבוד המדגםהוא מינימאלי. בעיות הקשורות לפרוטוקולים אחרים כגון אות רקע גבוה, זמן עיבוד ארוך לדגימות ושימוש בחומרים רבים ויקרים לניתוח, אינן אילוצים בפרוטוקול המתואר כאן.

Biotypes B ו-Q של B. כנימות עש tabaci שימשו כדי לתאר את הפרוטוקולים בכתב היד הזה, עם זאת, גידול בתנאים חלים על כל biotype כנימות, עם הצמח הפונדקאי שלהם בהתאמה. הכנימות משלימה מחזור החיים שלו בשלושה שבועות בתנאים מצויינים. כל פרט באוכלוסיית biotype B בשימוש היה נגוע בendosymbiont העיקרי Portiera, וחיידקי endosymbiotic המשניים Hamiltonella וRickettsia. האנשים biotype Q היו נגועים בPortiera וArsenophonus. אוכלוסיות כנימות אחרות ברחבי העולם הוצגו להיות נגועים או אלה מיני חיידקי endosymbiotic אחרים, ועם localizati מרחביים שונהעל דפוסים ב16-20 הגוף.

צמחים נגועים ירליות להראות תסמיני מחלה אופייניים שלושה שבועות בעקבות החיסון. ללוקליזציה ירליות, צמחי סימפטומטי יכולים לשמש לרכישת נגיף על ידי כנימות עש ל24 שעות וניתן לאתר הווירוס בצמחים וחרקים נגועים באמצעות פרוטוקול FISH שתואר לעיל. בעוד שבחרקים יכולות להיות מצומדת הבדיקות בשימוש עם הרבה fluorophore אשר יכול נכרת עם אורכי גל שונים, כולל Cy3 וCy5, בצמחי Cy3 הוא המתאים ביותר ולא לזרוח באורכי גל דומים כמו כלורופלסטים, אברונים הנפוצים ביותר בתא הצמח.

יישום מוצלח של הפרוטוקולים תיארו ללוקליזציה של חיידקים ווירוסים בצמחים וחרקים תלויים בקיבוע טוב של הדגימות להדמיה טובה יותר וחדירת בדיקה, עיצוב בדיקה טוב לייחוד וסליקה עם H 2 O 2 במקרה של כל חרקים ל בהדמיה אות אטר. במקרה של דגים בצמחים, חלקים בעבודת יד חייבים להיות דקים ככל האפשר לחדירת בדיקה טובה ויזואליזציה טובה יותר של האות. זה יכול להיות משופר על ידי לשים את העלה בין שתי חתיכות קלקר כדי לעזור עם חיתוך ובאמצעות סכיני גילוח מקצועיים שניתן לרכוש למטרה זו מכמה ספקים.

הפרוטוקול אינו מתאים ללוקליזציה subcellular של מטרות, עם זאת יש לו את הפוטנציאל להיות מפותחים, שימוש בתבנית הבדיקה מתארת ​​כאן, לשיטה מתאימה ללוקליזציה subcellular. לדוגמא, הבדיקות קצרות המתוארות כאן יכולות להיות מצומדת למולקולות כגון ביוטין ומולקולות לא ניאון, אשר בתורו יכול להיות ממוקדת באמצעות חלקיקי זהב מצומדת לstreptavidin שניתן דמיינו תחת TEM. שינוי מאוחר יותר זה יכול להיות מתאים ללוקליזציה subcellular של כמה יעדים כולל תעתיקי גנים ומיקרואורגניזמים. לבסוף, הפרוטוקול המתוארים מתאים להכלאה עם חומצות גרעין כגון DNA ו-RNA אך לא חלבונים.

לקבלת התוצאות הטובות ביותר בפרוטוקולים FISH המתוארים כאן, עדיף להשתמש בחרקים טריים וחומר צמחי, כמו גם מאגרים מקבע והכלאה טריים. תמיד צריכה להיות כל הזמן בבדיקות -20 מעלות צלזיוס בaliquots הקטנים כדי להימנע מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות. זמן העיבוד של כל צעד שתואר יכול להיות מכויל בהתאם ליצורים שנחקרו. כפי שהוזכר בפרוטוקול, לאחר קיבוע ודהיית צבע, ניתן לשמר דגימות כנימות וצמח במשך זמן רב באתנול מוחלט בטמפרטורת חדר. צעד זה הוא שימושי במיוחד בעת שליחת דגימות לעיבוד ממקום אחד למשנו, או בעת ביצוע ניסויים כמובן זמן רב. איכות אות ההכלאה לא נפגעה בעקבות שימור זמן הארוך הזה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

מחקר במעבדה גאנם נתמכה על ידי מענק מחקר לא. 908-42.12/2006 מהקרן הגרמנית ישראלית (GIF), מענק לא. IS-4062-07 מארצות הברית וישראל דו הלאומית קרן החקלאות ארצות המחקר ופיתוח (BARD), ומענק מחקר לא. 884/07 מקרן הלאומית למדע (ISF) לMG

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluorescently labeled  Probes Metabion 20 bp HPLC purified Sequence designed by customer
Toluidine blue Sigma-Aldrich 89640
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771 Molecular Biology Grade
Formamide Sigma-Aldrich F9037 Molecular Biology Grade
Tris-HCl Sigma-Aldrich T5941 Molecular Biology Grade
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Molecular Biology Grade
Liquid Blocker Ted Pella Inc. 22309

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Czosnek, H., Laterrot, H. A worldwide survey of Tomato yellow leaf curl viruses. Arch. Virol. 142, 1391-1406 (1997).
  2. Ling, K. S., Simmons, A. M., Hassell, R. L., Keinath, A. P., Polston, J. E. First report of Tomato Yellow Leaf Curl Virus in South Carolina. Plant Dis. 90, 379 (2006).
  3. Polston, J. E., McGovern, R. J., Brown, L. G. Introduction of Tomato yellow leaf curl virus in Florida and implications for the spread of this and other geminiviruses of tomato. Plant Dis. 83, 984-988 (1999).
  4. Polston, J. E., Rosebrock, T. R., Sherwood, T., Creswell, T., Shoemaker, P. J. Appearance of Tomato yellow leaf curl virus in North Carolina. Plant Dis. 86, 73 (2002).
  5. Frohlich, D. R., Torres-Jerez, I., Bedford, I. D., Markham, P. G., Brown, J. K. A phylogeographical analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrial DNA markers. Mol. Ecol. 8, 1683-1691 (2002).
  6. Ghanim, M., Morin, S., Czosnek, H. Rate of Tomato yellow leaf curl virus translocation in the circulative transmission pathway of its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Phytopathology. 91, 188-196 (2001).
  7. Ghanim, M., Rosell, R. C., Campbell, L. R., Czosnek, H., Brown, J. K., Ullman, D. E. Digestive salivary and reproductive organs of Bemisia tabaci (Gennadius) Hemiptera: Aleyrodidae) B type. J. Morphol. 248, 22-40 (2001).
  8. Hunter, W. B., Hiebert, E., Webb, S. E., Tsai, J. K., Polston, J. E. Location of geminiviruses in the whitefly Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae). Plant Dis. 82, 1147-1151 (1998).
  9. Rosell, R. C., Torres-Jerez, I., Brown, J. K. Temporal pathway of geminivirus in whitefly extracts, saliva, hemolymph and honeydew. Phytopathology. 89, 239-246 (1999).
  10. Czosnek, H., Ghanim, M., Ghanim, M. The circulative pathway of begomoviruses in the whitefly vector Bemisia tabaci—insights from studies with Tomato yellow leaf curl virus. Ann. Appl. Biol. 140, 215-231 (2002).
  11. Gottlieb, Y., et al. The transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virusby the whitefly Bemisiatabaciis correlated with the presence of aspecificsymbiotic bacterium species. J. Virol. 84, 9310-9317 (2010).
  12. Brumin, M., Levy, M., Ghanim, M. Transovarial transmission of Rickettsia spp. and organ-specific infection of the whitefly Bemisia tabaci. Appl. Environ. Microbiol. 78, 5565-5574 (2012).
  13. Ghanim, M., Medina, V. Localization of Tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector Bemisia tabaci. In Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease, Management, Molecular Biology, Breeding for Resistance. Czosnek, H. , Springer. New York. 175-187 (2007).
  14. Ghanim, M., Brumin, M., Popovski, S. A simple, rapid and inexpensive method for localization of Tomato yellow leaf curl virus and Potato leafroll virus in plant and insect vectors. J. Virol. Methods. 159, 311-314 (2009).
  15. Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. J. Virol. 86, 13241-13252 (2012).
  16. Nirgianaki, A., et al. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47, 93-101 (2003).
  17. Baumann, P. Biology of bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking insects. Ann. Rev. Microbiol. 59, 155-189 (2005).
  18. Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (Homoptera) Aleyrodidae). App. Environ. Microbiol. 72, 3646-3652 (2006).
  19. Li, Z. X., Lin, H. Z., Guo, X. P. Prevalence of Wolbachia infection in Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 54, 467-471 (2007).
  20. Skaljac, M., Zanic, K., Hrncic, S., Radonjic, S., Perovic, T., Ghanim, M. Diversity and localization of bacterial symbionts in three whitefly species (Hemiptera: Aleyrodidae) from the east coast of the Adriatic. Bull. Entomol. Res. 103, 48-59 (2013).

Tags

זיהום גיליון 84 דגים לוקליזציה חרקים צמחים וירוסים endosymbiont תמליל קיבעון מיקרוסקופיה confocal
פלואורסצנציה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאות (דגים) ללוקליזציה של וירוסים וחיידקים Endosymbiotic בצמח ורקמות חרקים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kliot, A., Kontsedalov, S., Lebedev, … More

Kliot, A., Kontsedalov, S., Lebedev, G., Brumin, M., Cathrin, P. B., Marubayashi, J. M., Skaljac, M., Belausov, E., Czosnek, H., Ghanim, M. Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030, doi:10.3791/51030 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter