Summary
Se describe aquí un fluorescencia simple en la hibridación in situ (FISH) método para la localización de virus y bacterias en los tejidos de insectos y plantas. Este protocolo se puede ampliar para la visualización de mRNA en todo el montaje y secciones microscópicas.
Abstract
Fluorescencia de hibridación in situ (FISH) es un nombre dado a una variedad de técnicas comúnmente usadas para la visualización de las transcripciones de genes en células eucarióticas y se pueden modificar adicionalmente para visualizar otros componentes en la célula tales como la infección por virus y bacterias. Localización espacial y la visualización de los virus y bacterias durante el proceso de infección es un paso esencial que se complementa con los experimentos de perfiles de expresión como los microarrays y RNAseq en respuesta a diferentes estímulos. La comprensión de las infecciones espacio-temporales con estos agentes complementa experimentos biológicos destinados a la comprensión de su interacción con los componentes celulares. Varias técnicas para la visualización de virus y bacterias tales como sistemas de genes informadores o métodos inmunohistoquímicos son mucho tiempo, y algunos se limitan a trabajar con organismos modelo e implicar metodologías complejas. FISH que se dirige a especies de ARN o de ADN en la célula es una me relativamente fácil y rápidoDTO para el estudio de la localización espacio-temporal de los genes y para fines de diagnóstico. Este método puede ser robusto y relativamente fácil de implementar cuando los protocolos de hibridación emplean corto, sondas comercialmente comprados-, que no son caros. Esto es particularmente robusta cuando preparación de la muestra, la fijación, la hibridación, y la visualización microscópica no implican pasos complejos. Aquí se describe un protocolo para la localización de las bacterias y los virus en los tejidos de insectos y plantas. El método se basa en una preparación simple, la fijación, y la hibridación de montajes completos de insectos y órganos diseccionados o secciones de plantas hechas a mano, con 20 pares de bases de las sondas de ADN cortos conjugados con tintes fluorescentes en sus 5 'o 3'. Este protocolo se ha aplicado con éxito a un número de tejidos de insectos y plantas, y puede ser utilizado para analizar la expresión de ARNm o de otras especies de ARN o ADN en la célula.
Introduction
Cuando el estudio de las interacciones entre los virus de plantas y otros patógenos con sus huéspedes vegetales infectados, es importante visualizar los patógenos y sus respectivos ácidos nucleicos in situ, sin tener en cuenta si causan efectos negativos en sus anfitriones. Esto es más importante cuando se estudia el movimiento del patógeno dentro y entre las células de la planta. En localización in situ de productos de los genes del patógeno es un paso esencial que complementa otros enfoques para estudiar el proceso de patogenicidad. Muchos patógenos de las plantas, especialmente virus, son transmitidas por insectos, tener interacciones complejas e íntimas con sus vectores. La localización de estos virus en sus vectores es importante para el estudio de la ruta de acceso para la transmisión, y los posibles sitios de interacción dentro del vector. La transmisión de algunos virus de plantas por insectos es ayudado por las bacterias endosimbiontes que residen dentro de estos insectos. Para estudiar mejor la transmisión de estos virus de plantas by sus vectores, sino que también es esencial para visualizar las bacterias endosimbiontes en general, y los que participan en la transmisión del virus, en particular. Colocalización de los virus bacterias y endosymbiotic este modo deseado para investigar las posibles relaciones entre estos organismos dentro de su insecto hospedador. Aparte de la transmisión del virus, bacterias endosymbiotic influyen varios aspectos de la biología de los vectores de insectos, por lo tanto la localización espacial de estas bacterias dentro de insectos es de gran interés e importancia.
Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae) es el complejo de la enfermedad viral más importante del tomate cultivado en todo el mundo 1-4. TYLCV es un virus floema limitado y recibe guía vectorial exclusivamente por la mosca blanca Bemisia tabaci 5,6. Un modelo que describe la translocación de begomovirus en sus vectores de mosca blanca se ha propuesto 6-9. Dos barreras específicas se cruzan de forma activa duranteing esta transmisión circulativa: el intestino medio / hemolinfa y las barreras de la glándula hemolinfa / salivales. Este proceso de transmisión se planteó la hipótesis de que es mediado por los receptores desconocidos que reconocen la cápside del virus. TYLCV se piensa para cruzar B. tabaci intestino medio de 6,10, y se absorbe a través de la glándula salival primaria 6 antes de que se inyecta en la planta. En la hemolinfa de la mosca blanca, TYLCV interactúa con una proteína GroEL producida por la bacteria endosimbiótica secundaria insecto Hamiltonella. Esta interacción garantiza un transporte seguro del TYLCV en la hemolinfa, y lo protege del ataque por el sistema inmune de insectos 11. Hamiltonella y Portiera, la endosymbiont primaria de la mosca blanca, se alojan en bacteriocytes, células de insectos que se encuentran en la hemolinfa y la casa endosymbiotic bacterias 11. B. tabaci alberga bacterias endosimbiontes adicionales como Rickettsia, Arsenophonus, Wolbachia, y Fritschea, que pueden ser localizados dentro o fuera de los bacteriocytes, y tienen diversos efectos sobre la biología del insecto 12.
Varios informes han intentado estudiar la localización del TYLCV en plantas y moscas blancas mediante el uso de protocolos consumen mucho tiempo y costosos tales como Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM), anticuerpos y ARN in situ sobre la sección de espesor microscópico 10,13, un estudio reciente describió la localización de virus de plantas dentro de sus plantas hospederas y vectoriales usando un simple protocolo 14. Aquí se describe un protocolo sencillo para la localización de TYLCV en B. tabaci diseccionó midguts y las glándulas salivales, y en las secciones prepara a partir de plantas infectadas por el virus de la cuchara. Se describe además la localización de Portiera, el endosymbiont principal de B. tabaci, y sus endosimbiontes secundarios Hamitonella, Rickettsia y Arsenophonus. Este protocolo se basa en el uso de sondas de ADN cortos, quese etiqueta fluorescente en su extremo 5 ', y hibridarse específicamente a secuencias complementarias en las secuencias de genes virales o bacterianas. El procesamiento de la muestra es relativamente fácil y la señal obtenida es altamente específico. El protocolo descrito se puede utilizar para localizar virus, bacterias y otros patógenos en sus huéspedes vegetales, animales y de insectos, y se puede usar además para localizar ARNm en cualquier tejido dado.
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Protocol
1. General de la Mosca Blanca, planta y virus Preparativos para el análisis FISH
- B y Q trasero mosca blanca biotipo sobre plántulas de algodón (Gossypium hirsutum L. cv. Acala) y mantener el interior de las jaulas a prueba de insectos y cámaras de crecimiento en condiciones estándar de 25 ± 2 ° C, humedad relativa del 60%, y una luz de 14 horas / 10-hr fotoperíodo oscuro.
- Realizar PCR para probar la infección con endosimbiontes utilizando primers específicos endosimbiontes como se describió previamente 15-19.
- Compra plántulas de tomate (Solanum esculentum cv. Beefsteak) de un vivero comercial o semillas de tomate de la planta.
- Mantener en las mismas condiciones de cría descritas anteriormente hasta que las plantas alcanzan la etapa de cuatro hoja verdadera, la edad más adecuada para la inoculación mosca blanca-mediada de TYLCV 15 (véase la sección 4.1 más adelante).
2. Manejo de Insectos, Fijación, Sonda Diseño, hibridación y visualización de EndoFISH simbionte
- Recoge 10 moscas blancas adultas mediante aspiración de plantas de algodón, o recoger 10 3 ª o 4 ª ninfas de las hojas de algodón.
- Sumerja inmediatamente en fijador de Carnoy (ácido cloroformo-etanol-acético glacial, 06:03:01, vol / vol) en el interior de tubos de Eppendorf. Fijar durante 2 horas a toda la noche (preferiblemente durante la noche).
- Eliminar completamente el fijador y decolorar en 6% de H 2 O 2 en etanol durante 2 horas.
- Conservar las muestras en etanol absoluto durante varios días a varias semanas a temperatura ambiente, o proceder con el siguiente paso.
- Sondas diseñar cebadores de ADN inversa como complementarios basados en los 16s genes de ARN ribosomal de cada bacteria. Para el diseño de las sondas, tener en cuenta las mismas consideraciones para el diseño de cebadores de PCR. Utilice las sondas de oligonucleótidos BTP1 5'-Cy5-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3 ', 5'-Rb1 Cy3-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3', 5'-BTH-Cy3 CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3 'y 5'-ARS2 cy3-TCATGACCACAACCTCCAAA-3 'para la orientación específica de Portiera, Rickettsia, Hamilonella y Arsenophonus, respectivamente.
- Hibridar muestras durante la noche en la oscuridad en tampón de hibridación (20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 0,9 M, 0,01% [/ vol en peso] de sodio dodecil sulfato, 30% [vol / vol] formamida) que contiene 10 pmol de sonda fluorescente por ml . Combinar más de una sonda con diferentes colorantes fluorescentes si es necesario. Utilice la mosca blanca no infectados con la bacteria específica y muestras sin sonda como controles negativos.
- Montar las muestras de conjunto, en un portaobjetos, en tampón de hibridación que figura con un bloqueador de líquido, cúbralo con una hoja de cubierta, sellar con esmalte de uñas, y la vista bajo una fluorescencia o un microscopio confocal.
3. Mosca Blanca Organ Disección, fijación, hibridación y visualización para FISH TYLCV
- Recoger las moscas blancas adultas han criado permanentemente en plantas de tomate infectadas con virus de la cuchara por aspiración y anesthetize por la exposición a una toalla de papel impregnada con acetona. Exponga las moscas blancas sólo durante 1-2 minutos como mucho tiempo de exposición a la acetona puede arreglar tejidos moscas blancas. Utilice la mosca blanca nonviruliferous criados en plantas de tomate infectadas y no hay muestras de la sonda para los controles para confirmar la hibridación específica.
- Mount moscas blancas en microscopio diapositivas de la depresión para la disección de órganos utilizando un microscopio estereoscópico.
- Extraiga la cabeza del insecto del protórax y diseccionar las glándulas salivales en 1x PBS suplementado con 1% de azul de toluidina mancha para una mejor visualización, debido a su pequeño tamaño. Permitir la absorción de la mancha durante 2-3 min.
- Tire del insecto aparte en la unión entre el tórax y el abdomen para observar y expulsar el intestino medio. Expulsar a los contenidos del abdomen, empujando con pinzas en la punta del abdomen.
- Retire suavemente el PBS y el azul de toluidina de disecciones de éxito y agregar suavemente 300 l de fijador de Carnoy para fijar los órganos durante 5 min.
- Ladd fijador de un lado del pozo depresivo y no de arriba para evitar el movimiento incontrolado de los órganos diseccionados. Una vez tocar el fijador, los órganos se adhieren al vidrio, y durante todo el proceso que no se muevan.
- Eliminar fijador y añadir 500 l de tampón de hibridación suplementado con 10 pmol de la sonda de ADN fluorescente Cy5-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 ', que es complementaria a una secuencia en el gen de TYLCV proteína de la cubierta.
- Hibridar durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad incubando el portaobjetos con la muestra en el interior una pequeña cámara húmeda compuesta de pequeña caja de plástico con papel toalla mojada en la parte inferior.
- Después de la hibridación, recoger a los órganos con una herramienta de disección fina y rápidamente moverlos a un portaobjetos de microscopio fresco que contiene 30 l de tampón de hibridación nueva suplementadas con DAPI (0,1 mg / ml en PBS 1x) y contenidos con bloqueador de líquido.
- Cubra las muestras con una hoja de cubierta, sellar el ingenioesmalte de uñas y la vista h bajo una fluorescencia o un microscopio confocal.
4. Manejo de Plantas, Mano-seccionamiento, Fijación, e hibridación para FISH TYLCV
- Se inoculan las plántulas de tomate con TYLCV usando viruliferous inoculación mosca blanca mediada. El virus puede ser detectado utilizando este método FISH en plantas asintomáticas una semana después de la inoculación. Los síntomas típicos de la enfermedad son visibles tres semanas después de la inoculación. Utilice plantas de tomate no infectados y no hay muestras de la sonda para los controles para confirmar la hibridación específica.
- Utilice una hoja de afeitar afilada histológico para preparar 2-4 secciones largas cm cortadas a mano longitudinales o transversales de tomate tallos y hojas.
- En tubos Eppendorf, fijar las secciones en fijador de Carnoy durante 2 horas a toda la noche a temperatura ambiente.
- Quite el fijador y preservar las secciones en etanol absoluto durante varios días a varias semanas a temperatura ambiente, o proceder con el siguiente paso.
- Lavar las seccionestres veces, 1 min cada uno, en tampón de hibridación.
- Hibridar las secciones con 500 l de tampón de hibridación suplementado con 10 pmol de la sonda de oligonucleótido fluorescente Cy3-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 'que es complementaria a una secuencia en el gen de TYLCV proteína de la cubierta.
- Lávese las secciones tres veces, 1 min cada uno, en tampón de hibridación.
- Mount secciones enteras en tampón de hibridación suplementadas con DAPI (0,1 mg / ml en PBS 1x) y contenidos con bloqueador de líquido, cubrir con un cubreobjetos, sellar con esmalte de uñas y la vista bajo una fluorescencia o un microscopio confocal.
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Representative Results
El sistema estudiado en este manuscrito se muestra en la Figura 1 e incluye una planta infectada con virus de la cuchara, un adulto y una ninfa de la mosca blanca B. tabaci, y la anatomía interna de la mosca blanca que muestra la trayectoria de la translocación TYLCV en el insecto. Figura 2 muestra dos peces en un mosca blanca adulta para el simbionte primario Portiera y el simbionte secundaria. Arsenophonus Figura 3 muestra doble FISH para Portiera y Hamiltonella y La figura 4 muestra el doble FISH para Portiera y Rickettsia, ambas cifras en B. tabaci 4 º estadio ninfa. Figura 5 muestra FISH para TYLCV y tinción DAPI en una mosca blanca diseccionado intestino medio, y la Figura 6 muestra un pez de TYLCV y tinción DAPI en un glándulas salivales de la mosca blanca primarios disecados. Figura 7 muestra FISH para TYLCV y tinción DAPI encortadas a mano secciones de la planta TYLCV infectadas.
Figura 1. Visión general del sistema estudiado en este manuscrito. A) Los síntomas típicos de la enfermedad causada por la infección con Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV). B) Vista exterior de una mosca blanca adulta. C) Vista externa de la etapa de ninfa 4 ª en el ciclo de vida de desarrollo de la mosca blanca. Otros estados ninfales son similares en la vista externa general, pero de menor tamaño. D) Vista esquemática de la anatomía interna de un adulto B. tabaci que muestra el camino de la adquisición TYLCV de los elementos de criba de plantas, la circulación y la transmisión (flechas negras). Partículas rojas se refieren a viriones TYLCV. p: floema; s: s tylet; e: esófago, fc: cámara de filtración; dm: descendente del intestino medio; soy: ascendente intestino medio; ca: ciegos; hg: intestino grueso; bc: bacteriocytes; psg:. glándula salival primaria clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 2. Doble FISH de Portiera y Arsenphonus en B. tabaci biotipo Q adulto (A) y el zoom en la zona marcada (B), tanto en virtud de canal de campo brillante y secciones ópticas combinadas de detección de las señales fluorescentes emitidas por cada sonda. sonda Portiera-específica (rojo) conjugado con Cy5 y sonda Arsenphonus-específica ( amarillo) conjugado con Cy3 fueron utilizados. e: huevo."target =" _blank pg "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 3. Doble FISH de Portiera y Hamiltonella en B. Se utilizaron tabaci ninfa. sonda Portiera específico (rojo) conjugado con Cy5 y la sonda Hamiltonella específica (verde) conjugado con Cy3. señal de hibridación A) Hamiltonella obtiene a partir de secciones ópticas combinadas y se observa bajo de campo oscuro. B) la señal de hibridación Portiera obtenida de combinado secciones ópticas y se observa bajo de campo oscuro. C) Portiera y Hamiltonella fusionaron señales de bajo campo claro. señales combinadas D) Portiera y Hamiltonella observe bajo dacampo rk. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 4. Doble FISH de Portiera y Rickettsia en B. Se utilizaron tabaci ninfa. sonda Portiera específico (rojo) conjugado con Cy5 y la sonda Rickettsia-específica (azul) conjugado con Cy3. A) señal de hibridación Rickettsia obtenida de secciones ópticas combinadas y se observa bajo de campo oscuro. B) la señal de hibridación Portiera obtenida de señales combinada secciones ópticas y se observa bajo de campo oscuro. C) Portiera y Rickettsia combinada en campo claro. D)
Figura 5. FISH de TYLCV en el intestino medio disecado de un adulto B. se utilizó femenino tabaci que habían contraído el virus durante 48 horas a partir de una planta de tomate infectado. sonda-TYLCV específico (rojo) conjugado con Cy3 y el intestino medio se tiñó con DAPI antes del montaje y visualización. A) El intestino medio diseccionado como se ve desde combinado secciones ópticas bajo campo claro. B) Señal de TYLCV FISH (rojo) y DAPI manchadas núcleos (azul) como se ve a partir de secciones ópticas combinada en campo oscuro. fc: cámara de filtración; dm: descendi ng intestino medio; soy: ascendente intestino medio; ca: ciegos; hg: intestino posterior. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 6. FISH de TYLCV en diseccionado glándula salival primaria de un adulto B. se utilizó femenino tabaci que habían contraído el virus durante 48 horas a partir de una planta de tomate infectado. sonda-TYLCV específico (rojo) conjugado con Cy3, y la glándula salival se tiñeron con DAPI antes del montaje y visualización. A) La saliva primario disecado y DAPI manchadas glándula, como se ve a partir de secciones combinadas bajo campo claro. B) Señal de FISH TYLCV (rojo) y núcleos teñidos DAPI (azul), como se ve a partir de secciones combinadas bajo de campo oscuro.s :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51030/51030fig6highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 7. FISH de TYLCV en sección longitudinal cortada a mano a través de un tallo de la planta infectada por el virus de la cuchara. Se utilizó la sonda TYLCV-específico (rojo) conjugado con Cy3 y combinado con tinción DAPI antes Una sección se muestra con rojo de montaje y visualización. A) señal de TYLCV en un elemento de tamiz floema, y los núcleos teñidos DAPI vistos desde secciones combinada en campo oscuro. B) Las mismas secciones combinadas muestran en (A) bajo campo claro para la orientación. ph: floema; xy:. xilema Haga clic aquí para ver la mayor imedad.
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Discussion
El protocolo descrito aquí para la localización de un virus de planta en su huésped de la planta y los insectos vectores, y las bacterias endosymbiotic en su huésped de la mosca blanca específica, se puede adaptar para la localización de otros virus en plantas e incluso en los tejidos animales. Además, el protocolo se puede utilizar para localizar bacterias endosymbiotic y patógenos y otros microorganismos en sistemas de plantas y animales. Los métodos descritos se basan en el concepto simple de la hibridación entre una sonda corto, marcado fluorescentemente-oligonucleótido de ADN y el ADN diana o molécula de ARN en la célula. El resultado es una hibridación específica, con el fondo mínimo, y una señal detectada usando fluorescencia o confocal microscopios. Varias sondas con diferentes colorantes fluorescentes, que se dirigen a más de un gen, se pueden utilizar simultáneamente. Esto permite visualizar más de un objetivo en una sola célula o tejido. Los procedimientos descritos en estos protocolos son simples y el tiempo de procesamiento de la muestraes mínimo. Los problemas asociados con otros protocolos como señal de alta fondo, largo tiempo de procesamiento para las muestras y el uso de numerosos y costosos materiales para el análisis, no son limitaciones en el protocolo descrito aquí.
Los B y Q biotipos de B. moscas blancas tabaci se utiliza para describir los protocolos en este manuscrito, sin embargo, las condiciones de cría se aplican a cualquier biotipo de mosca blanca, con su respectiva planta huésped. La mosca blanca completa su ciclo de vida en tres semanas bajo las condiciones indicadas. Cada individuo de la población biotipo B utilizado fue infectado con el endosymbiont primaria Portiera, y las bacterias endosimbiontes secundarios Hamiltonella y Rickettsia. Los individuos del biotipo Q se infectaron con Portiera y Arsenophonus. Mostraron Otras poblaciones de mosca blanca en todo el mundo que están infectados con estos u otras especies bacterianas endosymbiotic, y con diferentes LOCALIZACI espacialessobre los patrones en el 16-20 cuerpo.
Plantas infectadas TYLCV muestran síntomas de la enfermedad típica de tres semanas después de la inoculación. Para la localización de TYLCV, plantas sintomáticas se pueden utilizar para la adquisición de virus por moscas blancas durante 24 horas y el virus se pueden detectar en las plantas infectadas y los insectos utilizando el protocolo FISH se ha descrito anteriormente. Mientras que en los insectos las sondas utilizadas se pueden conjugar con muchos fluoróforo que puede escindió con diferentes longitudes de onda, incluyendo Cy3 y Cy5, Cy3 en las plantas es la más adecuada y no se muestra fluorescente en longitudes de onda similares a los cloroplastos, los más abundantes orgánulos en la célula de la planta.
La implementación exitosa de los protocolos descritos para la localización de las bacterias y los virus en las plantas y los insectos depende de la buena fijación de las muestras para una mejor visualización y penetración de la sonda, el buen diseño de la sonda de la especificidad y la limpieza con H 2 O 2 en el caso de los insectos enteros para bvisualización de señales Etter. En el caso de los peces en las plantas, secciones hechas a mano deben ser lo más fina posible para una buena penetración de la sonda y una mejor visualización de la señal. Esto se puede mejorar colocando la hoja entre dos piezas de espuma de poliestireno para ayudar con el corte y usando hojas de afeitar profesionales que se pueden comprar para este fin de varios vendedores.
El protocolo no es adecuado para la localización subcelular de objetivos, sin embargo, tiene el potencial de ser desarrollado, utilizando el formato de sonda de describir aquí, en un método adecuado para la localización subcelular. Por ejemplo, las sondas cortas descritos aquí se pueden conjugar con moléculas tales como biotina y moléculas no fluorescentes, que a su vez pueden ser dirigidos utilizando partículas de oro conjugadas con estreptavidina que se pueden visualizar bajo TEM. Esta modificación posterior puede ser adecuado para la localización subcelular de varios objetivos, incluyendo transcripciones de genes y microorganismos. Finalmente, el protocolo descritos son adecuados para la hibridación con ácidos nucleicos tales como ADN y ARN, pero no proteínas.
Para obtener los mejores resultados en los protocolos de FISH se describen aquí, lo mejor es usar insectos frescos y material vegetal, así como la adherencia y la hibridación buffers frescos. Las sondas deben mantenerse siempre en -20 º C en pequeñas alícuotas para evitar los ciclos de congelación y descongelación. El tiempo de procesamiento de cada etapa descrita puede ser calibrado en función de los organismos estudiados. Como se ha mencionado en el protocolo, después de la fijación y la decoloración, muestras de mosca blanca y de plantas se pueden conservar durante largo tiempo en etanol absoluto a temperatura ambiente. Este paso es particularmente útil cuando el envío de muestras para el procesamiento de un lugar a otro, o cuando se realizan experimentos de evolución a largo tiempo. La calidad de la señal de hibridación no fue afectada después de esta conservación a largo tiempo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
La investigación en el laboratorio de Ghanim fue apoyado por una beca de investigación no. 908-42.12/2006 de la Fundación alemana-israelí (GIF), concesión no. IS-4062-07 de la-Unidos Israel Fund Estados Binacional de Investigación Agrícola y Desarrollo (BARD), y la beca de investigación no. 884/07 de la Israel Science Foundation (ISF) de MG
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescently labeled Probes | Metabion | 20 bp HPLC purified | Sequence designed by customer |
| Toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | Molecular Biology Grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Liquid Blocker | Ted Pella Inc. | 22309 |
References
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