Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Флуоресценция doi: 10.3791/51030 Published: February 24, 2014

Summary

Мы описываем здесь простой флуоресценции в гибридизация (FISH) метод локализации вирусов и бактерий в насекомых и растительных тканей. Этот протокол может быть продлен для визуализации мРНК в целом горе и срезах.

Abstract

Флуоресценции в гибридизация (FISH) является имя, данное различными методами, обычно используемых для визуализации генных транскриптов в эукариотических клетках и могут быть дополнительно модифицированы, чтобы визуализировать другие компоненты в клетке, такие как инфекции с вирусами и бактериями. Пространственная локализация и визуализация вирусов и бактерий во время инфекционного процесса является важным шагом, который дополняет профилирование экспрессии эксперименты, такие как микрочипы и RNAseq в ответ на различные стимулы. Понимание пространственно-временных инфекции с этими агентами дополняет биологические эксперименты, направленные на понимание их взаимодействия с клеточными компонентами. Несколько методов для визуализации вирусы и бактерии, такие как системы гена-репортера или иммуногистохимических способов отнимают много времени, а некоторые ограничены работать с модельных организмов и включают сложные методики. РЫБЫ, что цели РНК или ДНК видов в клетке является относительно легко и быстро меняТПК для изучения пространственно-временной локализации генов и для диагностических целей. Этот метод может быть надежными и относительно легко реализовать, когда протоколы используют короткий гибридизации, коммерчески-приобретенные зондов, которые не являются дорогими. Это особенно надежной, когда пробоподготовка, фиксация, гибридизация и микроскопическая визуализация не связано с рядом сложных шагов. Здесь мы опишем протокол для локализации бактерий и вирусов в насекомых и растительных тканей. Метод основан на простого приготовления, фиксации и гибридизации насекомых тотальных препаратов и рассеченных органов или ручной частей установки, с 20 пар оснований короткие ДНК-зонды, конъюгированные с флуоресцентных красителей на их 5'-или 3'-концами. Этот протокол был успешно применен к ряду насекомых и растительных тканей, и могут быть использованы для анализа экспрессии мРНК или других РНК или ДНК видов в клетке.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

При изучении взаимодействия между растительных вирусов и других патогенов с их зараженных растений хозяев, важно, чтобы визуализировать патогены и их соответствующих нуклеиновых кислот в месте, независимо ли они вызывать отрицательные эффекты на их хозяев. Это особенно важно при изучении движения патогена внутри и между клеток растений. В месте локализации генных продуктов возбудителя является важным шагом, который дополняет другие подходы к изучению процесса патогенности. Многие патогены растений, особенно вирусы, передаются насекомыми, имеющие сложные и интимные взаимодействия с их переносчиков. Локализация этих вирусов в их векторов имеет важное значение для изучения путь для передачи, а также возможные сайты взаимодействия внутри вектора. Передача некоторых вирусов растений насекомых-векторная оказывается помощь эндосимбиотических бактерий, которые проживают в пределах этих насекомых. Чтобы лучше изучить передачу этих вирусов растений бу их векторы, важно также, чтобы визуализировать эндосимбиотических бактерии в целом, и тех, кто участвует в передачи вируса, в частности. Колокализации вирусных и эндосимбиотических бактерий Таким образом, желательно за расследование возможных связей между этими организмами в пределах своей насекомых хозяина. Помимо передачи вируса, эндосимбиотических бактерии влияют несколько аспектов биологии насекомых-переносчиков, тем самым пространственная локализация этих бактерий в течение насекомых представляет большой интерес и важность.

Томатный желтый лист локон вирус (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae) является наиболее важным вирусное заболевание комплекс культивируемых помидор по всему миру 1-4. TYLCV это вирус флоэмы ограниченной и исключительно векторением по белокрылки Bemisia tabaci 5,6. Предложена модель, описывающая транслокацию begomoviruses в их белокрылки векторов было предложено 6-9. Два конкретных барьеров активно перешли мажорING этот circulative передач: средняя кишка / гемолимфы и гемолимфы / слюнных желез барьеры. Этот процесс передачи Предполагается, посредничестве неизвестных рецепторов, которые распознают вирус капсида. TYLCV, как полагают, чтобы пересечь B. tabaci средней кишки 6,10, и поглощается через первичный слюнной железы 6, прежде чем он будет введен в растение. В белокрылки гемолимфы, TYLCV взаимодействует с белком GroEL производимого насекомых вторичного эндосимбиотических бактерии Hamiltonella. Это взаимодействие обеспечивает безопасную перевозку TYLCV в гемолимфе, и защищает его от нападения насекомых иммунной системы 11. Hamiltonella и Portiera, первичный эндосимбионта из белокрылки, размещены в bacteriocytes, клетки насекомых, найденные в гемолимфе и дом эндосимбиотических бактерий 11. B. tabaci таит дополнительные эндосимбиотических бактерий, включая риккетсий, Arsenophonus, Wolbachia и Фричаеа, который может быть локализован внутри или за пределами bacteriocytes, и имеют различные эффекты на биологии насекомого 12.

Несколько докладов пытались изучить локализацию TYLCV в растениях и белокрылки с помощью трудоемких и дорогостоящих протоколов, таких как просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), антител и РНК на месте на микроскопическом толщиной разделе 10,13, недавнее исследование описано локализацию растительных вирусов внутри их растений и векторных хозяев, используя простой протокол 14. Здесь мы опишем простой протокол для локализации TYLCV в B. tabaci расчлененный midguts и слюнных желез, и в разделах получены из TYLCV-инфицированных растений. Мы дополнительно описывают локализацию Portiera, первичной эндосимбионта из B. tabaci, и его вторичные эндосимбионты Hamitonella, риккетсии и Arsenophonus. Этот протокол основан на использовании коротких ДНК-зондов, которыефлуоресцентно меченый на их 5'-конце и специфической гибридизации с комплементарными последовательностями в вирусных или бактериальных последовательностей генов. Обработка образца относительно легко и сигнал, полученный высоко специфичен. Описанный протокол может быть использован для локализации вирусы, бактерии и другие патогены в их растений, животных и насекомых хозяев, и может быть дополнительно использован для локализации мРНК в той или иной ткани.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Генеральный белокрылка, завод, и вирусов Подготовка к FISH анализа

  1. Задняя B и Q биотипа белокрылки на хлопковых рассады (Gossypium Hirsutum Л. резюме. Ачала) и поддержания внутри насекомых-доказательство клетках и комнат роста при стандартных условиях 25 ± 2 ° C, относительной влажности 60%, и 14-ч света / 10-ч темноты фотопериода.
  2. Выполните ПЦР для проверки инфекции с эндосимбионтов использованием эндосимбионта-специфических праймеров, как описано выше 15-19.
  3. Покупка рассады томатов (Solanum Esculentum резюме. Бифштекс) с коммерческой детской или семена томатов растений.
  4. Поддержание в тех же условиях, описанных выше выращивания растения, пока не будет достигнут четыре правда листьев этап, возраст наиболее подходящий для белокрылки-опосредованной инокуляции TYLCV 15 (см. раздел 4.1 ниже).

2. Насекомое Погрузка, фиксация, зонд Дизайн, Гибридизация, и Визуализация для Эндосимбионтом РЫБЫ

  1. Соберите 10 взрослых белокрылок стремлением от хлопчатника, или забрать 10 3-е или 4-е Instar нимф из листьев хлопчатника.
  2. Сразу погрузиться фиксатором Карнуа (хлороформ-этанол-ледяной уксусной кислоты, 6:03:01, объем / объем) внутри пробирки Эппендорф. Fix в течение 2 часов в течение ночи (желательно на ночь).
  3. Полностью удалите фиксатор и обесцветить в 6% H 2 O 2 в этаноле в течение 2 часов.
  4. Сохранение образцов в абсолютном этаноле в течение нескольких дней до нескольких недель при комнатной температуре, или перейти к следующему шагу.
  5. Дизайн зонды в качестве дополнительных обратных праймеров ДНК на основе 16S рибосомальной РНК-генов каждого бактерии. Для проектирования зондов, принять на счет те же соображения для разработки праймеров ПЦР. Используйте олигонуклеотидных зондов BTP1 5'-Су5-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3 ', Rb1 5'-Су3 TCCACGTCGCCGTCTTGC-3', BTH 5'-Су3 CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3 'и Ars2 5'-cy3-TCATGACCACAACCTCCAAA-3 'для конкретной адресности Portiera, риккетсий, Hamilonella и Arsenophonus соответственно.
  6. Гибридизации пробы течение ночи в темноте в гибридизации буфера (20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 0,9 М NaCl, 0,01% [вес / объем] додецилсульфата натрия, 30% [объем / объем] формамид), содержащей 10 пмоль флуоресцентного зонда на мл . Объединить более одного зонда с различными флуоресцентными красителями, если необходимо. Используйте неинфицированных белокрылок с целевым бактерии и образцов не-зонда в качестве отрицательных контролей.
  7. Установите образцы вся, на предметное стекло микроскопа, в гибридизации буфера, содержащейся с жидким блокатор, накрыть покровным, печать с лаком для ногтей, и вид под флуоресценции или конфокальной микроскопии.

3. Белокрылка Орган Рассечение, фиксация, Гибридизация, и Визуализация для TYLCV РЫБЫ

  1. Соберите взрослых белокрылок постоянно выращенных на TYLCV-инфицированных растений томата стремлением и анеsthetize воздействием бумажным полотенцем, пропитанной ацетоном. Expose белокрылок только в течение 1-2 мин, как слишком длительное воздействие ацетона можете исправить белокрылки тканей. Используйте nonviruliferous белокрылок выращенных на неинфицированных растений томата и никаких образцов зонд для контроля, чтобы подтвердить специфической гибридизации.
  2. Mount белокрылки на депрессии стекла микроскопа для органа вскрытия с помощью Стерео микроскоп.
  3. Потяните прочь насекомых голову от переднегруди и анализировать слюнных желез в 1x PBS с добавлением 1% толуидиновым синевы для лучшей визуализации, из-за их малого размера. Разрешить поглощение пятно в течение 2-3 мин.
  4. Потяните насекомое друг от друга на стыке между грудной клетки и брюшной полости, чтобы наблюдать и изгнать из в кишки. Выгнать содержимое брюшной полости, нажав щипцами на животе чаевых.
  5. Аккуратно снимите PBS и толуидиновым синим от успешных вскрытий и осторожно добавить 300 мкл фиксатором Карнуа исправить органы в течение 5 мин.
  6. дд фиксатором с одной стороны депрессивного скважины, а не сверху, чтобы предотвратить неконтролируемое движение рассеченных органов. После прикосновения к фиксатором, органы будут придерживаться к стеклу, и на протяжении всего процесса они не будут двигаться.
  7. Удалить фиксатор и добавить 500 мкл буфера для гибридизации с добавлением 10 пмоль флуоресцентного зонда ДНК Cy5-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 ', которая является комплементарной последовательности в геном белка оболочки TYLCV.
  8. Гибридизации на ночь при комнатной температуре в темноте путем инкубации слайда с образцом внутри небольшой влажной камере, состоящей из небольшой пластиковой коробке с мокрым бумажным полотенцем внизу.
  9. После гибридизации, забрать органы с тонкой инструмента рассечение и быстро переместить их в свежем стекло микроскопа, содержащего 30 мкл новый буфер гибридизации с добавкой DAPI (0,1 мг / мл в 1x PBS) и содержащиеся жидким блокатора.
  10. Покройте образцы с покровным, печать остроумиеч лак для ногтей и вид под флуоресценции или конфокальной микроскопии.

4. Обращение завод, ручной секционирования, фиксация и Гибридизация для TYLCV РЫБЫ

  1. Привить рассады томатов с TYLCV помощью содержащий вирус белокрылки опосредованного прививку. Вирус может быть обнаружен с помощью этого метода FISH в бессимптомно растений через неделю после прививки. Симптомы Типичные болезни могут видеть три недели после прививки. Используйте неинфицированных растений томата и никаких образцов датчиков для контроля, чтобы подтвердить специфической гибридизации.
  2. Используйте острый гистологическое лезвие для подготовки вручную вырезать 2-4 см длинные продольные или поперечные сечения помидор стебли и листья.
  3. В пробирки Эппендорфа, исправить секции фиксатором Карнуа в течение 2 ч в течение ночи при комнатной температуре.
  4. Удалить фиксатор и сохранить разделы в абсолютном этаноле в течение нескольких дней до нескольких недель при комнатной температуре, или перейти к следующему шагу.
  5. Вымойте разделытри раза, 1 мин каждый, в гибридизации буфера.
  6. Гибридизуются секции с 500 мкл буфера для гибридизации с добавлением 10 пмоль флуоресцентного олигонуклеотидного зонда Cy3-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 ', которая является комплементарной последовательности в геном белка оболочки TYLCV.
  7. Вымойте секций в три раза, 1 мин каждый, в гибридизации буфера.
  8. Разделы Mount целые в гибридизации буфера с добавлением DAPI (0,1 мг / мл в 1x PBS) и содержащиеся жидким блокатор, накрыть покровным, печать с лаком для ногтей и видом под флуоресценции или конфокальной микроскопии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Система учился в этой рукописи показано на рисунке 1 и включает зараженный растение с TYLCV, взрослый и нимфу белокрылки B. tabaci, а внутренняя анатомия белокрылки, показывая путь к TYLCV транслокации в насекомое. Рисунок 2 показывает двойной рыбы во взрослой белокрылки для первичной симбионта Portiera и вторичной симбионта Arsenophonus. Рисунок 3 показывает двойной рыбы для Portiera и Hamiltonella, и Рисунок 4 показывает двойной рыбы для Portiera и риккетсий, обоих рисунках в В. tabaci 4-й возрастной стадии нимфы. Рисунок 5 показывает рыбу для TYLCV и окрашивания DAPI в белокрылки расчлененный кишки, и 6 показана рыбу для TYLCV и окрашивания DAPI в расчлененных белокрылки первичных слюнных желез. Рисунок 7 показывает рыбу для TYLCV и DAPI окрашивания вручной огранки TYLCV-инфицированных производственные участки.

Рисунок 1
Рисунок 1. Общий обзор системы учился в этой рукописи. A) Типичные симптомы заболевания, вызванные инфекцией с томатным желтый лист локон вируса (TYLCV). B) Внешний вид взрослой белокрылки. C) Внешний вид на 4-м этапе нимфальной в белокрылки развития жизненного цикла. Другие личиночные стадии схожи в общем внешнем виде, но меньше по размеру. D) Схематическое изображение внутренней анатомии взрослого B. tabaci показывая путь приобретения TYLCV из элементов сит растений, обращения и передачи (черные стрелки). Красные частицы относятся к TYLCV вирионов. р: флоэмы; ы: с tylet; е: пищевод; ФК: фильтровальная камера; дм: по нисходящей средней кишки; я: по возрастанию среднюю кишку; ок: придатков; HG: задняя кишка; BC: bacteriocytes; ПСЖ:. первичная слюнных желез Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 2
Рисунок 2. Двухместный рыба Portiera и Arsenphonus на В. tabaci Q биотип взрослых (A) и увеличения на меченого области (В) и при ярком канал поля и объединенные оптические секций детектирования флуоресцентных сигналов, испускаемых каждым зондом. Portiera-специфический зонд (красный), конъюгированного с Су5 и Arsenphonus-специфического зонда ( желтый), конъюгированного с Cy3 были использованы. е: яйцо.пг "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 3
Рисунок 3. Двойной рыбы из Portiera и Hamiltonella на B. были использованы tabaci нимфа. Portiera-специфический зонд (красный), конъюгированного с Cy5 и Hamiltonella-специфического зонда (зеленый), конъюгированного с Cy3.) Hamiltonella гибридизации сигнал, полученный от комбинированных оптических секций и смотреть под темном поле. Б) Portiera гибридизации сигнал, полученный от в сочетании оптических срезов и смотреть под темном поле. C) Portiera и Hamiltonella объединены сигналы при ярком поле. D) Portiera и Hamiltonella объединенные сигналы смотреть под даполе гк. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 4
Рисунок 4. Двойной рыбы из Portiera и риккетсий на B. были использованы tabaci нимфа. Portiera-специфический зонд (красный), конъюгированного с Cy5 и Риккетсия-специфического зонда (голубой), конъюгированного с Cy3.) Риккетсия сигнал гибридизации получены из комбинированных оптических срезов и смотреть под темном поле. Б) Portiera гибридизации сигнал, полученный от в сочетании оптических срезов и смотреть под темном поле. C) Portiera и риккетсии объединенные сигналы при ярком поле. D) риккетсии объединенные сигналы под темном поле. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 5
Рисунок 5. РЫБЫ из TYLCV на рассеченной кишки взрослого B. был использован tabaci женщины, которые заразились в течение 48 часов с зараженного растения томата. TYLCV-зондом, специфичным (красный), конъюгированного с Cy3 и средней кишки окрашивали DAPI перед установкой и визуализация.) рассеченные среднюю кишку, как видно из комбинации оптические секции при ярком поле. Б) TYLCV РЫБЫ сигнал (красный) и DAPI окрашенных ядер (синий), как видно из комбинированных оптических секций под темном поле. ФК: фильтровальная камера; дм: descendi нг средней кишки; я: по возрастанию средней кишки; ок: придатков; HG: задняя кишка. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 6
Рисунок 6. РЫБЫ из TYLCV на рассеченной первичной слюнной железы взрослой B. был использован tabaci женщины, которые заразились в течение 48 часов с зараженного растения томата. TYLCV-зондом, специфичным (красный), конъюгированного с Cy3 и слюнных желез окрашивали DAPI перед установкой и визуализация.) рассекали и DAPI окрашенных первичной слюнных железа, как видно из секций, соединенных друг под яркой области. B) TYLCV РЫБЫ сигнал (красный) и DAPI окрашенных ядер (синие), как видно из секций, соединенных друг под темном поле.с :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51030/51030fig6highres.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 7
На рисунке 7. FISH из TYLCV на ручной сократить продольный разрез ствола TYLCV-инфицированных растений. TYLCV-специфический зонд (красный), конъюгированного с Су3 был использован и в сочетании с окрашивания DAPI перед монтажом и визуализации.) Одной секции, показанной с красным Сигнал TYLCV в флоэмы сито элемента, и DAPI окрашенные ядра видно из секций, соединенных друг под темном поле. б) То же сочетаемых отделения, показанные на (А) при ярком поле для ориентации. тел: флоэмы; ху:. ксилемы Нажмите здесь, чтобы увеличить внутримышечновозраст.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Протокол, описанный здесь для локализации вируса растений в ее растения-хозяина и вектора насекомых, и эндосимбиотических бактерий в их конкретном узле белокрылки, могут быть адаптированы для локализации других вирусов в растениях и даже в животных тканях. Кроме того, протокол может быть использован для локализации эндосимбиотических и патогенные бактерии и другие микроорганизмы в растительных и животных систем. Описанные методы основаны на простой концепции гибридизации между короткой, флуоресцентно-меченного олигонуклеотидного зонда ДНК и ДНК-мишени или молекулы РНК в клетке. Результатом является специфическая гибридизация, с минимальным фоне, и сигнал обнаружены с помощью флуоресценции или конфокальные микроскопы. Несколько зонды с различными флуоресцентными красителями, которые нацелены на более чем один ген, могут быть использованы одновременно. Это позволяет визуализировать более одной цели в одной клетке или ткани. Процедуры, описанные в этих протоколах просты и время обработки образцаминимальна. Проблемы, связанные с другими протоколами, такими как высокий фоновый сигнал, долгого времени обработки для образцов и использование многочисленных и дорогостоящих материалов для анализа, не являются ограничениями в протокол, описанный здесь.

The B и Q биотипов B. tabaci белокрылки были использованы для описания протоколов в этой рукописи, однако, по воспитанию условия применяются к любой белокрылки биотипа, с их соответствующими растения-хозяина. Белокрылка завершает свой жизненный цикл в течение трех недель при указанных условиях. Каждый человек населения B биотипа используемой был заражен первичного эндосимбионта Portiera, и вторичные эндосимбиотических бактерии Hamiltonella и риккетсии. Биотипа лица Q были инфицированы Portiera и Arsenophonus. Другие белокрылки населения во всем мире были показаны быть инфицированы они или другие эндосимбиотических видов бактерий, и с разных пространственных localizatiна моделях в 16-20 тела.

TYLCV инфицированные растения показать типичные симптомы болезни три недели после прививки. Для локализации TYLCV, симптоматические растения могут быть использованы для получения вируса на белокрылки в течение 24 ч и вирус может быть обнаружен в зараженных растений и насекомых с использованием протокола FISH, описанную выше. В то время как у насекомых зонды, используемые может быть сопряжен с многими флуорофором которые могут вырезали с различными длинами волн, в том числе Cy3 и Cy5, в растениях Су3 является наиболее подходящим и не флуоресцирует в аналогичных длинах волн, как хлоропласты, наиболее распространенных органелл в клетке растения.

Успешная реализация описанных протоколов для локализации бактерий и вирусов в растениях и насекомых зависит от хорошей фиксации образцов для лучшей визуализации и проникновения зонда, хороший дизайн зонда для специфики и клиринга с Н 2 О 2 в случае целых насекомых для бЭттер визуализации сигнала. В случае FISH в растениях, ручной секции должны быть как можно тоньше для хорошего проникновения зонда и лучшей визуализации сигнала. Это могут быть улучшены, поместив лист между двумя пенопластовые части, чтобы помочь с резки и с помощью профессиональных бритвенных лезвий, которые можно приобрести для этой цели у нескольких поставщиков.

Протокол не подходит для внутриклеточной локализации целей, однако она имеет потенциал для развития, используя формат зонд описать здесь, в подходящий метод для внутриклеточной локализации. Например, короткие зонды, описанные здесь, могут быть конъюгированы с молекулами, такими как биотин и не флуоресцентных молекул, которые в свою очередь могут быть направлены с использованием частицы золота конъюгированные со стрептавидином, которые могут быть визуализированы под ТЭМ. Это позже модификация могут быть пригодны для внутриклеточной локализации нескольким целям, включая генных транскриптов и микроорганизмов. Наконец, описанный протоколс пригодны для гибридизации с нуклеиновыми кислотами, такими как ДНК и РНК, но не белков.

Для получения наилучших результатов в протоколах РЫБЫ описанных здесь, то лучше использовать свежие насекомых и растительного материала, а также свежего фиксатора и гибридизации буферов. Зонды следует всегда иметь в -20 º C малыми порциями, чтобы избежать повторного замораживания и оттаивания. Время обработки каждого описанного шага может быть откалиброван в зависимости от организмов изучены. Как уже упоминалось в протоколе, после фиксации и обесцвечивания, белокрылки и растений образцы могут быть сохранены в течение длительного времени в абсолютном этаноле при комнатной температуре. Этот шаг является особенно полезным при отправке образцов для обработки от одного места в другое, или при выполнении долгое время курса эксперименты. Качество сигнала гибридизации не был затронут после этого сохранения длительного времени.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

не Исследования в лаборатории Ганим поддержали исследовательского гранта не. 908-42.12/2006 от немецко-израильского фонда (МФП), грант №. IS-4062-07 от Соединенных Штатов-Израиль Двусторонней сельскохозяйственных исследований и развития фонда (бард), и исследовательский грант не. 884/07 от Израиля Science Foundation (ISF), чтобы МГ

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluorescently labeled  Probes Metabion 20 bp HPLC purified Sequence designed by customer
Toluidine blue Sigma-Aldrich 89640
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771 Molecular Biology Grade
Formamide Sigma-Aldrich F9037 Molecular Biology Grade
Tris-HCl Sigma-Aldrich T5941 Molecular Biology Grade
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Molecular Biology Grade
Liquid Blocker Ted Pella Inc. 22309

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Czosnek, H., Laterrot, H. A worldwide survey of Tomato yellow leaf curl viruses. Arch. Virol. 142, 1391-1406 (1997).
  2. Ling, K. S., Simmons, A. M., Hassell, R. L., Keinath, A. P., Polston, J. E. First report of Tomato Yellow Leaf Curl Virus in South Carolina. Plant Dis. 90, 379 (2006).
  3. Polston, J. E., McGovern, R. J., Brown, L. G. Introduction of Tomato yellow leaf curl virus in Florida and implications for the spread of this and other geminiviruses of tomato. Plant Dis. 83, 984-988 (1999).
  4. Polston, J. E., Rosebrock, T. R., Sherwood, T., Creswell, T., Shoemaker, P. J. Appearance of Tomato yellow leaf curl virus in North Carolina. Plant Dis. 86, 73 (2002).
  5. Frohlich, D. R., Torres-Jerez, I., Bedford, I. D., Markham, P. G., Brown, J. K. A phylogeographical analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrial DNA markers. Mol. Ecol. 8, 1683-1691 (2002).
  6. Ghanim, M., Morin, S., Czosnek, H. Rate of Tomato yellow leaf curl virus translocation in the circulative transmission pathway of its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Phytopathology. 91, 188-196 (2001).
  7. Ghanim, M., Rosell, R. C., Campbell, L. R., Czosnek, H., Brown, J. K., Ullman, D. E. Digestive salivary and reproductive organs of Bemisia tabaci (Gennadius) Hemiptera: Aleyrodidae) B type. J. Morphol. 248, 22-40 (2001).
  8. Hunter, W. B., Hiebert, E., Webb, S. E., Tsai, J. K., Polston, J. E. Location of geminiviruses in the whitefly Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae). Plant Dis. 82, 1147-1151 (1998).
  9. Rosell, R. C., Torres-Jerez, I., Brown, J. K. Temporal pathway of geminivirus in whitefly extracts, saliva, hemolymph and honeydew. Phytopathology. 89, 239-246 (1999).
  10. Czosnek, H., Ghanim, M., Ghanim, M. The circulative pathway of begomoviruses in the whitefly vector Bemisia tabaci—insights from studies with Tomato yellow leaf curl virus. Ann. Appl. Biol. 140, 215-231 (2002).
  11. Gottlieb, Y., et al. The transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virusby the whitefly Bemisiatabaciis correlated with the presence of aspecificsymbiotic bacterium species. J. Virol. 84, 9310-9317 (2010).
  12. Brumin, M., Levy, M., Ghanim, M. Transovarial transmission of Rickettsia spp. and organ-specific infection of the whitefly Bemisia tabaci. Appl. Environ. Microbiol. 78, 5565-5574 (2012).
  13. Ghanim, M., Medina, V. Localization of Tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector Bemisia tabaci. In Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease, Management, Molecular Biology, Breeding for Resistance. Czosnek, H. Springer. New York. 175-187 (2007).
  14. Ghanim, M., Brumin, M., Popovski, S. A simple, rapid and inexpensive method for localization of Tomato yellow leaf curl virus and Potato leafroll virus in plant and insect vectors. J. Virol. Methods. 159, 311-314 (2009).
  15. Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. J. Virol. 86, 13241-13252 (2012).
  16. Nirgianaki, A., et al. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47, 93-101 (2003).
  17. Baumann, P. Biology of bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking insects. Ann. Rev. Microbiol. 59, 155-189 (2005).
  18. Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (Homoptera) Aleyrodidae). App. Environ. Microbiol. 72, 3646-3652 (2006).
  19. Li, Z. X., Lin, H. Z., Guo, X. P. Prevalence of Wolbachia infection in Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 54, 467-471 (2007).
  20. Skaljac, M., Zanic, K., Hrncic, S., Radonjic, S., Perovic, T., Ghanim, M. Diversity and localization of bacterial symbionts in three whitefly species (Hemiptera: Aleyrodidae) from the east coast of the Adriatic. Bull. Entomol. Res. 103, 48-59 (2013).
Флуоресценция<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизации (FISH) для локализации вирусов и эндосимбиотических бактерий в растений и насекомых тканей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kliot, A., Kontsedalov, S., Lebedev, G., Brumin, M., Cathrin, P. B., Marubayashi, J. M., Skaljac, M., Belausov, E., Czosnek, H., Ghanim, M. Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030, doi:10.3791/51030 (2014).More

Kliot, A., Kontsedalov, S., Lebedev, G., Brumin, M., Cathrin, P. B., Marubayashi, J. M., Skaljac, M., Belausov, E., Czosnek, H., Ghanim, M. Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030, doi:10.3791/51030 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter